細(xì)胞色素p450_3a4酶的特異性探針底物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及寡糖酯類化合物Tenuifoliside A，其可作為細(xì) 胞色素 P4503A4酶的特異性探針底物，用于不同來(lái)源生物樣本中細(xì)胞色素 P4503A4酶活性 的定量測(cè)定，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)重要藥物代謝酶CYP3A4處置藥物能力的評(píng)估。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞色素 P450酶（Cytochrome P450, CYP)超家族包含了機(jī)體內(nèi)最重要的藥物 代謝酶，參與約80%以上上市藥物的代謝，其中經(jīng)細(xì)胞色素 P4503A亞家族代謝的藥物約 占50%。人體中表達(dá)了四種細(xì)胞色素 P4503A亞型，分別為細(xì)胞色素 P4503A4、P4503A5、 P4503A7以及P4503A43。細(xì)胞色素 P4503A4占總細(xì)胞色素 P450酶含量的30~60 % (Hukkanen，et al.，1998)，在肝、腸、腎、脾、心臟各器官中有非常廣泛的分布，相比于人群 中表達(dá)量低、表達(dá)頻率低的細(xì)胞色素 P4503A5, 一直被認(rèn)為是成年個(gè)體表達(dá)的最主要的細(xì)胞 色素 P4503A單酶。一般來(lái)講，CYP3A亞家族中的各種亞型的酶都具有相似的底物具體性， 也就是說(shuō)，某一底物若被CYP3A4催化代謝，那么這一底物就極可能同時(shí)被CYP3A5及其它 CYP3A家族的酶代謝。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的或已在體外、體內(nèi)研究中廣泛應(yīng)用的CYP3A亞家族 探針底物，如咪達(dá)唑侖（midazolam)、尼非地平（nifedipine)、睪酮（testosterone)、雌二 醇（estradiol)等，都同時(shí)是CYP3A4和CYP3A5的特異性底物。相對(duì)應(yīng)的，利用這些探針底 物對(duì)細(xì)胞色素 P450酶進(jìn)行的評(píng)估結(jié)果反映的就是細(xì)胞色素 P4503A亞家族各單酶的催化 能力的總和。然而，近期的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素 P4503A5在某些個(gè)體中顯現(xiàn)的催化能力甚至 與細(xì)胞色素 P4503A4的催化能力相當(dāng)（Williams，et. al.，2002)，此時(shí)利用目前已有的探針 則會(huì)混淆細(xì)胞色素 P4503A4和3A5的催化能力，從而無(wú)法清晰地分析細(xì)胞色素 P4503A4對(duì) 某藥物的代謝清除能力。
[0003] 此外，在鼠（細(xì)胞色素 P4503A1、細(xì)胞色素 P4503A2)、狗（細(xì)胞色素 P4503A12、 細(xì)胞色素 P4503A26)，兔（細(xì)胞色素 P4503A6)，豬（細(xì)胞色素 P4503A29)，猴（細(xì)胞色素 P4503A64)等哺乳動(dòng)物體內(nèi)，也高表達(dá)細(xì)胞色素 P4503A4的同功酶，這些酶之間的底物有非 常廣泛的重疊性。利用細(xì)胞色素 P4503A4的高特異性探針也可在體外活性測(cè)定方面實(shí)現(xiàn)對(duì) 不同種屬中細(xì)胞色素 P4503A4的同功酶的評(píng)價(jià)與考察。
[0004] 目前，細(xì)胞色素 P4503A4酶活性的體外評(píng)價(jià)體系主要包括重組單酶、哺乳動(dòng)物 的亞細(xì)胞組分、新鮮提取的肝細(xì)胞、原代培養(yǎng)肝細(xì)胞、肝切片、肝灌流等（Toxicology in Vitro2006,135-153)，其中已經(jīng)商品化的重組細(xì)胞色素 P4503A4單酶主要來(lái)自于細(xì)菌、昆 蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及酵母菌建立的克隆表達(dá)體系，而亞細(xì)胞組分主要包括微粒體、細(xì) 胞胞漿及S9成分。采用這些標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)價(jià)體系，結(jié)合相應(yīng)的輔因子（如：NADPH等）和孵 育條件，可通過(guò)檢測(cè)探針底物的代謝清除或產(chǎn)物生成速率，對(duì)上述各種體系中表達(dá)的細(xì)胞 色素 P4503A4酶活性進(jìn)行表征。余琢等人還利用肝微量穿刺法構(gòu)建了新型微量肝組織體外 孵育體系，并采用咪達(dá)唑侖作為探針底物，通過(guò)測(cè)定咪達(dá)唑侖與其代謝產(chǎn)物1-羥基咪達(dá)唑 侖含量的比值，來(lái)作為細(xì)胞色素 P4503A體外活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。
