一種酶固定化方法及酶制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種黑曲霉脂肪酶固定化方法。使用納米四氧化三鐵材料為基材，通過仿生材料多巴胺自聚合成聚多巴胺將酶粘合在基材表面，從而得到固定化的酶制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)意義上固定化是指釆用物理或化學(xué)的方法將酶在空間上限制在一些水不溶性的載體周圍，限制其自由活動但是不影響生物催化劑的活性。傳統(tǒng)的固定化技術(shù)主要分為四種:吸附法、包埋法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法。通常吸附法和包埋法的固定化效率(小于40% )和酶活回收率較低(小于20% )，交聯(lián)法由于要加入交聯(lián)劑，酶活的損失比較大。隨著生物技術(shù)和材料科技的進步，固定化技術(shù)正面臨著一個非常重要的轉(zhuǎn)型。越來越多的新型材料用于酶的固定化，尤其是納米材料以其獨特的理化特性在固定化領(lǐng)域有著越來越重要的應(yīng)用。傳統(tǒng)的多孔材料無法進一步提高其負載量，是因為增加載體比表面積的同時不可避免的會減小微孔的直徑，從而降低其負載能力。而納米材料具有很大的比表面積，因此具有很好的負載能力。然而，這些載體的表面往往缺乏活潑的官能團不利于蛋白的結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種簡單的基于仿生粘合的固定化方法，形成了納米四氧化三鐵-聚多巴胺-黑曲霉脂肪酶胺三層結(jié)構(gòu)的固定化酶。具有固定化黑曲霉脂肪酶固定化效率高、酶活回收率高，操作簡便，條件溫和等特點。
[0004]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0005]一種酶固定化方法，包括如下步驟:
[0006](I)四氧化三鐵納米粒子分散在Tris-HCL的緩沖溶液中，配置成基材溶液；
[0007](2)將(I)中所得的基材溶液中加入鹽酸多巴胺，調(diào)pH為8.0到9.5，在室溫下震蕩I?90min，然后反復(fù)用去離子水沖洗，干燥；
[0008](3)將(2)所得到的材料在磷酸緩沖液中與酶進行震蕩固定化，固定化溫度為O?4°C，固定化時間I?12h ;
[0009](4)將(3)中所得的固定化酶冷凍干燥后即可。
[0010]步驟⑵中所述pH為8.5，步驟(3)中磷酸緩沖液的pH為8.0。
[0011]所述步驟(I)中的四氧化三鐵納米粒子是將四水合氯化亞鐵和六水合氯化鐵通過氨水共沉淀制得的。
[0012]所述四氧化三鐵納米粒子與多巴胺的質(zhì)量比為1: (0.5?5)。
[0013]所述步驟⑵、(3)中震蕩速率為100?500rpm。
[0014]所述步驟(2)中的酶為脂肪酶或蛋白酶。
[0015]所述脂肪酶為黑曲霉脂肪酶，黑曲霉脂肪酶為黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外產(chǎn)黑曲霉脂肪酶或細胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的發(fā)酵液。
[0016]上述方法制備的酶制劑，其適宜溫度為20?60°C，pH為6.5?9.0。
[0017]優(yōu)選地，該酶制劑的適宜溫度為35?50°C，pH為7.0?8.0。
[0018]本發(fā)明原理:通過四水合氯化亞鐵和六水合氯化鐵與氨水共沉淀能夠得到四氧化三鐵納米粒子，同時多巴胺在類似于海水的弱堿性(pH = 8.5)條件下，能夠自聚合形成聚多巴胺，聚多巴胺分子中的鄰苯二酚基團中的羥基能夠與鐵原子形成配位鍵，其作用力非常大，使得聚多巴胺分子能夠緊緊包裹在納米四氧化三鐵表面，同時聚多巴胺分子中的鄰苯二酚基團在堿性條件下極容易氧化成鄰苯二醌，從而能夠與酶分子中的氨基或者巰基發(fā)生反應(yīng)，將蛋白質(zhì)牢固“粘合”在四氧化三鐵納米粒子基體表面，實現(xiàn)了酶的固定化。
[0019]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點:
[0020](I)發(fā)明使用簡單的仿生粘合技術(shù)，在固定化酶過程中不使用戊二醛、甲醛等雙功能試劑，成本較低，反應(yīng)溫和，能夠較大程度保持酶活(60%?90% )，提高酶活回收率。
[0021](2)本發(fā)明通過聚多巴胺的修飾有效改善了天然載體對蛋白的粘附能力，酶的固定化效果更好。
[0022](3)本發(fā)明的固定化酶方法，能夠用于脂肪酶、蛋白酶等一系列含有豐富氨基或者巰基基團的酶，并具有作為蛋白質(zhì)藥物載體的潛質(zhì)。
【附圖說明】
[0023]圖1為實施例1中所得到的酶制劑在不同溫度之下的相對酶活曲線。
[0024]圖2為實施例1中所得到的酶制劑在不同PH下的相對酶活曲線。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0026]實施例1
[0027]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入37.5mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩lh，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液lml，冰浴的條件下固定12h，固定化酶效率為74.1%，酶活回收率為56.3%，該載體的負載量為134mg酶/g載體。
[0028]實施例2
[0029]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入30mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩lh，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的條件下固定12h,固定化酶效率為63.2%，酶活回收率為48.8%，該載體的負載量為114mg酶/g載體。
[0030]實施例3
[0031]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入45mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩lh，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的條件下固定12h,固定化酶效率為64.1%，酶活回收率為46.2%，該載體的負載量為115mg酶/g載體。
