一種超輕水干細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種以超輕水為溶劑的干細(xì)胞培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，使用干細(xì)胞的技術(shù)被認(rèn)為是治療不可治愈疾病的新途徑。干細(xì)胞是一種能夠不斷自我更新的細(xì)胞，并能增生、分裂、分化成其他各種成熟的細(xì)胞。干細(xì)胞可按不同的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。按它們的來源可分為胚胎干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞；按它們的增生和分化的能力可分為全潛能、多潛能和單潛能的干細(xì)胞；按它們的所能夠分化成的細(xì)胞可分為神經(jīng)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、血液干細(xì)胞等；按它們的成熟的程度可分為胚胎干細(xì)胞和成熟組織干細(xì)胞。
[0003]諸多研究表明干細(xì)胞不僅可以自我更新，在條件合適的情況下能分化成其他功能細(xì)胞，因此干細(xì)胞有望成為治療人類疑難疾病的有效手段。然而，干細(xì)胞在正常成體組織中含量甚微，在體外如何快速擴(kuò)增與培養(yǎng)干細(xì)胞是研究干細(xì)胞的作用機(jī)制及探索其在人類疾病治療方法的重要技術(shù)。
[0004]水(H2O)由2個(gè)氫原子和I個(gè)氧原子組成，氫原子有3個(gè)同位素:質(zhì)量為I的氫
(H)，也稱氕，與氧原子結(jié)合生成輕水(H2O);質(zhì)量為2的重氫(D)，也稱氘，與氧原子結(jié)合生成重水(D2O);質(zhì)量為3的超重氫(T)，也稱氚，它含量極微，可忽略不計(jì)。普通水中，氘和氕的比率(D/Η)大約是1: 6600，即水中的體積分?jǐn)?shù)為0.015% (150mg/L)。通常把氘體積分?jǐn)?shù)低于0.015%的水稱為低氖水(deuterium-depleted water，DDW)，又稱超輕水。超輕水中的氘量低于天然水，是采用先進(jìn)技術(shù)，把自然界水中的一部分氘去掉，降低了水中的氘含量。
[0005]國際最新研究結(jié)果和科學(xué)試驗(yàn)表明:氘對(duì)生命體的生存和繁衍有害，進(jìn)入生命體后很難代謝出去，高含量的氘對(duì)生命體的代謝、遺傳、酶素等都有不良影響，是一種導(dǎo)致生物衰老、病變、癌變及至死亡的有害物質(zhì)。而含氘量偏低的超輕水，進(jìn)入生命體后具有吸收快、滲透力高、溶解力強(qiáng)的特點(diǎn)，能有效代謝生命體的物質(zhì)，吸納有益營養(yǎng)，排除有害物質(zhì)。這些情況對(duì)動(dòng)物如此，對(duì)植物如此，對(duì)人類也是如此。
[0006]超輕水具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖的效果，延長干細(xì)胞細(xì)胞的傳代次數(shù)，不影響其分化的潛能，具有很高的科研和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種以超輕水為溶劑的干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0009]—種超輕水干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑、超輕水，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0010]所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白5_25g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l-10g/L，α I 酸性糖蛋白 0.l_5g/L，a 2-HS-糖蛋白 0.l_5g/L，載脂蛋白 A I 0.05_5g/L，載脂蛋白A II 0.05-5g/L，血液結(jié)合素0.01_2g/L，腺苷脫氨酶0.05_5g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.03-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-2g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.01-lg/Lo
[0011]更進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白7-20g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l_7g/L，α I酸性糖蛋白0.5_3g/L，a 2_HS_糖蛋白0.5_3g/L，載脂蛋白A I
0.l_3g/L，載脂蛋白A II 0.l_3g/L，血液結(jié)合素0.02-1.5g/L，腺苷脫氨酶0.l_2g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.05-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-1.5g/L，胰島素或類胰島素功能替代品 0.01-0.8g/L0
[0012]更進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白15g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2g/L，α I酸性糖蛋白0.7/L，a 2_HS_糖蛋白0.7g/L，載脂蛋白A I 0.3g/L，載脂蛋白A II 0.3g/L，血液結(jié)合素0.lg/L，腺苷脫氨酶0.15g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.lg/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.05g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.04g/Lo
[0013]更進(jìn)一步地，所用的超輕水含氘量為50ppm。
[0014]更進(jìn)一步地，所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基pH值為7.2。
[0015]本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中除常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞所需培養(yǎng)基成分，特別加入超輕水，以超輕水為溶劑，溶解培養(yǎng)基中其他成分。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，超輕水具有促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖的效果，對(duì)正常前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞克隆形成有促進(jìn)作用，并且不影響正常細(xì)胞前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞核增殖抗原PCNA蛋白的表達(dá)水平的效果。所以特別添加到干細(xì)胞培養(yǎng)基中，進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)。
[0016]本發(fā)明提供的一種干細(xì)胞培養(yǎng)基，與常規(guī)培養(yǎng)基相比，該培養(yǎng)基能大大加速干細(xì)胞的生長速度并延長干細(xì)胞細(xì)胞的傳代次數(shù)，又不影響其分化的潛能。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)人體骨髓間干細(xì)胞增殖的加速作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0018]圖2為本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)人體臍帶干細(xì)胞增殖的加速作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明提供的一種干細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)其具體操作方法進(jìn)行進(jìn)一步闡述。
[0020]實(shí)施例1，第一種超輕水配置培養(yǎng)基
[0021]基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制:將DMEM/F12培養(yǎng)基干粉溶解于800ml滅菌的超輕水中，加入3g NaHCO3,用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100ml0
[0022]本發(fā)明所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白15g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2g/L，α?酸性糖蛋白0.7/L，a2-HS_糖蛋白0.7g/L，載脂蛋白A I 0.3g/L，載脂蛋白AII 0.3g/L，血液結(jié)合素0.lg/L，腺苷脫氨酶0.15g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.lg/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.05g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.04g/Lo
[0023]用基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解上述培養(yǎng)基添加劑，再用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.2，用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，在4°C下避光保存。
