一種高效分離松茸菌種的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種高效分離松茸菌種的方法。
【背景技術】
[0002]松鸞(Tricholoma matsutake)，又稱松口蘑，是著名的食藥用真菌，具有很高的藥用價值及多種生物活性。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明松茸具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗炎，治療心血管病等功效；同時又因其具有良好的防輻射保健功能，在國際上廣受人們追捧，具有極高的經濟價值。
[0003]松茸生長條件特殊，需要在特定環(huán)境下與松屬、櫟屬的須根產生共生關系，形成菌根，才能進一步長出子實體。松茸的生產只能采取半人工方式，用人工培養(yǎng)的菌絲在自然條件下的寄主根部誘導形成菌塘或菌落，最終發(fā)育成子實體。因此分離獲得并培養(yǎng)松茸純菌絲體對松茸的生產、研究具有十分重要的意義。目前公認的分離松茸菌絲體最佳的方法是利用子實體的菌褶部位，但這種分離方法依然存在著一些問題，如利用菌褶分離成功率依然不理想、易污染、菌絲在培養(yǎng)基上生長速度極其緩慢，難以迅速擴增等。

【發(fā)明內容】

[0004]針對上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供的是一種高效分離松茸菌種的方法，采用本方法使得菌絲萌發(fā)快，長勢強。
[0005]本發(fā)明所采用的技術如下:一種高效分離松茸菌種的方法，如下:挑選松茸子實體時選擇外觀典型、大小適中、菌肉肥厚、顏色正常且尚未開傘的子實體，將松茸子實體用質量濃度75%酒精棉擦洗2-3次，放入已滅菌的超凈工作臺中；將松茸子實體沿菌蓋與菌柄交界處掰開，再將菌蓋表面表皮連同菌幕撕下，露出無菌的菌肉與菌褶部分；用無菌鑷子夾住菌蓋邊緣，夾取l-2cm3大小的組織塊，夾取的組織塊既包括上層的菌肉又包括下層的菌褶部分；此時平板培養(yǎng)基溫度在60°C左右，尚未凝固，用組織塊的菌肉部分蘸取少量未凝固培養(yǎng)基，菌褶部分不與培養(yǎng)基接觸，將組織塊粘于培養(yǎng)皿蓋內表面正中間，菌褶部分向下，組織塊與培養(yǎng)基距離0.6cm ;蓋上蓋封口保存，在25°C黑暗條件下正置培養(yǎng)，組織塊的菌肉部分向菌褶供給營養(yǎng)，使菌褶成熟并噴灑孢子，成熟的孢子噴灑至培養(yǎng)基上萌發(fā)成純菌絲體。
[0006]本發(fā)明還具有如下技術特征:
[0007]所述的培養(yǎng)基配方為:
[0008]桑黃菌絲體6d發(fā)酵液200ml/L，馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂14g/L，維生素A 1.5mg/L、維生素 B1 2.5mg/L 和維生素 B2 2.5mg/L ；
[0009]所述的桑黃菌絲體6d發(fā)酵液:在300ml PD液體培養(yǎng)基中接入桑黃斜面種，斜面種培養(yǎng)基為PDA，25°C避光培養(yǎng)7d，25°C振蕩培養(yǎng)，160r/min，培養(yǎng)6d后，過濾得到發(fā)酵液；桑黃菌種來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號:桑黃DLlOl CCTCC M 2011137。
[0010]本發(fā)明具有如下技術特點:
[0011]1、使用本發(fā)明分離松茸菌種的成功率高達90%以上，且操作簡單易行，所需材料少；
[0012]2、孢子分離使用的是松茸的成熟孢子，具備雙親的遺傳特性，生命力強，培育出的菌種質量好，優(yōu)于一般的組織分離；
[0013]3、該分離方法中，組織塊不與培養(yǎng)基直接接觸，避免了一些雜菌污染，大大降低了污染率。
[0014]4、使用本發(fā)明中的培養(yǎng)基培養(yǎng)松茸孢子，萌發(fā)率高，菌絲粗壯，生長速度快，形成明顯的氣生菌絲。
【具體實施方式】
[0015]下面舉例對本發(fā)明做進一步說明:
[0016]實施例1
[0017]一、培養(yǎng)基配方:
[0018]桑黃菌絲體6d發(fā)酵液200ml/L，PDA:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂14g/L，維生素 Al.5mg/L、維生素 B1 2.5mg/L、維生素 B2 2.5mg/L。
[0019]具體操作方法，IL培養(yǎng)基為例:馬鈴薯去皮，稱取200g，切成大約Icm3的小塊，加水500ml，煮沸后維持沸騰20min，過濾得濾液。將濾液與200ml桑黃菌絲發(fā)酵液混合，加入維生素Al.5mg、維生素B1 2.5mg、維生素B2 2.5mg，加熱攪拌至完全溶解，定容到100ml0分裝到三角瓶中，高壓蒸汽滅菌121°C，0.105MPa，20min。
