一種固定化單寧酶的制備方法
【專利說(shuō)明】一種固定化單寧酶的制備方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種固定化單寧酶的制備方法，屬于酶的固定化及其應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]單寧酶(Tannase, E.C.3.1.1.20)，是一種主要由微生物產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，以單寧酸、沒(méi)食子酸等作為誘導(dǎo)物時(shí)可大量產(chǎn)生，屬于細(xì)胞膜結(jié)合酶，可分泌到胞外?？伤鉀](méi)食子酰單寧、鞣花單寧及沒(méi)食子酸烷基酯中的沒(méi)食子酸酯鍵，生成沒(méi)食子酸、葡萄糖及烷基醇等小分子物質(zhì)。
[0004]工業(yè)制備沒(méi)食子酸，多采用傳統(tǒng)的濃硫酸法，即利用濃硫酸水解單寧酸生產(chǎn)沒(méi)食子酸，這一方法雖然有效，但由于存在嚴(yán)重污染環(huán)境、水解副產(chǎn)物多、對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重及耗能多等缺陷，因而這一方法已不能適應(yīng)當(dāng)前發(fā)展“節(jié)能環(huán)?！毙彤a(chǎn)業(yè)的需求。而采用酶法轉(zhuǎn)化，即利用單寧酶水解單寧酸生產(chǎn)沒(méi)食子酸，不僅生產(chǎn)效率高，而且可避免濃硫酸法的缺陷，是一種對(duì)環(huán)境“綠色友好”的高效生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。
[0005]利用酶法生產(chǎn)沒(méi)食子酸時(shí)，對(duì)于酶制劑形式的選擇主要有以下三種:(i)游離酶。將單寧酶直接投入使用，方便、快捷。但游離酶無(wú)法回收，因而工藝成本較高。(ii)產(chǎn)酶菌體。將產(chǎn)單寧酶的菌體投入到單寧酸溶液中，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)酶，水解單寧酸。這一方法雖避免了單寧酶的分離提取及此過(guò)程對(duì)酶活的影響等缺陷，但菌體在發(fā)酵后趨于衰老，無(wú)法進(jìn)行循環(huán)發(fā)酵產(chǎn)酶。(iii)固定化酶。將單寧酶固定于載體，利用固定化單寧酶水解單寧酸制備沒(méi)食子酸。由于固定化酶可循環(huán)利用，且易分離，因而可大大提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。但酶在固定化后，酶活通常會(huì)降低，同時(shí)，當(dāng)固定化酶循環(huán)利用時(shí)，酶活亦不斷隨著使用次數(shù)的增加而不斷下降。因此，尋找有效的固定化方法，最大可能的保持酶活力和提高固定化單寧酶的重復(fù)使用次數(shù)，降低固定化單寧酶生產(chǎn)成本，成為這一方法可否高效轉(zhuǎn)化沒(méi)食子酸并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一種固定化單寧酶的制備方法，所得固定化單寧酶活力高、循環(huán)使用次數(shù)多，且生產(chǎn)成本低，可有效用于沒(méi)食子酸的工業(yè)生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明的實(shí)施方案為:一種固定化單寧酶的制備方法，包括:
(1)先用無(wú)水乙醇振蕩浸泡樹(shù)脂1-3h,濾出樹(shù)脂后再用丙酮振蕩浸泡1-3 h，把樹(shù)脂濾出來(lái)后用蒸餾水振蕩沖洗樹(shù)脂至丙酮?dú)埩簦瑐溆茫?br> (2)單寧酶粗酶液于4000-5000r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液為超濾酶液；
(3)將樹(shù)脂浸于戊二醛水溶液中使樹(shù)脂充分交聯(lián)，濾出樹(shù)脂后加入到含超濾酶液的PBS緩沖液中，室溫下攪拌使樹(shù)脂充分吸附酶，濾出固體顆粒即為固定化單寧酶，4°C保藏。
[0008]步驟(I)中，所述樹(shù)脂為交鏈苯乙烯型非極性大孔吸附樹(shù)脂，孔容為3 mL/g，孔徑為120 A，比表面積為550 m2/g。
[0009]步驟(2)中，所述超濾所用纖維膜的切割分子量(MffCO)為10-20 kDa，上清液超濾后濃縮4-6倍。
[0010]步驟(3)中，所述戊二醛水溶液濃度為I %_5 % (v/v),交聯(lián)時(shí)間為2-6 h。
[0011]步驟(3)中，所述PBS緩沖液濃度為0.01-0.1 mol/L，超濾酶液與PBS緩沖液體積比為0.001-0.01。所述樹(shù)脂投量和混合溶液的質(zhì)量體積比為3 %-6 % (m/v)，吸附時(shí)間為4-8 ho
