一種強(qiáng)分泌生產(chǎn)克氏原螯蝦pmca蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效分泌生產(chǎn)克氏原螯蝦質(zhì)膜Ca2+-ATPase (PMCA)蛋白的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]如何實(shí)現(xiàn)無/弱副作用的人工卵巢發(fā)育調(diào)控一直是經(jīng)濟(jì)蝦蟹養(yǎng)殖的重要難題之一。目前人們雖已摸索出不少促蝦蟹卵巢快速成熟方法，如控溫、控光、強(qiáng)化營養(yǎng)條件、激素處理等，但眼柄切除仍是不少蝦蟹人工育苗生產(chǎn)中促進(jìn)親蝦卵巢快速成熟及產(chǎn)卵的最常用、最有效方法。目前在蝦蟹繁殖季節(jié)，人工切除雌性蝦蟹的單側(cè)眼柄用以促進(jìn)卵巢同步發(fā)育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少國家較為普遍應(yīng)用于多種海洋和淡水經(jīng)濟(jì)蝦蟹(如斑節(jié)對蝦、大西洋龍蝦、鋸緣青蟹等)的規(guī)?；B(yǎng)殖中。然而，應(yīng)用實(shí)踐中會出現(xiàn)無法避免的副作用:切除眼柄后易致親體蛻皮周期縮短、死亡率上升、卵子質(zhì)量下降等不良后果。眼柄切除誘導(dǎo)蝦蟹類卵巢快速發(fā)育成熟(簡稱卵巢“眼柄切除效應(yīng)”)存在相似的分子機(jī)制，深入闡明該分子機(jī)制將非常有助于發(fā)掘到新的、更合理的人工生殖調(diào)控分子靶點(diǎn)，從而指導(dǎo)發(fā)展可替代眼柄切除、無/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，對于經(jīng)濟(jì)蝦蟹類人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要價(jià)值?？耸显?下(Procambarus clarkii)，俗稱龍4下、小龍4下，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目，是具較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，是研究蝦蟹類卵巢“目艮柄切除效應(yīng)”分子機(jī)制的一種非常好的代表動(dòng)物。
[0003]PMCA蛋白在細(xì)胞內(nèi)的主要作用是在Ca2+信號刺激后做精細(xì)的排Ca 2+掃尾工作，并長效地維持靜息狀態(tài)下胞內(nèi)Ca2+濃度，受到CaM的正調(diào)控，是鈣信號通路(calciumsignaling pathway)的重要調(diào)控分子。我們前期的研究表明calcium signaling pathway在克氏原螯蝦“眼柄切除效應(yīng)”的卵巢發(fā)育早期很可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。深入研究克氏原螯4下calcium signaling pathway在“眼柄切除效應(yīng)”誘導(dǎo)卵巢快速發(fā)育成熟中的作用和調(diào)控機(jī)制，首先需要獲得大量高活性的PMCA蛋白，并用以制備PMCA蛋白單/多克隆抗體。因此我們采用生物安全級的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重組表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建高效分泌表達(dá)克氏原螯蝦PMCA蛋白的基因工程菌，同時(shí)建立高產(chǎn)量發(fā)酵方法，為后續(xù)深入研究克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應(yīng)”的分子機(jī)制奠定重要基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效分泌表達(dá)克氏原螯蝦PMCA蛋白的基因工程菌，是將克氏原螯蝦PMCA基因以pMA0911為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilis WB400、WB600或WB800中的一種。
[0005]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilis WB600。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法，成功分泌表達(dá)了克氏原螯蝦PMCA蛋白，主要包括以下步驟:(I)PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成PMCA基因序列，(2)將PMCA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA09ll(wapA)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911_PMCA ; (3)隨后將pMA0911-PMCA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600，篩選驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子。
[0007]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，表達(dá)質(zhì)粒pMA0911自身信號肽替換為wapA信號肽。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供應(yīng)用上述基因工程菌分泌生產(chǎn)PMCA蛋白的方法，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5-8%接種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量50% -60%的發(fā)酵罐中，通氣量0.8-1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速300_400r/min，pH不作控制，37 °C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8_12g/L，硫酸銅
0.10-0.15mM0
[0009]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以7%接種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量1.6L的3L發(fā)酵罐中，通氣量1.2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸銅0.13mM。
[0010]本發(fā)明還提供一種高效分泌表達(dá)克氏原螯蝦PMCA蛋白的方法，以重組表達(dá)了克氏原螯蝦PMCA基因的枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)克氏原螯蝦PMCA蛋白。
[0011]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將PMCA基因與表達(dá)質(zhì)粒PMA09Il(WapA)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911-PMCA，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600，獲得重組菌；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8-12g/L，硫酸銅0.10-0.15mM ;于37 °C通風(fēng)發(fā)酵。
[0012]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果:本發(fā)明首次以枯草芽孢桿菌為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)了克氏原螯蝦PMCA蛋白的高效分泌表達(dá)，重組PMCA蛋白的表達(dá)量約占上清液總蛋白量的60%，產(chǎn)量約1.06mg/mL,目前國際上無任何有關(guān)重組表達(dá)克氏原螯蝦PMCA蛋白的報(bào)道。
【具體實(shí)施方式】
[0013]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0014]下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0015]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0016]實(shí)施例1重組質(zhì)粒pMA0911-PMCA的構(gòu)建。