[0032]實施例4
[0033]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入45mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩30min，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的條件下固定12h，固定化酶效率為68.8%，酶活回收率為52.7%，該載體的負載量為124mg酶/g載體。
[0034]實施例5
[0035]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入45mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩1.5h，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的條件下固定12h，固定化酶效率為69.7%，酶活回收率為54.5%，該載體的負載量為126mg酶/g載體。
[0036]實施例6
[0037]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入45mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩1.5h，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液lml，冰浴的條件下固定9h,固定化酶效率為58.0%，酶活回收率為30.3%，該載體的負載量為105mg酶/g載體。
[0038]實施例7
[0039]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入45mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩1.5h，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的條件下固定10.5h,固定化酶效率為47.4%，酶活回收率為65.8%，該載體的負載量為119mg酶/g載體。
[0040]實施例8
[0041]將40mg納米四氧化三鐵分散在15mL pH 8.5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入45mg鹽酸多巴胺，用10mM氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在室溫下、速率200rpm下震蕩1.5h，洗滌后干燥得到載體材料。取載體材料8.3mg加入到pH = 8的磷酸緩沖液中，然后加入黑曲霉脂肪酶酶液1ml，冰浴的條件下固定18h，固定化酶效率為65.3%，酶活回收率為39.2%，該載體的負載量為71mg酶/g載體。
【主權(quán)項】
1.一種酶固定化方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)四氧化三鐵納米粒子分散在TriS-HCL的緩沖溶液中，配置成基材溶液； (2)將(I)中所得的基材溶液中加入鹽酸多巴胺，調(diào)pH為8.0到9.5，在室溫下震蕩I?90min，然后反復(fù)用去離子水沖洗，干燥； (3)將(2)所得到的材料在磷酸緩沖液中與酶進行震蕩固定化，固定化溫度為O?4°C，固定化時間I?12h ; (4)將(3)中所得的固定化酶冷凍干燥后即可。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述pH為8.5，步驟(3)中磷酸緩沖液的pH為8.0。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的四氧化三鐵納米粒子是將四水合氯化亞鐵和六水合氯化鐵通過氨水共沉淀制得的。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述四氧化三鐵納米粒子與多巴胺的質(zhì)量比為1: (0.5?5)。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)、(3)中震蕩速率為 100 ?500rpmo6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的酶為脂肪酶或蛋白酶。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶為黑曲霉脂肪酶，黑曲霉脂肪酶為黑曲霉脂肪酶酶粉、胞外產(chǎn)黑曲霉脂肪酶或細胞破壁后含黑曲霉脂肪酶的發(fā)酵液。8.根據(jù)權(quán)利要求1?6任意一項方法制備的酶制劑。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶制劑，其特征在于，該酶制劑的適宜溫度為20?60°C，pH為 6.5 ?9.0。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的酶制劑，其特征在于，該酶制劑的適宜溫度為35?50°C，pH為 7.0 ?8.0。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶固定化方法及酶制劑，包括如下步驟：(1)四氧化三鐵納米粒子分散在Tris-HCL的緩沖溶液中，配置成基材溶液；(2)將(1)中所得的基材溶液中加入鹽酸多巴胺，調(diào)pH為8.0到9.5，在室溫下震蕩1-90min，然后反復(fù)用去離子水沖洗，干燥；(3)將(2)所得到的材料在磷酸緩沖液中與酶進行震蕩固定化，固定化溫度為0～4℃，固定化時間1-12h；(4)將(3)中所得的固定化酶冷凍干燥后即可。本發(fā)明具有固定化黑曲霉脂肪酶固定化效率高、酶活回收率高，操作簡便，條件溫和等特點。
【IPC分類】C12N9/20, C12N11/08
【公開號】CN104894094
【申請?zhí)枴緾N201510250417
【發(fā)明人】婁文勇, 鄧嘯, 宗敏華, 曹詩林
【申請人】華南理工大學(xué)
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月15日