[0024]實(shí)施例2，第二種超輕水配置培養(yǎng)基
[0025]基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制:將DMEM/F12培養(yǎng)基干粉溶解于800ml滅菌的超輕水中，加入3g NaHCO3,用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100ml0
[0026]本發(fā)明所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白5g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白lg/L, α I酸性糖蛋白0.1/L, a 2_HS_糖蛋白0.lg/L，載脂蛋白A I 0.05g/L，載脂蛋白AII 0.05g/L，血液結(jié)合素0.01g/L，腺苷脫氨酶0.05g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.03g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.01g/Lo
[0027]用基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解上述培養(yǎng)基添加劑，再用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.2，用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，在4°C下避光保存。
[0028]實(shí)施例3，第三種超輕水配置培養(yǎng)基
[0029]基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制:將DMEM/F12培養(yǎng)基干粉溶解于800ml滅菌的超輕水中，加入3g NaHCO3,用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至100ml0
[0030]本發(fā)明所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白25g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白10g/L，α I酸性糖蛋白5/L，a 2_HS_糖蛋白5g/L，載脂蛋白A I 5g/L，載脂蛋白A II 5g/L，血液結(jié)合素2g/L，腺苷脫氨酶5g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白2g/L，胰島素或類胰島素功能替代品lg/L。
[0031]用基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解上述培養(yǎng)基添加劑，再用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH至7.2，用0.22 μ m的濾膜過濾除菌，在4°C下避光保存。
[0032]實(shí)施例4，人體骨髓間干細(xì)胞培養(yǎng)
[0033]測(cè)試培養(yǎng)基:常規(guī)培養(yǎng)基組分:DMEM/F12基本培養(yǎng)基，10%胎牛血清(FBS);本發(fā)明的培養(yǎng)基。
[0034]受試的干細(xì)胞為人體骨髓間干細(xì)胞。
[0035]將細(xì)胞按照10-20%的密度接種，接種后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)(37°C，5% C02)。通過MTT法每隔12小時(shí)測(cè)一次細(xì)胞密度。
[0036]圖1為本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖中可以看出，經(jīng)本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞比經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出增殖速率快，得到的細(xì)胞數(shù)量多，代次間穩(wěn)定。
[0037]實(shí)施例5，人體臍帶干細(xì)胞培養(yǎng)
[0038]測(cè)試培養(yǎng)基:常規(guī)培養(yǎng)基組分:DMEM/F12基本培養(yǎng)基，10%胎牛血清(FBS);本發(fā)明的培養(yǎng)基。
[0039]受試的干細(xì)胞為人體臍帶干細(xì)胞。將細(xì)胞按照10-20%的密度接種，接種后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)(37°C，5% C02)。通過MTT法每隔12小時(shí)測(cè)一次細(xì)胞密度。
[0040]圖2為本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從圖中可以看出，經(jīng)本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的干細(xì)胞比經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出增殖速率快，得到的細(xì)胞數(shù)量多，代次間穩(wěn)定。由此，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)干細(xì)胞的擴(kuò)增與常規(guī)的培養(yǎng)基相比達(dá)到100%細(xì)胞密度的時(shí)間大大縮短。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以超輕水為溶劑的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基組分包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加劑、超輕水；培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白5-25g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l-10g/L，α I酸性糖蛋白0.l_5g/L，a 2_HS_糖蛋白0.l_5g/L，載脂蛋白A I0.05-5g/L，載脂蛋白A II 0.05-5g/L，血液結(jié)合素0.01_2g/L，腺苷脫氨酶0.05_5g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.03-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-2g/L，胰島素或類胰島素功能替代品 0.0l-lg/Lo2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白7_20g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白l_7g/L，α I酸性糖蛋白0.5_3g/L，a 2_HS_糖蛋白 0.5-3g/L，載脂蛋白 A I 0.l_3g/L，載脂蛋白 A II 0.l_3g/L，血液結(jié)合素 0.02-1.5g/L，腺苷脫氨酶0.l_2g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.05-2g/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.01-1.5g/L，膜島素或類膜島素功能替代品0.01-0.8g/L03.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基添加劑為:人血白蛋白15g/L，植物源性重組人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白2g/L，α I酸性糖蛋白0.7/L，a 2_HS_糖蛋白0.7g/L，載脂蛋白A I 0.3g/L，載脂蛋白A II 0.3g/L，血液結(jié)合素0.lg/L，腺苷脫氨酶0.15g/L，絲氨酸蛋白酶抑制蛋白0.lg/L，人轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白0.05g/L，胰島素或類胰島素功能替代品0.04g/Lo4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的超輕水含氘量為50ppmo6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述的超輕水含氘量為50ppm。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或6所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基pH值為7.2。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基pH值為7.2。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基pH值為7.2。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以超輕水為溶劑配制的干細(xì)胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基特點(diǎn)在于是以超輕水為溶劑。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠快速擴(kuò)增干細(xì)胞，同時(shí)又不影響干細(xì)胞的潛能，使干細(xì)胞擴(kuò)增速度是常規(guī)培養(yǎng)基的3倍以上。并適用于多種干細(xì)胞的培養(yǎng)。具有很高的研究應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】C12N5/071, C12N5/0775
【公開號(hào)】CN105154396
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510673253
【發(fā)明人】柯香文
【申請(qǐng)人】大連世紀(jì)新源技術(shù)開發(fā)有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年10月16日