花椰菜毛花性狀鑒定的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及花椰菜毛花性狀鑒定技術(shù)，具體地說是利用分子標(biāo)記的方法鑒定花椰菜毛花技術(shù)的建立方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]花椰菜是以花球?yàn)槭秤闷鞴俚氖卟?，花球質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到產(chǎn)值的高低，近年來在上海、浙江、安徽等省(市)連續(xù)發(fā)生早熟花椰菜毛花現(xiàn)象，損失嚴(yán)重。故開展花椰菜毛花性狀研究，選育耐毛花的花椰菜品種，不僅可以幫助廣大菜農(nóng)免受不必要的損失，還可以減少由于災(zāi)害天氣引起的市場波動(dòng)，滿足市場對(duì)花椰菜外觀品質(zhì)的要求；
但是在制種過程中由于父母本本身具有一些缺點(diǎn)，造成花椰菜雜種一代會(huì)有一些來自父母本的缺點(diǎn)被遺傳下來。如，花椰菜毛花。傳統(tǒng)的大田鑒定法以種子、幼苗、葉、花、果實(shí)、花粉等組織器官的顏色、形態(tài)等農(nóng)藝性狀作為鑒定的觀測指標(biāo)，在生產(chǎn)實(shí)踐中雖然是一種較為可行的方法，但大田鑒定需要額外占用土地，周期長、花費(fèi)大，不僅受季節(jié)限制，而且很多性狀的表現(xiàn)受栽培措施及環(huán)境因子的影響，鑒定者的觀察經(jīng)驗(yàn)也制約著鑒定的準(zhǔn)確性。故，如何能在短時(shí)間內(nèi)鑒定花椰菜是否具有毛花性狀已成為花椰菜育種的重要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種花椰菜雜毛花性狀的鑒定方法和應(yīng)用；
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的:
本發(fā)明利用RAro對(duì)花椰菜毛花性狀的特異性進(jìn)行分子標(biāo)記，可以在苗期就對(duì)花椰菜是否具有毛花性狀進(jìn)行鑒定，進(jìn)而縮短了花椰菜耐毛花育種的時(shí)間；
本發(fā)明的分子標(biāo)記的引物為上海生工提供，RAro擴(kuò)增采用的引物為S76，所說的花椰菜為適合該專利的研究目標(biāo)的親本材料及其F2代，具有；
花椰菜分子標(biāo)記鑒定毛花性狀的建立方法，包括如下步驟:
1)提取及純化花椰菜基因組的DNA；
2)用獲得的花椰菜DNA為模板進(jìn)行RAPD分析；
3)選擇有代表性的多態(tài)性擴(kuò)增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無進(jìn)行分子標(biāo)記；
4)選擇具有毛花性狀的花椰菜DNA進(jìn)行驗(yàn)證；
本發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)可以用在花椰菜毛花性狀的鑒定；
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明公開了用分子標(biāo)記的方法對(duì)花椰菜毛花性狀進(jìn)行鑒定，高效、準(zhǔn)確、可靠；
2、由于本發(fā)明采用分子標(biāo)記技術(shù)，便于計(jì)算機(jī)識(shí)讀和分析。
[0004]【附圖說明】:
附圖為本發(fā)明利用分子標(biāo)記的方法對(duì)具毛花性狀及非毛花形狀花椰菜進(jìn)行的擴(kuò)增電泳圖；
注:圖1:為76號(hào)引物篩選瓊脂糖電泳結(jié)果；圖2為利用該方法驗(yàn)證毛花植株的瓊脂糖電泳結(jié)果。
[0005]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1
本實(shí)施例采用SDS法提取花椰菜及其親本的基因組DNA，通過RAPD、分子標(biāo)記方法對(duì)花椰菜毛花性狀進(jìn)行鑒定。具體操作如下:
1、選用的試驗(yàn)材料:
材料為適合該專利的研究目標(biāo)親本材料及其F2代；
2、花椰菜DNA的提取及純化:
按如下程序提取各個(gè)花椰菜材料的基因組DNA:
取新鮮組織2g，在液氮中研磨成粉，置于50 ml離心管，加入8 ml提取液(100 mM TrispH 8.0,50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1.5% SDS)，65°C情況下 30 分鐘，不時(shí)顛倒混勻，加 2.5ml 5M乙酸鉀冰浴10分鐘,加.5 ml氯仿,顛倒混勻，1000rmp離心8分鐘,取上清移入新管，加2 / 3體積預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻，_20°C置1-2小時(shí)，挑出絮狀白色DNA，70%乙醇洗1-2次，吹干，溶于10ul (或適量)TE中，并在I %瓊脂糖凝膠上電泳，用標(biāo)準(zhǔn)λ DNA作對(duì)照，估算花椰菜DNA樣品的濃度，獲得高純度花椰菜DNA ；
