一種瓊脂糖酶的固定化方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明所屬酶工程研究開發(fā)技術(shù)領域。本發(fā)明涉及殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶的 方法研究，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓊膠是一種重要的海藻多糖，主要由瓊膠糖和硫瓊膠組成。瓊膠酶降解瓊膠糖，根 據(jù)其作用方式不同，可以把瓊膠酶分為兩類：α-瓊膠酶和β-瓊膠酶。α-瓊膠酶裂解瓊 膠糖的α_1，3-糖苷鍵，生成以β-D-半乳糖為非還原性末端和以3,6_內(nèi)醚-α-L-半乳 糖為還原性末端的瓊寡糖列；β-瓊膠酶裂解瓊膠糖的β-1，4-糖苷鍵，生成以β-D-半乳 糖為還原性末端和以3,6-內(nèi)醚-a-L-半乳糖為非還原性末端的新瓊寡糖系列。瓊膠酶降 解過程具有得率高、污染小和產(chǎn)物的安全性高等優(yōu)點，是降解瓊膠糖最有潛力的方法。
[0003] 瓊膠酶降解瓊膠糖生產(chǎn)瓊寡糖產(chǎn)品已廣泛應用于食品業(yè)，化妝品業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)， 例如作為天然的防腐劑、淀粉老化抑制劑、功能性食品基料、抗氧化劑等。同時瓊膠酶在海 藻的單細胞分離、酶解破壁制備原生質(zhì)體等過程具有重要的使用價值，是一種海藻遺傳工 程的工具酶；在分子生物學方面，利用瓊膠酶降解瓊膠糖從瓊膠糖凝膠中回收DNA和RNA， 已經(jīng)被證明是最好的方法之一；瓊膠酶也用于海藻多糖的結(jié)構(gòu)研究，用瓊膠酶水解某些海 藻的多糖，測定其水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，進而推測多糖的結(jié)構(gòu)，是行之有效的方法。
[0004] 但目前該酶的應用研究主要是對游離酶，但游離酶穩(wěn)定性差，保質(zhì)期短，重復利用 率低，往往使應用成本增高而限制了其應用。所以在酶的應用研究中，固定化酶的研究是生 物技術(shù)領域中新興的一門技術(shù)。
[0005] 酶的固定化是指用載體材料將酶限制于一定空間內(nèi)進行催化反應，固定化酶可回 收及反復連續(xù)利用的一類技術(shù)。固定化酶保留了游離酶高效專一、溫和的催化性質(zhì)，同時又 克服了游離酶的缺點，具有高穩(wěn)定性、易分離純化、回收使用、操作簡便等優(yōu)點。然而，廣泛 投入工業(yè)化應用的固定化酶卻不多。因此，進一步開發(fā)更經(jīng)濟適用的固定化方法，使更多的 酶取得工業(yè)上的廣泛應用，仍是科技工作者追求的目標。
[0006] 酶的固定化方法常用的是：吸附法、交聯(lián)法、共價結(jié)合和法包埋法。在此基礎上還 出現(xiàn)了上述方法的結(jié)合法等
[0007] 酶固定化研究中，良好的載體是固定化酶成功的關(guān)鍵。所以在酶固定化領域，作為 固定化載體的篩選和制備就成為了主要研究方向。
[0008] 甲殼素是由乙酰胺基葡萄糖以β_1，4鏈連接而成的天然線性高聚物，是自然界 中僅次于纖維素的第二可再生資源。殼聚糖是甲殼素經(jīng)脫乙?；磻玫降漠a(chǎn)物，分子結(jié) 構(gòu)中含有豐富的游離氨基。選擇殼聚糖作為固定化載體是基于它來源豐富，具親水性，生物 相容性以及抗微生物分解特性等。殼聚糖氨基與戊二醛基形成schiff堿，在膠囊表面形成 一層致密的保護膜，可增加微膠囊球的強度，這就是吸附-交聯(lián)法固定化酶。
[0009] 由于目前瓊脂糖酶的固定化國內(nèi)外還沒人研究，所以利用廉價的殼聚糖作為固定 化載體固定瓊脂糖酶具有較大的理論和實踐意義。而本方法研究的目的是開發(fā)殼聚糖的應 用領域，并可以增強瓊脂糖酶在工業(yè)、醫(yī)學、食品、環(huán)境保護等領域的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 1.本發(fā)明涉及用殼聚糖固定化瓊脂糖酶的方法，其特征在殼聚糖固定化瓊脂糖酶 的方法，包括以下過程：
