一種CpG寡核苷酸及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥基因診斷和基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種CpG寡核苷酸及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)研宄并闡明白血病等癌癥發(fā)病的原理和病因。癌癥發(fā)病有以下步 驟：1，致病基因 V-erbB突變/擴增；2,其調(diào)芐基因缺失/失活；3,癌變基因 TS擴增。骨髓 等組織干細(xì)胞從只有致病基因突變/擴增的癌前干細(xì)胞，發(fā)展為擁有致病基因和癌變基因 雙擴增的癌干細(xì)胞；4,癌干細(xì)胞表面多個生長因子受體與其微環(huán)境中多種生長因子間的互 動，推動癌干細(xì)胞集落向癌瘤發(fā)展；5,在轉(zhuǎn)化生長因子及其受體等因素介導(dǎo)下發(fā)生癌瘤細(xì) 胞侵潤和轉(zhuǎn)移，并形成新部位的癌瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種CpG寡核苷酸，強化反基因 V-erbB寡核苷酸的治療作 用，從而治療高危MDS和原位癌。
[0004] 本發(fā)明提供的CpG寡核苷酸，
[0005] 其序列如下：
[0006] 5 'GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3'
[0007] 反基因 V-erbB寡核苷酸則有如下序列：
[0008] 5' ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3'。
[0009] 進一步地，應(yīng)用含有上述序列的CpG寡核苷酸，經(jīng)硫代修飾后單獨或聯(lián)合反基因 V-erbB寡核苷酸制備成各種藥用劑型，用于白血病和腫瘤的治療。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的CpG寡核苷酸強化反基因 V-erbB寡核苷酸的治療作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明的使用適應(yīng)癥MDS疾病發(fā)展演進圖。
【具體實施方式】
[0012] 本發(fā)明實施例的CpG寡核苷酸，強化反基因 V-erbB寡核苷酸的治療作用，從而治 療高危MDS和原位癌；
[0013] 其序列如下：
[0014] 5 'GGC CGC CGC GAC CCC GCC 3'
[0015] 反基因 V-erbB寡核苷酸則有如下序列：
[0016] 5, ATG GCA GAG CTG GCA AAC 3，。
[0017] 本發(fā)明實施例，應(yīng)用含有上述序列的CpG寡核苷酸，經(jīng)硫代修飾后單獨或聯(lián)合反 基因 V-erbB寡核苷酸制備成各種藥用劑型，用于白血病和腫瘤的治療。
[0018] 實施例1 :本發(fā)明的CpG寡核苷酸在大鼠 MDS基因治療中的應(yīng)用。
[0019] 請參閱表3所示，聯(lián)合應(yīng)用兩種寡核苷酸治療MDS，顯效時間明顯縮短，從單用反 基因寡核苷酸治療后2-3月縮短為7-10天。甚至可治愈紅白血病。
[0020] 圖1為本發(fā)明使用適應(yīng)癥MDS疾病發(fā)展演進圖：本圖顯示MDS-RA發(fā)展白血病的過 程。難治性貧血（RA)可單獨用反基因 V-erbB寡核苷酸治療，而高危MDS則必須聯(lián)合CpG寡 核苷酸治療，急性白血病（AL)則用本研宄發(fā)明的晚期癌治療策略作治療。早期RA，則應(yīng)用 本研宄另一項發(fā)明的V-erbB PCR基因診斷試劑盒作癌前基因診斷，而后用反基因 V-erbB 寡核苷酸治療。其它腫瘤的早期診斷和治療原則上適用上述模式。
[0021] 一、動物模型：