[0012]步驟(3)中，所述PBS緩沖液配制的配制方法為:先配制A液和B液。A液:稱取7.16g Na2HPO4.12H20，蒸餾水定容于100 mL，濃度為0.2 mol/L,制得A液；稱取3.12gNaH2PO4.2H20，蒸餾水定容于100 mL，濃度為0.2 mol/L，制得B液；取19 mL A液和81 mLB液混合，即得0.2 mol/L的PBS緩沖液。通過(guò)稀釋一定倍數(shù)，可得0.01-0.1 mol/L的PBS緩沖液。
[0013]本發(fā)明提供的固定化單寧酶制備方法，工藝簡(jiǎn)單、成本低廉，同時(shí)，根據(jù)我們的酶活力測(cè)定方法，制備的固定化單寧酶活力高于游離單寧酶活力。另外，本方法制備的固定化單寧酶具有良好的保藏穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，可大大提高單寧酶的使用效率。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為固定化單寧酶的保藏穩(wěn)定性?？v坐標(biāo)為酶活殘留率(％)，橫坐標(biāo)為保藏時(shí)間
(d)o
[0015]圖2為固定化單寧酶的重復(fù)使用次數(shù)?？v坐標(biāo)為酶活殘留率(％)，橫坐標(biāo)為重復(fù)使用次數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為使本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步了解本發(fā)明，下面列舉本發(fā)明的具體實(shí)施例。需要強(qiáng)調(diào)的是，實(shí)施例并非本發(fā)明技術(shù)方案所有可能實(shí)施方式的窮舉，故不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017]一種固定化單寧酶的制備方法，具體步驟和方法如下:
(I)樹(shù)脂預(yù)處理:稱取交鏈苯乙烯型非極性大孔吸附樹(shù)脂MA-NP6 (購(gòu)于杭州創(chuàng)科生物科技有限公司)10 g，無(wú)水乙醇振蕩浸泡樹(shù)脂2 h,過(guò)濾出樹(shù)脂后再用丙酮振蕩浸泡2 h，把樹(shù)脂過(guò)濾出來(lái)后用蒸餾水振蕩沖洗樹(shù)脂至無(wú)丙酮?dú)埩?，備用?br>[0018](2)單寧酶液預(yù)處理:將單寧酶粗酶液于4000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)切割分子量10 kDa的中空纖維膜進(jìn)行超濾，可去除沒(méi)食子酸等小分子物質(zhì)，濾液濃縮5倍，濃縮液(淺黃色)為單寧酶超濾酶液，測(cè)得其單寧酶活力為358.3 U/mL。
[0019](3)單寧酶固定化:a、樹(shù)脂浸于2% (v/v)的戊二醛水溶液中4 h，使樹(shù)脂充分交聯(lián)；b、將單寧酶超濾酶液加入到0.1 mol/L的PBS緩沖液中，酶液與PBS緩沖液體積比為1:100 ;c、將樹(shù)脂濾出加入到含單寧酶的PBS緩沖液中，樹(shù)脂投量為5 % (m/v)，室溫下攪拌4 h，使樹(shù)脂充分吸附單寧酶，濾出固體顆粒即為固定化單寧酶，測(cè)得固定化單寧酶活力為942.0 U/go
[0020]將上述方法制得的固定化單寧酶置于4°C下分別保藏I d、2 d、4 d、6 d、8 d、10d、15 d、20 d、25 d、30 d、40 d、50 d及60 d時(shí)進(jìn)行酶活測(cè)定(見(jiàn)圖1)，由圖1可看出，固定化單寧酶在保藏的前30 d，酶活損失甚微。在保藏60 d時(shí)，固定化酶仍有高達(dá)84 %的酶活力，說(shuō)明本工藝制備的固定化單寧酶具有良好的保藏穩(wěn)定性。
[0021]用上述方法值得的固定化單寧酶重復(fù)多次水解2 mmol/L的沒(méi)食子酸丙酯溶液，每次水解后將固定化單寧酶濾出、清洗并測(cè)定酶活，然后進(jìn)行下一次水解，直至酶活降至初始酶活的70 %為止，以此考察固定化單寧酶的重復(fù)使用次數(shù)。由圖2可看出，固定化單寧酶重復(fù)使用17次時(shí)，仍有70 %的酶活，說(shuō)明本工藝制備的固定化單寧酶可重復(fù)使用多次，表現(xiàn)出了良好的酶活穩(wěn)定性。
[0022]上述固定化單寧酶的方法中，單寧酶預(yù)處理中測(cè)定單寧酶活力和步驟(3)中測(cè)定固定化單寧酶活力的方法是:取eppdorf管(EP管)5支，分別設(shè)定I支對(duì)照管，I支空白管和3支測(cè)定管。每支管中加入0.2 mL單寧酶液(測(cè)固定化單寧酶活力時(shí)，每支管中加入0.1g固定化單寧酶和0.1 mL緩沖液)，置于45°C金屬浴中保溫10 min。然后在各測(cè)定管中加入0.2 mL反應(yīng)底物沒(méi)食子酸丙酯(PG)標(biāo)準(zhǔn)液，空白管中加入0.2 mL緩沖液，對(duì)照管中加入0.6 mL無(wú)水乙醇，準(zhǔn)確反應(yīng)20 min。反應(yīng)20min后，分別在測(cè)定管和空白管中加入0.6mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng)。在對(duì)照管中加入0.2 mL PG標(biāo)準(zhǔn)液。反應(yīng)結(jié)束，將各管溶液分別移至10 mL試管中，再各加入9 mL緩沖液用于稀釋，測(cè)定其在270 nm處的吸光度值A(chǔ)。所述緩沖液的配制方法是:稱取檸檬酸2.10 g、檸檬酸三鈉2.94 g，分別定容于100 mL容量瓶，二者濃度均為0.1 mol/L。將檸檬酸與檸檬酸三鈉按體積比1:2混合，可得約pH 5.0的緩沖液；