[0011] 步驟（一）：用1.5-2% (V/V)乙酸配制1 : 20 (W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解；
[0012] 步驟（二）：將步驟（一）的殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚 糖將凝聚成白色顆粒，過濾收集殼聚糖珠；
[0013] 步驟（三）：將步驟（二）的殼聚糖珠用蒸餾水洗滌至中性；
[0014] 步驟（四）：將步驟（三）的殼聚糖珠用0· 2m〇l/L、pH7. 6的磷酸緩沖溶液浸泡過 夜；
[0015] 步驟（五）：取步驟（四）中的殼聚糖珠載體2.5-5g，加入2.5 %的戊二醛 20-25ml，水浴振蕩0. 5小時，室溫交聯(lián)5-6小時，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯(lián)載體；
[0016] 步驟（六）：在步驟（五）中的殼聚糖珠交聯(lián)載體中加入10_15mL稀釋的瓊脂糖 酶液，攪拌均勻，4°C固定2-3小時，用磷酸緩沖液沖洗；
[0017] 步驟（七）：將步驟（六）中的固定化酶抽真空得到固定化瓊脂糖酶。
[0018] 2.根據(jù)本發(fā)明所述的制備固定化瓊脂糖酶的載體是殼聚糖微球。
【附圖說明】
[0019] 圖1是pH值對酶活性的影響圖，圖2是溫度對酶活性的影響圖，圖3是游離酶和 固定化酶的熱穩(wěn)定性圖。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明所述的涉及殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶方法包括以下實施例，下面的實施 例可進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0021] 實施例1 :pH值對酶活性的影響
[0022] 平行取制備好的殼聚糖固定化酶0. 5g和相應的游離酶，在不同pH(4. 0-9. 0)條件 下分別加底物與游離酶及固定化酶作用，分別測定其酶活力，結(jié)果如圖1所示。
[0023] 圖1表明，游離酶的最適pH值為8. 0,隨著pH值的升高酶活性下降；對固定化酶而 言，在本實驗條件下，當pH值達到8. 5的時候酶活性達到最大值，固定化使酶的最適pH往 堿性方面升高0. 5個單位，符合酶和載體結(jié)合后的基本規(guī)律。
[0024] 實施例2 :溫度對酶活性的影響
[0025] 平行取制備好的殼聚糖固定化酶0. 5g和相應的游離酶，在不同溫度（30°C_80°C) 條件下分別加底物與游離酶及固定化酶作用，分別測定其酶活力，結(jié)果如圖2所示。
[0026] 由圖2可知，游離瓊脂酶在40°C下表現(xiàn)出最高活力，隨溫度升高，活力急劇下降， 酶開始失活，但對固定化酶而言，在40_60°C范圍內(nèi)均有較大酶活，50°C時酶活力達最大值， 固定化酶耐熱性顯著提高。
[0027] 實施例3 :游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性
[0028] 平行取制備好的殼聚糖固定化酶0. 5g和相應的游離酶，在不同溫度（20°C_80°C) 條件下保溫0. 5h，然后加底物與其作用，分別測定其酶活力，結(jié)果如圖3所示。
[0029] 由圖3可知，酶液在40 °C以下短暫保溫對酶活影響較小，溫度進一步提升至50°C 時對游離酶活性影響增加，損失約為27. 36%，而對固定化酶活力影響仍較小。在60°C時， 游離酶的活性很低，而固定化酶活約為50%，70°C時酶基本都已完全沒有活性，說明固定化 酶的熱穩(wěn)定性高于游離酶。
[0030] 實施例4 :固定化酶的操作穩(wěn)定性
