一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，具體一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)朊藁?xì)胞并能穩(wěn)定遺傳是改良棉花品質(zhì)、獲得新的種質(zhì)的重要途徑。在棉花轉(zhuǎn)基因方面主要有根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管(Pollen-TubePathway Method)導(dǎo)入法。自1987年Umbeck首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nap 11和氯霉素乙酞基轉(zhuǎn)移酶基因CAT轉(zhuǎn)入棉花基因組成功后，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化方法得到廣泛的應(yīng)用。關(guān)于農(nóng)桿菌攜帶Ti質(zhì)粒的遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理已經(jīng)研究得比較清楚，并具有明顯的優(yōu)勢，如能穩(wěn)定地整合到宿主基因組中，拷貝數(shù)比較低，符合孟德爾遺傳規(guī)律等。然而，此方法需要宿主植株經(jīng)過體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生過程，在棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用中受到極大的限制，因?yàn)槊藁w細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生受品種基因型限制很大，生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的大多數(shù)陸地棉栽培品種很難通過此方法很快獲得轉(zhuǎn)化。因此，將Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)與其他轉(zhuǎn)基因途徑相結(jié)合不失為一種有效的途徑。
[0003]花粉管通道法不受棉花品種的限制，棉花花器結(jié)構(gòu)非常適合于花粉管通道技術(shù)的基因?qū)敕绞?，所需設(shè)備條件少，操作簡單，受到研究者和技術(shù)人員的青睞。但是利用花粉管導(dǎo)入法多直接導(dǎo)入裸露的DNA分子，最大的缺陷是轉(zhuǎn)化機(jī)理不明確，轉(zhuǎn)化效率低且不穩(wěn)定，在經(jīng)過幾代的種植后存在基因丟失并且多數(shù)后代的遺傳分離比例變化較大，存在著遺傳分離多樣性等問題。因此如何結(jié)合Ti質(zhì)粒整合優(yōu)勢和花粉管通道法操作優(yōu)勢是研究者努力的目標(biāo)之一。
[0004]目前，已有研究利用花粉管通道法注射含有T-邊界的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，但是效率較低。研究表明利用農(nóng)桿菌攜帶T-DNA轉(zhuǎn)化后的整合效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因槍法轉(zhuǎn)化方法的整合效率。因此，整合效率可能與T-復(fù)合物中的農(nóng)桿菌毒蛋白有關(guān)。T-DNA整合過程中有很多農(nóng)桿菌毒蛋白參與，其中在T-DNA穿越宿主細(xì)胞核并整合到宿主DNA起關(guān)鍵作用的的蛋白有VirDl、VirD2和VirE2，VirD1'￥丨也2與Ti質(zhì)粒上的T-DNA邊界25個(gè)堿基的重復(fù)序列結(jié)合，使其松馳，卩^隊(duì)在邊界序列的重復(fù)序列處切割，產(chǎn)生T-DNA單鏈并與右邊界緊密共價(jià)結(jié)合，并與VirE2形成復(fù)合體。復(fù)合體在VirD 2和VirE 2核定位信號(hào)(NLS)引導(dǎo)下，以VirD 2為先導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核整合到宿主基因組中。另外也有將T-DNA整合機(jī)理結(jié)合基因槍法創(chuàng)建了“農(nóng)桿槍法”(AgrolisTic)，將攜virDl、virD2的瞬時(shí)表達(dá)載體，與攜帶目的基因的T-DNA載體利用基因槍打入植物細(xì)胞中。大大提高了基因轉(zhuǎn)移的效率。但是基因槍法在棉花基因?qū)敕矫嫒匀皇艿街仓暝偕鷨栴}的困擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其可有效提高轉(zhuǎn)基因效率明以及轉(zhuǎn)基因棉花的結(jié)鈴率。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0007]—種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，包括如下步驟；
[0008]S1、冰上操作，將表達(dá)純化后的農(nóng)桿菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2濃度分別調(diào)整至 100 μ g/ μ I ；
[0009]S2、用限制性內(nèi)切酶酶切DNA后連接到pBin438質(zhì)粒上構(gòu)建外源質(zhì)粒DNA ；
[0010]S3、將所得外源質(zhì)粒DNA重懸于質(zhì)粒DNA保護(hù)劑中，得外源質(zhì)粒DNA的濃度為I μ g/ μ L的混合液；