[0022] 應(yīng)用二甲基苯蒽（DMBA)誘發(fā)Wistar大鼠 MDS。所用劑量為35mg/kg，每周1次， 共計3次，3-4個月后發(fā)生MDS或白血病，少數(shù)發(fā)生肉瘤。并證明它與人類MDS和白血病有 相同的C-erbB重排/擴增以及N-ras點突變。大鼠 MDS包括RA、RAEB和RAEBT三個亞型。 難治性貧血（RA)可發(fā)展為原始和早幼粒細(xì)胞增多的RA，即RAEB和轉(zhuǎn)化中的RAEB，即RAEBT 和白血?。ˋL)。主要依據(jù)大鼠股骨骨髓原始和早幼粒細(xì)胞百分比來判斷。采用大鼠 MDS進 行基因治療研宄，其突出優(yōu)點是大鼠可以在活體情況下作治療前后多次骨髓穿刺而不必殺 死動物。這是小鼠模型作不到的。
[0023] 二、給藥方法：
[0024] 1.尾靜脈注射：用3 %巴比妥鈉注射液0. 3-0. 5ml腹腔注射，將MDS大鼠麻醉以便 作尾靜脈注射。使用前用無菌生理鹽水溶解上述寡核苷酸粉針劑備用。劑量（D)為0. 56mg/ kg/天（IxD)或0· 28mg/kg/天（0· 5xD)。連續(xù)給藥3天為一個療程。2-3個月后作骨髓穿 刺，檢查骨髓象變化并觀察療效。觀察和診斷指標(biāo)參照人類MDS診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)進行。
[0025] 2. 口服給藥：根據(jù)MDS大鼠日平均飲水量，將反基因 V-erbB寡核苷酸溶解于自來 水中供其飲用，并照常喂養(yǎng)。劑量為〇.56mg/kg/天，連續(xù)飲用3天為一個療程。觀察和判 斷療效標(biāo)準(zhǔn)同上。
[0026] 三、結(jié)果
[0027] 1、尾靜脈注射給藥治療
[0028] 以IxD和0. 5xD兩個劑量治療17只大鼠 MDS，并以8只大鼠 MDS為空白對照。發(fā) 現(xiàn)在2-3個月觀察期內(nèi)，17只治療鼠骨髓原始和早幼粒細(xì)胞％均有下降（表1)，原始和早 幼粒細(xì)胞從平均9. 6%下降到3. 6% (P < 0. 01)。其中94. 1% (16/17)骨髓象恢復(fù)正?；?接近正常（表2)。治療觀察期動物體重平均增加98克，且生育能力完好?？瞻讓φ战M8只 MDS中，3只從RA發(fā)展為RAEB，4只死于內(nèi)臟出血，未見MDS逆轉(zhuǎn)為正常者。
[0029] 表1基因治療前后MDS大鼠骨髓形態(tài)觀察
[0030]
[0032] *這只大鼠觀察期間死于炎癥；**這只大鼠發(fā)生肉瘤并轉(zhuǎn)移到骨髓，A-4大鼠基因 治療后原始+早幼粒細(xì)胞百分比沒達到正常水平。
[0033] 2、口服給藥治療
[0034] 以1XD、0. 5XD和0. 25XD三種劑量分別對14只大鼠 MDS進行治療。在相同的 觀察期內(nèi)，僅IxD劑量組8只MDS有效，其余2個劑量組均無效，請結(jié)合圖1所示。
[0035] 3、復(fù)方韋爾柏反基因寡核苷酸治療：
[0036] 以上2種治療均以單方韋爾柏（V-erbB)反基因寡核苷酸進行治療。為了探討免 疫刺激劑即CpG寡核苷酸在治療中的作用，我們將上述兩種寡核苷酸聯(lián)合應(yīng)用，對3只大鼠 進行治療，其結(jié)果見表3。從表3可見，聯(lián)合應(yīng)用治療MDS，顯效時間明顯縮短。復(fù)方對MDS 和AEL有效，但對AML無效。
[0037] 表2 33只大鼠 MDS基因治療方案和結(jié)果
[0038]
[0039] *A組治療后8-12個月未見MDS復(fù)發(fā)或發(fā)展為白血病。
[0040] 表3復(fù)方韋爾柏注射液治療結(jié)果
[0041]
[0043] G =粒系E =紅系RAEB :原始細(xì)胞增多型RA(難治性貧血）
[0044] AEL :急性紅白血病、AML急性髓細(xì)胞白血病。AEL可發(fā)展為AML
[0045] 實施例2 :本發(fā)明的CpG寡核苷酸在高發(fā)區(qū)食管癌早期基因治療中的應(yīng)用：
[0046] -、病例：河北省磁縣食管癌高發(fā)區(qū)食管上皮非典型增生患者41例原位癌5例。 均為普查時可疑患者在內(nèi)規(guī)鏡下咬取組織經(jīng)食管碘染后病理確診。
[0047] 二、治療方法：非典型增生患者采用反基因 V-erbB寡核苷酸（ODN)治療（第一方 案），原位癌用反基因 V-erbB寡核苷酸（ODN)聯(lián)合CpG寡核苷酸治療（第二方案）。
