一種熱休克蛋白基因在耐高溫大腸桿菌構建中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬基因工程領域，具體涉及一種經(jīng)過體外定向分子進化的極端嗜熱古菌 (Pyrococcushorikoshii)熱休克蛋白基因PhHSPS及其應用，特別是涉及所述基因在耐高 溫菌株構建中的應用。
【背景技術】
[0002] 熱休克蛋白（HeatShockProtein，HSP)是生物受到環(huán)境中物理、化學、生物、精神 等刺激時發(fā)生應激反映而合成的蛋白質，又名應激蛋白（StressProtein,SP)，是一類高度 保守的蛋白質，普遍存在于原核和真核生物中。最早關于HSP的報道見于1962年，Ritossa 觀察到將果蠅幼蟲的飼養(yǎng)溫度從25 °C提高到°C，30min后，其唾液腺染色體上出現(xiàn)了特殊 的"膨突"。后來研究發(fā)現(xiàn)，這種膨突的生成與該區(qū)帶基因的轉錄加強有關，提示熱休克時 可能有某種蛋白合成的增加。人們將這種現(xiàn)象稱為熱休克反應或熱休克應答（heatshock response,HSR)〇
[0003] 熱休克蛋白在熱防御中的作用主要指生物或細胞的熱耐受能力增強，無論是植物 細胞還是一些低等生物，當預先經(jīng)受過一次中等程度的熱暴露處理后，就能耐受其后的一 個強烈的熱處理。換言之，亞致死性熱休克可使細胞獲得對隨后的致死性熱處理產(chǎn)生熱耐 受，從而大大增強了細胞的生存能力。許多實驗直接證明，熱耐受的產(chǎn)生與HSP有關，熱耐 受的消失與HSP的降解相一致，在熱休克蛋白不被誘導的發(fā)育階段，有機體對熱極其敏感， 也不能建立熱耐受，在一定量的HSP存在時，不需預先進行熱休克處理，細胞也可產(chǎn)生熱耐 受，不能獲得熱耐受的變異細胞無HSP的誘導，阻斷HSP的產(chǎn)生可阻止熱耐受的獲得。
[0004] 目前由于傳統(tǒng)能源對環(huán)境的污染，世界許多地方已經(jīng)開始用清潔可再生的乙醇當 做重要能源廣泛應用。很多微生物可應用于生產(chǎn)乙醇，它們是乙醇發(fā)酵生產(chǎn)中十分重要的 微生物細胞工廠，但是傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵溫度比較低，（例如釀酒酵母最適的發(fā)酵溫度為 28~33°C，一般不超過36°C)，這是制約乙醇發(fā)酵生產(chǎn)的一個很大的瓶頸，它會大大提高乙醇 生產(chǎn)成本。如果可以選育出耐受高溫微生物，則有減少染菌機率、縮短發(fā)酵周期、提高發(fā)酵 率與減少冷卻水使用費用等優(yōu)點，這將對提高發(fā)酵性能和降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 在本發(fā)明中，我們改造了一種來源于極端嗜熱古菌（Pyrococcushorikoshii)的 熱休克蛋白經(jīng)過體外定向分子進化，獲得了突變的熱休克蛋白/?*'/?'并且利用基 因工程技術成功的將此基因轉入到大腸桿菌中，并且經(jīng)過一系列測試，發(fā)現(xiàn)改造過的突變 基因能夠顯著的提高大腸桿菌的耐高溫脅迫能力，從而為提高微生物的高溫耐受性提供一 種解決的方案。
[0006] 因此，本發(fā)明所要解決的技術問題之一，在于提供一種比野生型極端嗜熱古菌 (Pyrococcushorikoshii)熱休克蛋白基因/???/5具有更高耐熱能力的經(jīng)過突變的熱休克 蛋白基因/^?75。
[0007] 本發(fā)明所要解決的技術問題之二，在于提供所述的來源于極端嗜熱古菌 (Pyrococcushorikoshii)的熱休克蛋白基因/???/?"在微生物耐高溫脅迫中的應用，即將 突變后的/^/575基因轉入大腸桿菌內，并對該轉基因大腸桿菌進行功能驗證，以證明它具 有提1?大腸桿菌耐熱性的的功能。
[0008] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn)。
[0009] 所述的經(jīng)過DNA-shuffling的極端嗜熱古菌（Pyrococcushorikoshii)的熱休克 蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO2 所示。該熱休克蛋白基因長519bp，含519個堿基，編碼的氨基酸172個。