[0017]克氏原螯蝦PMCA基因的序列(GenBank登錄號:AY455931)，設(shè)計(jì)引物PMCA-1:(5' -TCAGGAGTCGACATGGGCGACGATGCCAATAGTTC-3')和 PMCA-2: (5' -ACTGAGAAGCTTTCACAGAGCGAGTGGCATCCCTGAG-3')，利用PCR將PMCA基因的DNA編碼框5 ’和3 ’兩側(cè)分別弓丨入Sal I和Hind I II限制性酶切位點(diǎn)(下劃線表示)；通過雙酶切、分子連接等基因操作將PMCA基因插入到表達(dá)質(zhì)粒pMA0911 (wapA)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911_PMCA。
[0018]實(shí)施例2SDS-PAGE分析B.subtilis WB600基因工程菌分泌表達(dá)的克氏原螯蝦PMCA蛋白。
[0019]在卡那霉素濃度為50yg/mL的LB培養(yǎng)基中接種基因菌單克隆，37°C、100r/min培養(yǎng)過夜。隨后將100 μ L過夜培養(yǎng)的菌液接種于10mL (含50 μ g/mL卡那霉素與0.13mM硫酸銅)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C、200r/min搖床培養(yǎng)24h，隨后取出發(fā)酵液，8000r/min離心1min得到上清液，即為粗酶液。進(jìn)一步利用離子交換層析法對粗酶液進(jìn)行分離純化。取粗酶液和純化后的酶液進(jìn)行12 %的SDS-PAGE蛋白電泳。上述相關(guān)方法均采用常規(guī)操作步驟。
[0020]實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基條件的優(yōu)化。
[0021]對發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米淀粉、蛋白胨及酵母抽提物濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并對發(fā)酵最佳溫度進(jìn)行研究，玉米淀粉濃度為26g/L時(shí)PMCA蛋白產(chǎn)量最高，達(dá)到0.755mg/mL ;蛋白胨濃度為14g/L、酵母抽提物濃度為10g/L、發(fā)酵溫度37°C時(shí)，CaM蛋白產(chǎn)量可進(jìn)一步提高到
0.910mg/mL 左右。
[0022]實(shí)施例4利用摸索出的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行3L發(fā)酵罐規(guī)模的克氏原螯蝦PMCA蛋白發(fā)酵生產(chǎn)。
[0023]重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，菌液轉(zhuǎn)入(7%接種量)3L發(fā)酵罐，裝液量1.6L，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸銅0.13mM。通氣量
1.2vvm,攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)40h后發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)發(fā)酵液中克氏原螯蝦PMCA蛋白產(chǎn)量最高，約1.06mg/mL。SDS-PAGE分析發(fā)酵上清液總蛋白顯示明顯特異表達(dá)條帶，條帶分子量與預(yù)期大小分子量?131.0kD—致。在此條件下，重組克氏原螯蝦PMCA蛋白的表達(dá)量約占上清液總蛋白量的60 %，全為可溶性活性狀態(tài)。
[0024]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高效分泌生產(chǎn)克氏原螯蝦質(zhì)膜Ca 2+-ATPase (PMCA)蛋白的基因工程菌，其特征在于，是將克氏原螯蝦PMCA基因以pMA0911為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建得到的基因工程菌，所述枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌WB400、WB600或WB800中的一種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述PMCA基因的序列為GenBank登錄號:AY455931。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌是B.subtilisffB600o4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:(I)PCR擴(kuò)增或化學(xué)合成PMCA基因序列；(2)將PMCA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA0911連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911-PMCA ； (3)將重組質(zhì)粒pMA0911-PMCA轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，篩選驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子。5.權(quán)利要求1-3任一所述基因工程菌在分泌生產(chǎn)PMCA蛋白中的應(yīng)用方法。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，主要包括以下步驟:將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以5-8%接種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量50% -60%的發(fā)酵罐中，通氣量0.8-1.0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速300-400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22_32g/L，蛋白胨 12-16g/L，酵母抽提物 8-12g/L，硫酸銅 0.10-0.15mM。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將重組菌用種子培養(yǎng)基活化后，以7%接種量菌液轉(zhuǎn)入裝液量1.6L的3L發(fā)酵罐中，通氣量1.2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，pH不作控制，37°C培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉26g/L，蛋白胨14g/L，酵母抽提物10g/L，硫酸銅0.13mM08.一種高效分泌表達(dá)生產(chǎn)克氏原螯蝦PMCA蛋白的方法，其特征在于，以重組表達(dá)了克氏原螯蝦PMCA基因的枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)PMCA蛋白。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，將PMCA基因與表達(dá)質(zhì)粒pMA0911連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA0911-PMCA，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600，獲得重組菌；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為玉米淀粉22-32g/L，蛋白胨12-16g/L，酵母抽提物8-12g/L，硫酸銅0.10-0.15mM，于37 °C通風(fēng)發(fā)酵。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分泌生產(chǎn)克氏原螯蝦質(zhì)膜Ca2+-ATPase(PMCA)蛋白的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以克氏原螯蝦PMCA基因，構(gòu)建分泌表達(dá)載體pMA0911-PMCA并轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株WB600中，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了高效分泌表達(dá)生產(chǎn)。本發(fā)明利用基因工程方法高效制備出高活性重組克氏原螯蝦PMCA蛋白，為后續(xù)針對克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應(yīng)”分子機(jī)制的深入研究奠定了重要基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1/21, C12N9/14, C12N15/75, C12N15/55, C12R1/125
【公開號】CN105219690
【申請?zhí)枴緾N201510651855
【發(fā)明人】管政兵, 水燕, 廖祥儒, 蔡宇杰, 戴紫雯
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月10日