[0005] 綜上所述，評(píng)估細(xì)胞色素 P4503A4代謝酶活性，關(guān)鍵在于選擇高特異性的探針?biāo)?物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一個(gè)寡糖酯類化合物Tenuifoliside A，在檢測(cè)細(xì)胞色素 P4503A4酶 活性中的用途及其檢測(cè)方法，可作為細(xì)胞色素 P4503A4酶的高特異性探針底物，用于定量 測(cè)定不同來(lái)源生物樣本中CYP3A4酶活。與目前已報(bào)道的細(xì)胞色素 P4503A探針/標(biāo)準(zhǔn)底 物不同，Tenuifoliside A具有高特異性表征細(xì)胞色素 P4503A4酶活性的能力，其并不被 CYP3A5催化。因此能夠高特異性的評(píng)價(jià)機(jī)體或組織中CYP3A4酶對(duì)藥物的處置能力，對(duì)體外 藥物代謝研究具有重要意義。
[0007] Tenuifoliside A是一種寡糖酯類成分。該化合物具有圖1所示基本結(jié)構(gòu)。
[0008] 本發(fā)明提供了化合物Tenuifoliside A檢測(cè)細(xì)胞色素 P4503A4酶活性的用途，其 特征在于：Tenuifoliside A作為特異性探針底物，通過(guò)定量定時(shí)測(cè)定相應(yīng)代謝產(chǎn)物的生成 量或底物的減少量實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素 P4503A4酶活性的檢測(cè)。
[0009] 采用重組細(xì)胞色素 P450單酶，肝微粒體孵育體系進(jìn)行考察，通過(guò)相關(guān)性分析，特 異性抑制實(shí)驗(yàn)，重組單酶代謝反應(yīng)，以及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)幾方面的證據(jù)，證明Tenuifoliside A可特異性的經(jīng)細(xì)胞色素 P4503A4酶代謝（如圖2所示），生成單羥基化代謝產(chǎn)物。HPLC-UV 圖譜見圖3,代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖4。
[0010] 作為高特異性的細(xì)胞色素 P4503A4的探針底物，Tenuifoliside A可以用來(lái)檢測(cè) 細(xì)胞色素 P4503A4酶活性，尤其適合用于對(duì)細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及酵母菌克隆 表達(dá)體系生產(chǎn)的細(xì)胞色素 P4503A4重組酶的酶
[0011] 本發(fā)明還提供了所述細(xì)胞色素 P4503A4酶的特異性探針底物的應(yīng)用，即采用所述 探針底物檢測(cè)細(xì)胞色素 P4503A4酶活性，其測(cè)定方法為：
[0012] --體系中以Tenuifoliside A作為特異性探針底物；底物濃度選擇1-800 μ M ;
[0013] --在具有輔因子NADPH或其生成體系的孵育體系中，反應(yīng)溫度為KTC至60°C之 間，優(yōu)選37°C為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。
[0014] --反應(yīng)時(shí)間為10-120分鐘，在確保以上底物相應(yīng)的羥化代謝產(chǎn)物單羥基化 Tenuifoliside A達(dá)到定量限且底物轉(zhuǎn)化率低于20%時(shí)終止反應(yīng)；
[0015] --測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)底物減少量或單羥化產(chǎn)物生成量作為細(xì)胞色素 P4503A4酶活 性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。
[0016] 其中檢測(cè)底物減少量或其對(duì)應(yīng)羥化產(chǎn)物生成量的定量檢測(cè)方法為紫外吸收光譜、 質(zhì)譜。所有檢測(cè)器包括紫外吸收光譜檢測(cè)器、質(zhì)譜中的一種或兩種串聯(lián)。
[0017] 選用本發(fā)明所述細(xì)胞色素 P4503A4酶的特異性探針底物檢測(cè)細(xì)胞色素 P4503A4酶 體外活性具有以下突出優(yōu)勢(shì)：
[0018] (1)高特異性，Tenuifoliside A可被目標(biāo)細(xì)胞色素 P4503A4高特異性地代謝成為 單羥化產(chǎn)物。
[0019] (2)底物Tenuifoliside A是中藥遠(yuǎn)志含有的天然化學(xué)成分，來(lái)源簡(jiǎn)單易于分離 純化，無(wú)需化學(xué)合成。
[0020] (3)檢測(cè)靈敏，Tenuifoliside A均具有良好的紫外吸收特性（300~320nm)以及 離子化效果，可以通過(guò)常規(guī)分析手段方便對(duì)其定量。在臨床應(yīng)用中，無(wú)需另行購(gòu)買昂貴的檢 測(cè)設(shè)備。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖 I. Tenuifoliside A 結(jié)構(gòu)式；