[0048] 寡核苷酸的配制：每支EP管內(nèi)裝有ODN粉末10單位，-20C冷凍保存。使用之前 用1毫升無菌生理鹽水溶解備用。
[0049] 使用方法：于內(nèi)規(guī)鏡下向病變部位噴灑0. 3毫升，隔日1次，連續(xù)三次為一個療程。 治療之后2小時內(nèi)禁食禁飲。1-2個月后內(nèi)規(guī)鏡下復(fù)查，取用藥后病變部位上皮組織少許， 進行病理檢查和療效判斷。治療后5年復(fù)查，對每位患者行食管內(nèi)規(guī)鏡及病理檢查。療效 判斷標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)上將食管上皮分為正常，單純性增生，非典型增生（包括輕度，中度和重 度增生3種），原位癌和侵潤癌?；颊哂盟幒笥芍卸然蛑囟仍錾孓D(zhuǎn)為輕度增生后正常者為 有效，保持不變者為無效。從中度重度增生轉(zhuǎn)為原位癌者為癌性進展。
[0050] 三、治療效果：41例食管非典型增生患者，應(yīng)用第一方案治療，33例有效，有效率 80. 5%，8例無效，其中癌性進展1例。與此同時應(yīng)用第二方案治療5例原位癌，3例有效， 轉(zhuǎn)為重度增生，輕度增生，輕度食管炎各一例。1-2個月后第一次隨訪，非典型增生患者僅 兩例復(fù)發(fā)。表明一個療程治療，多數(shù)患者療效鞏固。治療后5年復(fù)查結(jié)果，41例非典型增 生患者返回醫(yī)院接受復(fù)查19例。經(jīng)過治療重中度增生患者由原來15例減為3例，有效率 80% (12/15)，與治療后1-2個月復(fù)查結(jié)果相同；無重度增生者。19例中已有16例趨于正 常。因其治療已過5年，故而認(rèn)定為疫愈，疫愈率84. 2%。原位癌治療4例2例有效。復(fù)查 中發(fā)現(xiàn)1例原來診斷有誤，應(yīng)診斷為原位癌且療效明顯，現(xiàn)在診斷為輕度食管炎，說明其原 位癌已痊愈。因此，原位癌有效率為60%。
[0051] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，對發(fā)明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。 本專業(yè)技術(shù)人員理解，在發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改， 甚至等效，但都將落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種CpG寡核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，其與反基因V-erbB寡核苷酸配合，強化后者 的治療作用，從而有效治療高危MDS和原位癌； 其序列如下： 5'GGCCGCCGCGACCCCGCC3' 反基因V-erbB寡核苷酸則有如下序列： 5'ATGGCAGAGCTGGCAAAC3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CpG寡核苷酸的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用含有上述序列的CpG 寡核苷酸，經(jīng)硫代修飾后單獨或聯(lián)合反基因V-erbB寡核苷酸制備成各種藥用劑型，用于白 血病和腫瘤的治療。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種CpG寡核苷酸及其應(yīng)用，將其與反基因V-erbB寡核苷酸聯(lián)合應(yīng)用，能強化后者的治療作用，從而有效治療高危MDS和原位癌。
【IPC分類】C12N15/117, A61P35/02, A61K31/7088, A61K48/00, A61P35/00
【公開號】CN104928296
【申請?zhí)枴緾N201510076090
【發(fā)明人】馮寶章
【申請人】馮寶章
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年2月13日