[0010] 所述的極端嗜熱古菌（Pyrococcushorikoshii)的熱休克蛋白基因/???/5/,采用 人工方法合成。即依照PTDS(PCR-basedtwo-stepDNAsynthesis,PTDS)方法克隆源自 極端嗜熱古菌（Pyrococcushorikoshii)的熱休克蛋白基因/???/5,進行化學合成，在保持 /???/5基因的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成本發(fā)明的極端嗜熱古菌（Pyrococcus horikoshii)的熱休克蛋白基因
[0011] 人工合成的進行體外定向分子進化，將所獲得的突變的基因轉入 大腸桿菌，經(jīng)過37生長1小時后轉入在55°C下過夜生長，第二天選取生長良好菌落抽提DNA，并且測序，最終得到/?*'/?'序列。將獲得的/?*'/?'基因轉化大腸桿菌，經(jīng)過耐高溫 評價，獲得具有基因耐高溫大腸桿菌菌株。
[0012] 由此說明：本發(fā)明的源于極端嗜熱古菌（Pyrococcushorikoshii)的熱休克蛋白 基因7^/575經(jīng)過體外定向分子進化獲得了能夠提高大腸桿菌高溫耐受力的基因，這使得 此基因用于提高微生物高溫耐受性成為了可能。
[0013]
【附圖說明】
[0014] 圖1突變基因辦熱取與氨基酸序列比對結果。
[0015] 圖2經(jīng)過高溫篩選，獲得的大腸桿菌陽性單菌。
[0016] 圖3高溫（53°C)處理后獲得突變耐高溫菌株與野生型基因生長情況。
[0017]
【具體實施方式】
[0018] 以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案 而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理 解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范 圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
[0019] 本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪一奧德里奇（Sigma-Aldrich)公 司。
[0020] 本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學出版社)。
[0021] 實施例1極端耐高溫基因/???/5/的人工合成 依照PTDS (PCR-based two-step DNA synthesis, PTDS)方法克隆源自極端嗜熱古菌 (Pyrococcus horikoshii)的熱休克蛋白基因/???/5,進行化學合成，在保持熱休克蛋白基 因/???/5的氨基酸序列不變的基礎上，設計引物合成本發(fā)明的熱休克蛋白基因設 計的引物如下：
TTA, TTC, GAT, CTT, GAC, CTC, GAA, TCC, CTC, TCC, TTC, CTT, CTT, TGT, TG利用PCR進行/5MSd基因擴增，在IOOW反應體系中，/^?^/-2至/5MSF/-9共8個引 物的添加量為2ng，外側引物/???/5/ -1和/???/5/ -10添加量為30ng，擴增條件為：94°C 預熱Imin;94°C30s，50°C30s，72°C2min，使用的Taq DNA聚合酶為KOD FX taq酶 (Toyobo公司，日本)，共25個循環(huán)。
[0022] PCR結束后，1%瓊脂糖膠回收，取10 W直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公 司）。4°C連接過夜，高效轉化DH5 a感受態(tài)中，獲得陽性克隆經(jīng)過上海桑尼公司測序分析， 所得序列即為本發(fā)明的熱休克蛋白基因(/^?7Y)，該熱休克蛋白基因長519bp，含519個堿 基，編碼的氨基酸172個。
[0023] 實施例2合成/???/5/基因DNA-shuffling突變 1)通過多位點定點突變的方法，消除基因中的及mz/OT和SacI等限制性內切酶 位點。
[0024] 2)按照/5MSF/測定序列設計兩端引物，在基因兩端SaMlI和SacI增加酶切位點， 以基因為模板進行PCR擴增，試劑盒回收擴增片斷。
[0025] 3)用DNaseI降解的產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺電泳分離，透析袋法回收IOObp以下小 片段。
