一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及棉花栽培領(lǐng)域，具體涉及一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利用基因工程技術(shù)對棉花進(jìn)行遺傳改良已取得重要進(jìn)展。棉花莖尖具有直接分化再生的特點(diǎn)，一經(jīng)轉(zhuǎn)化就可以在適當(dāng)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)葉、根的形成而獲得轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖轉(zhuǎn)化方法不僅能夠解決基因型依賴性問題，還可縮短轉(zhuǎn)化周期和提高移栽成活率。。然而以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化為主的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前存在轉(zhuǎn)化效率低下的問題，大部分植物的轉(zhuǎn)化率為1%左右，這個問題也成為了限制轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的主要因素。研究表明，農(nóng)桿菌浸泡受體植物材料時，只有表層的少數(shù)受創(chuàng)傷細(xì)胞有可能被轉(zhuǎn)化，而受體材料中的大部分內(nèi)部細(xì)胞沒有機(jī)會接觸到農(nóng)桿菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述冋題，本發(fā)明提供了一種提尚棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其可有效提尚轉(zhuǎn)基因效率明以及轉(zhuǎn)基因棉花的結(jié)鈴率。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
一種提尚棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，包括如下步驟:
51、將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在6000-11000rpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液；
52、將棉花無菌苗莖尖浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，在20-25°C下，4800-8200rpm離心5-10min，轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中，靜置并超聲波處理15-20分鐘；
53、處理結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖，取出，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，轉(zhuǎn)移到含有濃度為0.2-0.5mg/L的6-糖基氨基嘌呤、濃度為0.1-0.3mg/L的吲哚-3-乙酸和濃度為0.05?0.2mg/L的α -萘乙酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；
54、共培養(yǎng)結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖在選擇壓力下進(jìn)行篩選。
[0005]優(yōu)選地，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為改良MS+0.04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/LIBA+35g/L蔗糖培養(yǎng)基。
[0006]優(yōu)選地，所述改良MS包括營養(yǎng)元素和有機(jī)物，營養(yǎng)元素包括蛋氨酸錳10mg/L、，一水硫酸鋅5mg/L、一水硫酸亞鐵17mg/L、氨基酸螯合鎂5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、堿式硫酸銅4.5mg/L、卩比啶酸絡(luò)0.065mg/L、碘酸|丐0.3mg/L、賴氨酸6mg/L、三氯化六氨合鈷0.065mg/L、蛋白鍺0.75mg/L、碘酵母6mg/L。
[0007]優(yōu)選地，所述有機(jī)物包括鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇27mg/L。
[0008]優(yōu)選地，所述棉花無菌苗莖尖為生長2-3天的棉花無菌苗莖尖。
[0009]優(yōu)選地，所述步驟S2中超聲波輸出功率為320±20W，超聲波處理的頻率為68KHz ?72KHz。
[0010]本發(fā)明具有以下有益效果:
通過設(shè)置不同的激素(組合)，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，使轉(zhuǎn)化周期縮短，轉(zhuǎn)化率提高；選用生長2-3天的無菌苗莖尖為外植體，保證外植體的較強(qiáng)分裂和轉(zhuǎn)化能力；將棉花無菌苗莖尖與農(nóng)桿菌混合后在合理的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心沉降處理和超聲波處理，超聲波處理可以增加棉花無菌苗莖尖表面的創(chuàng)傷程度，離心沉降不僅可以增加棉花無菌苗莖尖的創(chuàng)傷面積，而且能使農(nóng)桿菌在離心力作用下深入到棉花無菌苗莖尖內(nèi)部，顯著提高了植物轉(zhuǎn)基因效率。
【具體實(shí)施方式】
[0011]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0012]以下實(shí)施例中所使用的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為改良MS+0.04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/L IBA+35g/L蔗糖培養(yǎng)基；其中，改良MS包括營養(yǎng)元素和有機(jī)物，營養(yǎng)元素包括蛋氨酸猛10mg/L、，一水硫酸鋅5mg/L、一水硫酸亞鐵17mg/L、氨基酸螯合鎂5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、堿式硫酸銅4.5mg/L、卩比啶酸絡(luò)0.065mg/L、碘酸|丐0.3mg/L、賴氨酸6mg/L、三氯化六氨合鈷0.065mg/L、蛋白鍺0.75mg/L、碘酵母6mg/L，所述有機(jī)物包括鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸卩比卩多醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇27mg/L，所使用的棉花無菌苗莖尖為生長2-3天的棉花無菌苗莖尖。
[0013]實(shí)施例1
51、將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在6000rpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液；
52、將棉花無菌苗莖尖浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，在20°C下，4800rpm離心5min，轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中，靜置并超聲波處理15分鐘；其中，超聲波輸出功率為300超聲波處理的頻率為68KHz ；