[0022] 圖2. Tenuifoliside A的人重組單酶篩選試驗(yàn)結(jié)果。
[0023] 圖3. TESA及其單羥基化代謝產(chǎn)物在人肝微粒體中的色譜圖。
[0024] 圖4. Tenuifoliside A的CYP3A4介導(dǎo)的羥化代謝通路。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下列實(shí)施例是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不是要限制其范圍。
[0026] Tenuifoliside A用于檢測(cè)酮康唑?qū)θ烁挝⒘ｓw中CYP3A4活性的影響
[0027] 利用Tenuifoliside A檢測(cè)酮康唑作為CYP3A特異性抑制劑對(duì)CYP3A4的抑制作 用，具體步驟如下：
[0028] (1) 200 μ L體外代謝反應(yīng)體系中，IOmM葡萄糖-6-磷酸，1單位的葡萄糖-6-磷酸 脫氫酶，以及4mM MgCl2，人肝微粒體濃度為0.2mg / ml，Tenuifoliside A濃度為10 μ Μ， 酮康唑濃度為1 μ Μ，于37°C條件下預(yù)孵5分鐘；
[0029] (2)于反應(yīng)體系中加入20 μ I NADP+(終濃度ImM)起始反應(yīng)；
[0030] ⑶20分鐘后，加入100 μ 1乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)；
[0031] (4)采用高速冷凍離心機(jī)，在15, OOOXg的條件下，高速離心上述體系15分鐘后， 取上清，進(jìn)行HPLC-UV檢測(cè)分析；
[0032] (5)以同樣操作進(jìn)行不含有酮康唑的人肝微粒體的活性測(cè)定。
[0033] 通過(guò)紫外吸收光譜在310nm下對(duì)單羥基化Tenuifoliside A的生成量進(jìn)行定量檢 測(cè)，代表性HPLC-UV譜圖如圖3所示。利用Tenuifoliside A作為探針底物測(cè)得酮康唑?qū)?人肝微粒體中CYP3A4的活性抑制率為100%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有式（1)結(jié)構(gòu)的寡糖酯類化合物單體Tenuifoliside A作為細(xì)胞色素 P4503A4酶 的特異性探針底物。2. -種權(quán)利要求1所述細(xì)胞色素 P4503A4酶特異性探針底物的應(yīng)用，其特征在于采用 上述探針底物檢測(cè)細(xì)胞色素 P4503A4酶活性，其測(cè)定方法及條件如下： A.選擇Tenuifoliside A作為特異性探針底物；底物濃度為1-800μ M ; Β.在ρΗ7. 4的緩沖液體系下加入NADPH或其生成體系的孵育體系中，反應(yīng)溫度為 37 0C ； C. 反應(yīng)時(shí)間為10-120分鐘，在確保以上底物相應(yīng)的羥化代謝產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物 轉(zhuǎn)化率低于20%時(shí)終止反應(yīng)； D. 測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)底物減少量或單羥化產(chǎn)物生成量作為細(xì)胞色素 Ρ4503Α4酶活性的 評(píng)價(jià)指標(biāo)。3. 按照權(quán)利要求1所述細(xì)胞色素 Ρ4503Α4酶的特異性探針底物，其可用于重組細(xì)胞色 素 Ρ450單酶、人組織制備液中Ρ4503Α4酶活性的定量測(cè)定。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一類細(xì)胞色素P4503A4酶的特異性探針底物Tenuifoliside A及其在CYP3A4酶活測(cè)定中的應(yīng)用，其中酶活測(cè)定的具體操作流程如下：Tenuifoliside A作為高特異性探針底物，并借助CYP體外孵育體系開展特異性底物的CYP催化反應(yīng)，通過(guò)定量檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物消除量來(lái)測(cè)定各生物樣品及細(xì)胞中CYP3A4酶的活性。本發(fā)明可用于不同個(gè)體來(lái)源生物樣本中CYP3A4酶活性的定量評(píng)估，以及不同來(lái)源的動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞制備物中CYP3A4單酶活性的定量測(cè)定。
【IPC分類】C12Q1/26
【公開號(hào)】CN104975066
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410148203
【發(fā)明人】劉屏, 董瑞華, 李照亮, 董憲喆, 穆麗華, 王東曉
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月4日