[0026] 4)以回收的小片段為模板進行無引物PCR(PrimerlessPCR)，50個循環(huán)后，擴增 產(chǎn)物經(jīng)I. 0%Agrose電泳檢測。
[0027] 5)根據(jù)PrimelessPCR電泳的結果，取PrimelessPCR擴增后的產(chǎn)物，加入引 物后，進行常規(guī)引物PCR反應，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%Agrose電泳，透吸袋法回收經(jīng)DNA ShuffIing突變的 /???/5/ 基因。
[0028] 6)用來自Crab的DSN酶對突變基因進行均一化處理，均一化后將大幅度 增加突變基因的種類和比例。
[0029] 7)將突變的/???/5/與載體連接，構建突變基因的原核表達文庫。
[0030] 實施例3突變基因的體外定向分子進化 1)制備大腸桿菌大腸桿菌EG50化學感受態(tài)，方法參照分子克隆實驗指南（Raineriet al. , 1990)〇
[0031] 2)取50^大腸桿菌6650感受態(tài)細胞，加入1^突變0嫩，充分混勻，201^11后將 混合物涂在含有氨芐青霉素的2YT平板，先恢復培養(yǎng)1小時（37°C)，然后將平板置于55°C 培養(yǎng)箱中生長12h. 3)從步驟2中2YT板上生長的菌中挑取耐高溫克隆，酶切鑒定正確后，送上海sunny公 司測序。
[0032] 4)通過測序，將耐高溫突變基因與原始合成基因進行序列比對，得到耐高溫相關 突變位點的基因
[0033] 實施例4耐高溫大腸桿菌構建以及耐高溫性驗證 1) 制備大腸桿菌大腸桿菌EG50化學感受態(tài)，方法參照分子克隆實驗指南（著J.莎姆 布魯克黃培堂譯） 2) 將野生型基因作為對照與突變基因進行耐高溫比對，具體方法為：取50PLGV3101 感受態(tài)細胞，加入IUL突變DNA或者合成的野生型DNA，充分混勻，20min后將混合物涂在 含有氨芐青霉素的2YT平板，培養(yǎng)12小時（37°C)，然后挑取單菌落置于2ml液體LB培養(yǎng)基 中培養(yǎng)12小時，測定OD值，并調整突變基因OD值到與野生型相近。
[0034] 3)吸取I iiL菌液點到含有氨芐青霉素的2YT平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時后 轉入53°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，通過菌斑的生長狀況評價耐高溫性能，從而獲得耐高溫大腸 桿菌以及相應的突變基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其編碼的氨基酸序 列如SEQIDNO2所示。
【主權項】
1. 一種經(jīng)過體外定向分子進化的來源于極端嗜熱古菌（Pyrococcus horikoshii)的 熱休克蛋白突變基因PhHSPS，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的突變熱休克蛋白基因PhHSPS，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO 2 所示。3. 權利要求1或2所述的突變熱休克蛋白基因PhHSPS經(jīng)過轉化大腸桿菌，可用于構建 耐高溫大腸桿菌菌株。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有更高耐熱性能的極端嗜熱古菌(Pyrococcus？horikoshii)的熱休克蛋白基因PhHSPS。所述經(jīng)過突變的耐高溫基因PhHSPS，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ？ID？NO2所示。將分子進化獲得的突變熱休克蛋白基因轉化大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)該突變熱休克蛋白基因能顯著的提高大腸桿菌的耐熱能力，因此該基因能夠應用于細菌耐高溫菌株的構建。
【IPC分類】C12R1/01, C07K14/195, C12N15/31, C12N15/70, C12R1/19, C12N1/21
【公開號】CN105087602
【申請?zhí)枴緾N201410211217
【發(fā)明人】高建杰, 姚泉洪, 彭日荷
【申請人】上海市農業(yè)科學院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月19日