[0011 ] S4、取步驟SI所得溶液中的一種或幾種共2 μ I，依次加入含8 μ I外源質(zhì)粒DNA的步驟S3所得的混合液，6 μ I脂質(zhì)體混合后，加入30 μ I的緩沖液中，4°C放置2小時(shí)后，取出，通過花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄖ校?br>[0012]其中，所述緩沖液包含5-15mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，0.4-0.6mmol/L二氨基乙烷四乙酸，5-15mmol/L氯化鈉、0.015yg.μ I '-0.055 μ g.μ I1甲基磺酸乙酯。
[0013]其中，質(zhì)粒DNA保護(hù)劑由氫氧化鋁溶膠保護(hù)劑、磷酸鈣保護(hù)劑和TWeen20保護(hù)劑按體積比1: 2: I混合所得。
[0014]其中，限制性內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶Hind II1.+EcoR I酶。
[0015]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0016]以脂質(zhì)體包裹的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的過程中可免受細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，同時(shí)由于精子進(jìn)入卵細(xì)胞時(shí)，此時(shí)細(xì)胞類似于原生質(zhì)的狀態(tài)，脂質(zhì)體包裝后的外源基因更容易整合至卵細(xì)胞內(nèi)部。脂質(zhì)體包裝對農(nóng)桿菌毒蛋白的穩(wěn)定性有很大的作用，避免植物組織中的某些成分對外源物質(zhì)的降解。對比加入脂質(zhì)體的組合之間的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)加入VirDl、VirD2、VirE2三種農(nóng)桿菌毒蛋白的組合比只加入VirDl、VirD2的組合轉(zhuǎn)基因成功的比例明顯提高了，從6.8%提高到9.7%，只加入VirDl、VirD2兩種農(nóng)桿菌毒蛋白的組合也比未加入任何農(nóng)桿菌毒蛋白的組合效率高；通過限制性內(nèi)切酶酶切DNA導(dǎo)入棉花后，后代的變異率比完整DNA導(dǎo)入明顯提高，穩(wěn)定速度快；分別采用氫氧化鋁溶膠、磷酸鈣和TWeen20作為外源質(zhì)粒DNA保護(hù)劑，提高了轉(zhuǎn)化率；在緩沖液中添加了 0.015 μ g.μ I '-0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯，經(jīng)檢測，平均轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)的緩沖液的平均轉(zhuǎn)化率提高了兩倍。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1
[0019]S1、冰上操作，將表達(dá)純化后的農(nóng)桿菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2濃度分別調(diào)整至 100 μ g/ μ I ；
[0020]S2、用限制性內(nèi)切酶Hind II1.+EcoR I酶酶切DNA后連接到pBin438質(zhì)粒上構(gòu)建外源質(zhì)粒DNA ；
[0021]S3、將所得外源質(zhì)粒DNA重懸于質(zhì)粒DNA保護(hù)劑中，得外源質(zhì)粒DNA的濃度為I μ g/ μ L的混合液；質(zhì)粒DNA保護(hù)劑由氫氧化鋁溶膠保護(hù)劑、磷酸鈣保護(hù)劑和TWeen20保護(hù)劑按體積比1:2:I混合所得；
[0022]S4、取步驟SI所得溶液中的一種或幾種共2 μ I，依次加入含8 μ I外源質(zhì)粒DNA的步驟S3所得的混合液，6 μ I脂質(zhì)體混合后，加入30 μ I的緩沖液中，4°C放置2小時(shí)后，取出，通過花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄖ?；所述緩沖液包含5mmol/L三羥甲基氨基甲燒-鹽酸，0.4mmol/L 二氨基乙燒四乙酸，5mmol/L氯化鈉、0.015 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。
[0023]實(shí)施例2
[0024]S1、冰上操作，將表達(dá)純化后的農(nóng)桿菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2濃度分別調(diào)整至 100 μ g/ μ I ；
[0025]S2、用限制性內(nèi)切酶Hind II1.+EcoR I酶酶切DNA后連接到pBin438質(zhì)粒上構(gòu)建外源質(zhì)粒DNA ；
[0026]S3、將所得外源質(zhì)粒DNA重懸于質(zhì)粒DNA保護(hù)劑中，得外源質(zhì)粒DNA的濃度為I μ g/ μ L的混合液；質(zhì)粒DNA保護(hù)劑由氫氧化鋁溶膠保護(hù)劑、磷酸鈣保護(hù)劑和TWeen20保護(hù)劑按體積比1:2:I混合所得；
[0027]S4、取步驟SI所得溶液中的一種或幾種共2 μ I，依次加入含8 μ I外源質(zhì)粒DNA的步驟S3所得的混合液，6 μ I脂質(zhì)體混合后，加入30 μ I的緩沖液中，4°C放置2小時(shí)后，取出，通過花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄖ?；所述緩沖液包含15mmol/L三羥甲基氨基甲燒-鹽酸，0.6mmol/L 二氨基乙燒四乙酸，15mmol/L氯化鈉、0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。
[0028]實(shí)施例3