酶活力定義:45 ° C，I mL酶液(或I g固定化單寧酶)每分鐘水解PG標(biāo)準(zhǔn)液，導(dǎo)致吸光度值減少0.001個(gè)吸收值的酶活力定義為I個(gè)酶活力單位(U)。據(jù)此定義，得酶活力計(jì)算公式:酶活力(U/mL或U/g)= (A對(duì)-A測(cè))X 2.5X 103，其中，Αχ?和Aiw分別為對(duì)照管和測(cè)定管溶液的吸光度值。所述PG標(biāo)準(zhǔn)液配制:準(zhǔn)確稱取0.042 g PG，先以1-2滴無(wú)水乙醇溶解，再用緩沖液100 mL定容，得2 mmol/L的PG標(biāo)準(zhǔn)液。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)先用無(wú)水乙醇振蕩浸泡樹(shù)脂1-3h,濾出樹(shù)脂后再用丙酮振蕩浸泡1-3 h，把樹(shù)脂濾出來(lái)后用蒸餾水振蕩沖洗樹(shù)脂至丙酮?dú)埩?，備用? (2)將單寧酶粗酶液于4000-5000r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液為超濾酶液； (3)將步驟(I)處理后的樹(shù)脂浸于戊二醛水溶液中使樹(shù)脂充分交聯(lián)，濾出樹(shù)脂后加入到含超濾酶液的PBS緩沖液中，室溫下攪拌使樹(shù)脂充分吸附酶，濾出固體顆粒即為固定化單寧酶，4°C保藏。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述樹(shù)脂為交鏈苯乙烯型非極性大孔吸附樹(shù)脂，孔容為3 mL/g，孔徑為120 A，比表面積為550 m2/g°3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述超濾所用纖維膜的切割分子量為10-20 kDa，上清液超濾后濃縮4-6倍。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述戊二醛水溶液濃度為I %_5 %，交聯(lián)時(shí)間為2-6 ho5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述PBS緩沖液濃度為0.01-0.1 mol/L，超濾酶液與PBS緩沖液體積比為0.001-0.01。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，所述樹(shù)脂投量和混合溶液的質(zhì)量體積比為3 %-6 %，吸附時(shí)間為4-8 ho7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化單寧酶的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述PBS緩沖液配制的配制方法為:先配制A液和B液:稱取7.16g Na2HPO4.12H20，蒸餾水定容于100 mL，濃度為0.2 mol/L，制得A液；稱取3.12g NaH2PO4.2H20，蒸餾水定容于100 mL，濃度為0.2 mol/L,制得B液；取19 mL A液和81 mL B液混合，即得0.2 mol/L的PBS緩沖液，再稀釋可得0.01-0.1 mol/L的PBS緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種固定化單寧酶的制備方法。將單寧酶粗酶液超濾濃縮后加入到PBS緩沖液中，再以一種交鏈苯乙烯型非極性大孔吸附樹(shù)脂為單寧酶固定化載體，經(jīng)預(yù)處理后用戊二醛交聯(lián)，最后投入到含超濾酶液的PBS緩沖液中充分吸附單寧酶，濾出固體顆粒即為固定化單寧酶。本發(fā)明的固定化單寧酶制備工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，固定化酶活力高于游離酶活力，且具有良好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可用于沒(méi)食子酸的高效生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N11/08
【公開(kāi)號(hào)】CN105039298
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510380655
【發(fā)明人】曹庸, 張帥, 朱華偉, 農(nóng)嘉依, 林健輝
【申請(qǐng)人】曹庸
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年7月2日