[0020]桑黃菌絲體6d發(fā)酵液:在300ml PD液體培養(yǎng)基中O3D培養(yǎng)基成分:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L)接入一試管桑黃斜面種(斜面種培養(yǎng)基為PDA，25°C避光培養(yǎng)7d)，25°C振蕩培養(yǎng)，160r/min，培養(yǎng)6d后，過濾得到發(fā)酵液。桑黃菌種來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號:桑黃 DLlOl CCTCC M 2011137。
[0021]二、倒平板:
[0022]將培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿(d = 90mm)用高壓滅菌鍋121°C滅菌20min后，放入超凈工作臺中，紫外消毒30min后倒平板，在酒精燈火焰附近操作，每個培養(yǎng)皿倒25-30ml培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基尚未凝固時使用。
[0023]實施例2
[0024]—種高效分離松茸菌種的方法，如下:
[0025]步驟一:種菇選取及表面消毒
[0026]挑選松茸子實體時應選擇外觀典型、大小適中、菌肉肥厚、顏色正常且尚未開傘的子實體。將松茸子實體用75%酒精棉擦洗2-3次，放入已滅菌的超凈工作臺中。
[0027]步驟二:切塊接種
[0028]將松鸞子實體沿菌蓋與菌柄交界處掰開，再將菌蓋表面表皮連同菌幕撕下，露出無菌的菌肉與菌褶部分。用無菌鑷子夾住菌蓋邊緣，夾取l-2cm3大小的組織塊，夾取的組織塊既包括上層的菌肉又包括下層的菌褶部分。此時平板培養(yǎng)基溫度在60°C左右，尚未凝固。用組織塊菌肉部分蘸取少量未凝固培養(yǎng)基(菌褶部分不可與培養(yǎng)基接觸)，將組織塊粘于培養(yǎng)皿蓋內表面正中間，菌褶部分向下，組織塊與培養(yǎng)基距離約0.6cm。蓋上蓋封口保存。
[0029]步驟三:培養(yǎng)純化
[0030]在25°C黑暗條件下正置培養(yǎng)，組織塊的菌肉部分可以向菌褶供給營養(yǎng)，使菌褶成熟并噴灑孢子。成熟的孢子噴灑至培養(yǎng)基上即可萌發(fā)成純菌絲體。
【主權項】
1.一種高效分離松茸菌種的方法，其特征在于，方法如下: 挑選松茸子實體時選擇外觀典型、大小適中、菌肉肥厚、顏色正常且尚未開傘的子實體，將松茸子實體用質量濃度75%酒精棉擦洗2-3次，放入已滅菌的超凈工作臺中；將松茸子實體沿菌蓋與菌柄交界處掰開，再將菌蓋表面表皮連同菌幕撕下，露出無菌的菌肉與菌褶部分；用無菌鑷子夾住菌蓋邊緣，夾取l-2cm3大小的組織塊，夾取的組織塊既包括上層的菌肉又包括下層的菌褶部分；此時平板培養(yǎng)基溫度在60°C左右，尚未凝固，用組織塊的菌肉部分蘸取少量未凝固培養(yǎng)基，菌褶部分不與培養(yǎng)基接觸，將組織塊粘于培養(yǎng)皿蓋內表面正中間，菌褶部分向下，組織塊與培養(yǎng)基距離0.6cm ;蓋上蓋封口保存，在25°C黑暗條件下正置培養(yǎng)，組織塊的菌肉部分向菌褶供給營養(yǎng)，使菌褶成熟并噴灑孢子，成熟的孢子噴灑至培養(yǎng)基上萌發(fā)成純菌絲體。2.如權利要求1所述的一種高效分離松茸菌種的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基配方為: 桑黃菌絲體6d發(fā)酵液200ml/L，馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂14g/L，維生素Al.5mg/L、維生素 BJ.5mg/L 和維生素 B22.5mg/L ； 所述的桑黃菌絲體6d發(fā)酵液:在300ml H)液體培養(yǎng)基中接入桑黃斜面種，斜面種培養(yǎng)基為PDA，25°C避光培養(yǎng)7d，25°C振蕩培養(yǎng)，160r/min，培養(yǎng)6d后，過濾得到發(fā)酵液；桑黃菌種來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏號:桑黃DLlOl CCTCC M 2011137。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高效分離松茸菌種的方法，方法是利用松茸的孢子分離，夾取松茸的組織塊，組織塊既包含菌褶又包含菌肉部分，粘于培養(yǎng)皿蓋內表面正中間，菌褶部分向下，成熟后的菌褶可以噴灑大量孢子，松茸孢子落到培養(yǎng)基上即可萌發(fā)成純菌絲體。利用該方法及培養(yǎng)基分離松茸菌種的成功率高達90％以上，且操作簡單易行，所需材料少；組織塊與培養(yǎng)基沒有直接接觸，避免了一些雜菌污染，大大降低了污染率；使用本發(fā)明中的培養(yǎng)基培養(yǎng)松茸孢子，萌發(fā)率高，菌絲粗壯，生長速度快，形成明顯的氣生菌絲。本發(fā)明可以解決目前松茸利用菌褶分離成功率不理想、易污染、菌絲在培養(yǎng)基上生長速度極其緩慢，難以迅速擴增等問題。
【IPC分類】C12N1/14, A01G1/04
【公開號】CN105132289
【申請?zhí)枴緾N201510425357
【發(fā)明人】鄒莉, 王世新, 孫婷婷, 崔嶸, 張國權, 李晶瑩, 張健
【申請人】東北林業(yè)大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年7月17日