[0031] 取固定化酶0. 5g，加0. 5%瓊脂糖底物1. 5ml與之反應，連續(xù)操作6次，分別測定 6次反應后的酶活力大小，結(jié)果如表1。
[0032] 表1固定化瓊脂酶的操作穩(wěn)定性
[0033]
[0034] 酶的穩(wěn)定性可以從反應的產(chǎn)物（還原糖）收率來衡量。而產(chǎn)物的收率可以間接的 從酶活力的大小來判斷。因此，從表1可以看出，在使用第1次的時候固定化酶有較高的活 力，說明還原糖的量較高，也就是說產(chǎn)物的收率較高；第2次以后固定化酶活力略有減少， 隨著使用次數(shù)的增加，酶活力雖然逐漸減小，但使用6次后酶活力仍有83.8左右。說明固 定化瓊脂酶具有固定化酶的顯著特點，即可重復利用性。
[0035] 實施例5 :固定化瓊脂酶對瓊脂糖的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化率
[0036] 準確稱取取固定化瓊脂酶0. 5g，加0. 5%瓊脂糖底物1. 5ml與之反應，加入2ml緩 沖液，在50°C下酶解lh，測其轉(zhuǎn)化率，其平均轉(zhuǎn)化率可達92. 6 %。
[0037] 實施例6 :固定化瓊脂糖酶的穩(wěn)定性
[0038] 在最佳條件下所得固定化酶，其活力回收為77. 6%，在室溫下貯存4個月，測得活 力回收72.8% .可見，固定化瓊脂糖酶的穩(wěn)定性優(yōu)良。
【主權(quán)項】
1. 瓊脂糖酶固定化的方法，其特征在于用殼聚糖微球固定化瓊脂糖酶。包括以下過 程： 步驟（一）：用1.5-2% (V/V)乙酸配制1 : 20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解； 步驟（二）：將步驟（一）的殼聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氫氧化鈉溶液中，殼聚糖將 凝聚成白色顆粒，過濾收集殼聚糖珠； 步驟（三）：將步驟（二）的殼聚糖珠用蒸餾水洗滌至中性； 步驟（四）：將步驟（三）的殼聚糖珠用〇· 2mol/L、ρΗ7·6的磷酸緩沖溶液浸泡過夜； 步驟（五）：取步驟（四）中的殼聚糖珠載體2. 5-5g，加入2. 5%的戊二醛20-251111，水 浴振蕩〇.5小時，室溫交聯(lián)5-6小時，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯(lián)載體； 步驟（六）：在步驟（五）中的殼聚糖珠交聯(lián)載體中加入10_15mL稀釋的瓊脂糖酶液， 攪拌均勻，4°C固定2-3小時，用磷酸緩沖液沖洗； 步驟（七）：將步驟（六）中的固定化酶抽真空得到固定化瓊脂糖酶。2. 根據(jù)本發(fā)明所述的制備固定化瓊脂糖酶的載體是殼聚糖。
【專利摘要】本發(fā)明所屬酶工程研究開發(fā)技術(shù)領域。本發(fā)明涉及一種瓊脂糖酶的固定化方法研究。用1.5-2％(V/V)乙酸配制1：20(W/V)的殼聚糖溶液，充分溶解；溶解后的殼聚糖溶液逐滴滴入1mol/L氫氧化鈉溶液中，過濾收集殼聚糖珠；用蒸餾水洗滌至中性，再用0.2mo1/L、pH7.6的磷酸緩沖溶液浸泡過夜；取浸泡的殼聚糖珠載體2.5-5g，加入2.5％的戊二醛20-25ml，水浴振蕩0.5小時，室溫交聯(lián)5-6小時，磷酸緩沖液沖洗殼聚糖珠交聯(lián)載體；在殼聚糖珠交聯(lián)載體中加入10-15mL稀釋的瓊脂糖酶液，攪拌均勻，4℃固定2-3小時，用磷酸緩沖液沖洗；抽真空得到固定化瓊脂糖酶。本發(fā)明制備固定化酶的方法，載體廉價易得，工藝簡單，條件溫和，對酶活性損失小，酶活回收率可達到77.6％。
【IPC分類】C12N11/04, C12N11/10
【公開號】CN105349518
【申請?zhí)枴緾N201510251158
【發(fā)明人】李曉梅
【申請人】菏澤家政職業(yè)學院
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年5月14日