3、用獲得的高純度花椰菜DNA為模板進(jìn)行分子標(biāo)記分析:
RAI3D擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μ L的反應(yīng)體系，其中25mmol/L MgCl2 2.0 μ I，10XPCRBuffer 2.0μ 1,10 mmol/L dNTP 0.5 μ l,5U/y I Taq E 0.2 μ 1，0.1 μ mol/L 引物 3μ1，1ng/ μ I模板DNA 3 μ 1，滅菌雙蒸水9.3 μ I。擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性Imin，37°C退火 I min，72°C延伸 1.5 min，40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min 后 4°C保存。PCR 產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳1.5h，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝膠成像儀進(jìn)行觀察并拍照分析；
4、引物篩選:
使用150個(gè)RAPD引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中有118個(gè)RAPD能擴(kuò)增出清晰的條帶，但大多數(shù)引物的擴(kuò)增結(jié)果在雙親及雜交種之間是一致的，不能起到鑒別的作用。最終篩選出I個(gè)RAH)引物(S76)可以將“Al”區(qū)(具毛花性狀的花椰菜)和A2 (不具毛花性狀的花椰菜)分開。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.花椰菜DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提取及純化花椰菜基因組的DNA； 2)用獲得的花椰菜DNA為模板進(jìn)行RAPD分析； 3)選擇有代表性的多態(tài)性擴(kuò)增條帶，根據(jù)所選擇條帶的有、無進(jìn)行花椰菜毛花性狀的分子標(biāo)記。2.權(quán)利要求2所述的方法所用的引物核苷酸序列為:(CCTGGTGACAGAGTGAAACCCTGCCTCTAGAAAAAAAGAAAAGAAAAAAGAAAAAAAAATTCAGTCTCAGTATCCTGGCATATGTCATTATATTGAATATTTTATATATTCTATGACATTTATAAATTTTCCAGTAGACATTTACTGGAGATCAATGCTCTGTAACCATTTCTTTTACCATATATTTTTCCTATCTTTACTTAAACCACTTACCCAGATCCATTATTACTGATTTTCAGTAAAAGAGGGATGTGAAGTCACACATACATGTGCACACACACACGTGCACACACACACATACACACACGCACTAGAAAACATCCTGGGAATGATGGTTTCAAATAACTCTTACATTTTGCATATTACATCAAAATGGCTATCCAGAGCTTTACTAC)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定花椰菜毛花性狀的方法和應(yīng)用。建立方法包括：1、花椰菜DNA的提取及純化；2、用獲得的高純度花椰菜DNA為模板進(jìn)行RAPD分子標(biāo)記；3、對(duì)已篩選出的特異引物進(jìn)行群體實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明可應(yīng)用于花椰菜毛花性狀的鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，檢測迅速。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN104946732
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410124590
【發(fā)明人】薄天岳, 邰翔, 陳錦繡, 任云英
【申請(qǐng)人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 上?？茍@種子有限公司, 上?？屏⑻剞r(nóng)科（集團(tuán)）有限公司
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月31日