53、處理結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖，取出，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，轉(zhuǎn)移到含有濃度為0.2mg/L的6-糖基氨基嘌呤、濃度為0.lmg/L的吲哚-3-乙酸和濃度為0.05mg/L的α-萘乙酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；
54、共培養(yǎng)結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖在選擇壓力下進(jìn)行篩選。
[0014]實(shí)施例2
51、將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在llOOOrpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液；
52、將棉花無菌苗莖尖浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，在25°C下，8200rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中，靜置并超聲波處理20分鐘；其中，超聲波輸出功率為340超聲波處理的頻率為72KHz ；
53、處理結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖，取出，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，轉(zhuǎn)移到含有濃度為0.5mg/L的6-糖基氨基嘌呤、濃度為0.3mg/L的吲哚-3-乙酸和濃度為0.2mg/L的α-萘乙酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；
54、共培養(yǎng)結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖在選擇壓力下進(jìn)行篩選。
[0015]實(shí)施例3
51、將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在8500條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液；
52、將棉花無菌苗莖尖浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，在22.5°C下，6500rpm離心7.5min，轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中，靜置并超聲波處理17.5分鐘；其中，超聲波輸出功率為320W，超聲波處理的頻率為70KHz ；
53、處理結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖，取出，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，轉(zhuǎn)移到含有濃度為0.35mg/L的6-糖基氨基嘌呤、濃度為0.2mg/L的吲哚-3-乙酸和濃度為0.125mg/L的α-萘乙酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；
54、共培養(yǎng)結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖在選擇壓力下進(jìn)行篩選。
[0016]經(jīng)檢測，上述方法可以使棉花轉(zhuǎn)基因效率提高一倍。
[0017]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在6000-11000rpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液； 52、將棉花無菌苗莖尖浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，在20-25°C下，4800-8200rpm離心5-10min，轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中，靜置并超聲波處理15-20分鐘； 53、處理結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖，取出，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，轉(zhuǎn)移到含有濃度為0.2-0.5mg/L的6-糖基氨基嘌呤、濃度為0.1-0.3mg/L的吲哚-3-乙酸和濃度為0.05?0.2mg/L的α -萘乙酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)； 54、共培養(yǎng)結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖在選擇壓力下進(jìn)行篩選。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基為改良 MS+(X 04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/L IBA+35g/L 蔗糖培養(yǎng)基。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，所述改良MS包括營養(yǎng)元素和有機(jī)物，營養(yǎng)元素包括蛋氨酸錳10mg/L、，一水硫酸鋅5mg/L、一水硫酸亞鐵17mg/L、氨基酸螯合鎂5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、堿式硫酸銅4.5mg/L、吡啶酸鉻0.065mg/L、碘酸鈣0.3mg/L、賴氨酸6mg/L、三氯化六氨合鈷0.065mg/L、蛋白鍺0.75mg/L、碘酵母 6mg/L。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，所述有機(jī)物包括鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸卩比卩多醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇27mg/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，所述棉花無菌苗莖尖為生長2-3天的棉花無菌苗莖尖。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，其特征在于，所述步驟S2中超聲波輸出功率為320 ±20W，超聲波處理的頻率為68KHz?72KHz。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高棉花轉(zhuǎn)基因效率的方法，包括如下步驟：將包含有目的基因的農(nóng)桿菌活化到轉(zhuǎn)化狀態(tài)后，在6000-11000rpm條件下離心并重懸，得到農(nóng)桿菌重懸液；將棉花無菌苗莖尖浸泡到農(nóng)桿菌重懸液中，離心處理后，轉(zhuǎn)移到無菌玻璃器皿中，靜置并超聲波處理15-20分鐘；處理結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖，取出，用無菌濾紙吸干殘留的菌液，轉(zhuǎn)移到含有6-糖基氨基嘌呤、吲哚-3-乙酸和α-萘乙酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；共培養(yǎng)結(jié)束后，將侵染后的棉花莖尖在選擇壓力下進(jìn)行篩選。本發(fā)明可有效提高轉(zhuǎn)基因效率明以及轉(zhuǎn)基因棉花的結(jié)鈴率。
【IPC分類】C12N15/84, A01H5/00
【公開號】CN105274138
【申請?zhí)枴緾N201510745828
【發(fā)明人】馬燕斌, 張樹偉, 王新勝, 吳霞, 李燕娥
【申請人】山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年11月3日