[0029]S1、冰上操作，將表達(dá)純化后的農(nóng)桿菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2濃度分別調(diào)整至 100 μ g/ μ I ；
[0030]S2、用限制性內(nèi)切酶Hind II1.+EcoR I酶酶切DNA后連接到pBin438質(zhì)粒上構(gòu)建外源質(zhì)粒DNA ；
[0031]S3、將所得外源質(zhì)粒DNA重懸于質(zhì)粒DNA保護(hù)劑中，得外源質(zhì)粒DNA的濃度為I μ g/ μ L的混合液；質(zhì)粒DNA保護(hù)劑由氫氧化鋁溶膠保護(hù)劑、磷酸鈣保護(hù)劑和TWeen20保護(hù)劑按體積比1:2:I混合所得；
[0032]S4、取步驟SI所得溶液中的一種或幾種共2 μ I，依次加入含8 μ I外源質(zhì)粒DNA的步驟S3所得的混合液，6 μ I脂質(zhì)體混合后，加入30 μ I的緩沖液中，4°C放置2小時(shí)后，取出，通過花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄖ?；所述緩沖液包含lOmmol/L三羥甲基氨基甲燒-鹽酸，0.5mmol/L 二氨基乙燒四乙酸，10mmol/L氯化鈉、0.035 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。
[0033]經(jīng)過脂質(zhì)體包裝的組合之間比較，加入農(nóng)桿菌毒蛋白的轉(zhuǎn)基因效率明顯提高了很多，加毒理蛋白的兩種組合比不加毒蛋白的組合分別提高了 5.4%和8.3%,以脂質(zhì)體包裹的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞的過程中可免受細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，同時(shí)由于精子進(jìn)入卵細(xì)胞時(shí)，此時(shí)細(xì)胞類似于原生質(zhì)的狀態(tài)，脂質(zhì)體包裝后的外源基因更容易整合至卵細(xì)胞內(nèi)部。脂質(zhì)體包裝對農(nóng)桿菌毒蛋白的穩(wěn)定性有很大的作用，避免植物組織中的某些成分對外源物質(zhì)的降解。對比加入脂質(zhì)體的組合之間的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)加入VirDl、VirD2、VirE2三種農(nóng)桿菌毒蛋白的組合比只加入VirDl、VirD2的組合轉(zhuǎn)基因成功的比例明顯提高了，從6.8%提高到9.7%，只加入VirDl、VirD2兩種農(nóng)桿菌毒蛋白的組合也比未加入任何農(nóng)桿菌毒蛋白的組合效率高；分別采用氫氧化鋁溶膠、磷酸鈣和TWeen20作為外源質(zhì)粒DNA保護(hù)劑，提高了轉(zhuǎn)化率；在緩沖液中添加了 0.015 μ g.μ I '-0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯，經(jīng)檢測，平均轉(zhuǎn)化率比傳統(tǒng)的緩沖液的平均轉(zhuǎn)化率提高了兩倍。
[0034]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，包括如下步驟； 51、冰上操作，將表達(dá)純化后的農(nóng)桿菌毒蛋白VirDl、VirD2、VirE2濃度分別調(diào)整至100 μ g/ μ I ； 52、用限制性內(nèi)切酶酶切DNA后連接到pBin438質(zhì)粒上構(gòu)建外源質(zhì)粒DNA; 53、將所得外源質(zhì)粒DNA重懸于質(zhì)粒DNA保護(hù)劑中，得外源質(zhì)粒DNA的濃度為Iμ g/ μ L的混合液； 54、取步驟SI所得溶液中的一種或幾種共2μ 1，依次加入含8 μ I外源質(zhì)粒DNA的步驟S3所得的混合液，6 μ I脂質(zhì)體混合后，加入30 μ I的緩沖液中，4°C放置2小時(shí)后，取出，通過花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄖ小?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，所述緩沖液包含5-15mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，0.4-0.6mmol/L 二氨基乙烷四乙酸，5-15mmol/L氯化鈉、0.015 μ g.μ I ^0.055 μ g.μ I 1甲基磺酸乙酯。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，質(zhì)粒DNA保護(hù)劑由氫氧化鋁溶膠保護(hù)劑、磷酸鈣保護(hù)劑和TWeen20保護(hù)劑按體積比1: 2: I混合所得。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，限制性內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶Hind II1.+EcoR I酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，用限制性內(nèi)切酶酶切DNA與質(zhì)粒DNA保護(hù)劑混合后，利用脂質(zhì)體包裝攜帶Ti質(zhì)粒上的毒蛋白基因通過花粉管通道法將目的基因?qū)朊藁ㄖ小１景l(fā)明可以有效提高轉(zhuǎn)基因效率。
【IPC分類】C12N15/82
【公開號(hào)】CN105002209
【申請?zhí)枴緾N201510519959
【發(fā)明人】劉紅玲, 祝建波, 朱華國, 孫燕飛, 邱紅林, 王彥芹
【申請人】石河子大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月15日