一株地衣芽孢桿菌及包含該菌株的飼料添加劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及功能微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株地衣芽抱桿菌及包含該菌株 的飼料添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著水產(chǎn)品需求量的增加及水產(chǎn)品貿(mào)易的國(guó)際化發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)近年來(lái)發(fā)展突 飛猛進(jìn)。但是，水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化和高密度規(guī)模日益擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和疾病的危害給 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用 易產(chǎn)生耐藥性菌株問(wèn)題，并且存在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)殘留的問(wèn)題，因此尋找抗生素替代品成為 必然。
[0003] 益生菌能夠參與動(dòng)物體內(nèi)微生物平衡，直接通過(guò)增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)腸內(nèi)有害微生物群落 的抑制作用，或通過(guò)增強(qiáng)非特異性免疫功能來(lái)預(yù)防疾病，進(jìn)而間接起到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作 用，提高動(dòng)物飼料的轉(zhuǎn)化率。因此，近些年對(duì)于益生菌的篩選成為本領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)，也 對(duì)水產(chǎn)飼料配方的改進(jìn)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株新型地衣芽抱桿菌及包含該菌株的水產(chǎn)飼料添加劑。所 述地衣芽抱桿菌篩選自刺參養(yǎng)殖池，能夠顯著抑制病原菌，提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病 力，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)飼料領(lǐng)域。
[0005] 本發(fā)明一方面提供了一株地衣芽抱桿菌DN29度acilluslicheniformisDN29)， 已于2015年8月10日保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號(hào) 為CCTCCN0:M2015482。
[0006] 本發(fā)明另一方面提供了包含上述地衣芽抱桿菌的飼料添加劑。
[0007] 所述復(fù)合制劑還包括多糖、維生素、中草藥、酶和乳化劑。
[0008] 本發(fā)明還提供了上述地衣芽抱桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的有益效果：
[0010] 本發(fā)明篩選到的地衣芽抱桿菌DN29,能有效抑制燦爛弧菌和假交替單胞菌等病原 菌，減少養(yǎng)殖動(dòng)物病害發(fā)生的幾率，同時(shí)還能作為飼料添加劑，顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的 利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。所述地衣芽抱桿菌DN29可作為益生菌應(yīng)用于刺參的養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò) 程中，對(duì)刺參的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，還可W有效提高刺參的免疫力及對(duì)燦爛弧菌的 抵抗能力。與對(duì)照組相比，添加地衣芽抱桿菌DN29的益生菌組中刺參稚參的特定生長(zhǎng)率、 細(xì)胞密度、吞隧活性、呼吸爆發(fā)活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶活性分別提高了 23. 5%、 58. 7%、70%、77. 4%、9. 7%和0. 9%，而累計(jì)死亡率下降了 32% ;添加包含地衣芽抱桿菌 DN29的復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑的益生菌組中刺參幼參的特定生長(zhǎng)率、細(xì)胞密度、吞隧活性、呼 吸爆發(fā)活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶活性分別提高了 23.4%、17.4%、130%、26. 1%、 51. 8%和13. 8%，累計(jì)死亡率下降了 36. 1%，取得了顯著的技術(shù)效果。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1菌株的分離、篩選與鑒定 [001引 1、樣品
[0013] 采集于青島市膠南刺參養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖池底泥。
[0014] 2、抬養(yǎng)基：
[0015] 1)2216E海水培養(yǎng)基：蛋白陳5g，酵母浸出物Ig，憐酸鐵O.Olg，海水1000ml， 抑7. 6-7. 8,配制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min。
[0016] 2)TSB培養(yǎng)基：膜蛋白腺大豆肉湯30g，氯化鋼15g，蒸饋水1000ml，pH7. 4-7. 6,配 制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min。
[0017]扣MRS培養(yǎng)基：蛋白腺lOg，牛肉膏l(xiāng)Og，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐溫-801ml， 憐酸二氨鐘2g，巧樣酸二錠2g，乙酸鋼5g，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 15g，蒸饋水1000ml， P冊(cè).2-6. 4,加入15-20g的瓊脂W配制固體培養(yǎng)基，115°C滅菌20min。
[001引 3、篩選方法
[0019] 取底泥樣品，加入無(wú)菌生理鹽水，振蕩搖勻化(28°C，150巧m)，使底泥中細(xì)菌充分 散布于生理鹽水中，10倍梯度稀釋?zhuān)謩e接種于2216E、TSB和MRS固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng) 2地-4她。選取均勻清晰的單菌落，劃線純化細(xì)菌。單菌落依此命名為DN1、DN2、DN3……、 DN30。
[0020] W致病菌--燦爛弧菌（Vibriosplendidus)和假交替單胞菌 (Pseudoalteromonasnigrifaciens)為指示菌，采用平板括抗法篩選益生菌。在涂有指示 菌的平板上點(diǎn)種待篩選的細(xì)菌菌液，28°C恒溫培養(yǎng)，4化內(nèi)觀察點(diǎn)種區(qū)周?chē)欠癯霈F(xiàn)抑菌透 明區(qū)或覆蓋區(qū)。最終，申請(qǐng)人篩選到10株病原括抗菌對(duì)上述兩種致病菌均有不同程度的抑 制作用，具體結(jié)果如表1所示。
[0021] 表1潛在益生菌株抑菌情況
[0022]
[0023]
[0024]從表1的數(shù)據(jù)可W看出，本發(fā)明篩選到的10株病原接抗菌中菌株DN29對(duì)燦爛弧 菌和假交替單胞菌的抑菌能力最強(qiáng)。
[00巧]4、菌株鑒定
[0026] 1)菌落形態(tài)特征：將上述菌株DN29重新劃線培養(yǎng)，其呈現(xiàn)為白色、不透明、菌落凸 起、邊緣整齊，鏡檢顯示其細(xì)胞為短桿狀。
[0027]。提取上述菌株DN29的基因組DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增leSrRNA序列，通過(guò)測(cè)序 BLAST比對(duì)分析，其與已公布的多株地衣芽抱桿菌的16SrRNA序列相似度高達(dá)99%，鑒定 證實(shí)菌株DN29為地衣芽抱桿菌度acilluslicheni化rmis)，與生化鑒定結(jié)果一致。
[0028] 3)將上述菌株DN29命名為地衣芽抱桿菌DN29度acilluslicheniformisDN29)， 已于2015年8月10日保藏于中國(guó)武漢武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號(hào) 為CCTCCN0:M2015482。
[0029] 實(shí)施例2 :地衣芽抱桿菌DN29對(duì)刺參稚參生長(zhǎng)、免疫及抗病力的影響
[0030] 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和益生菌組，每組分別設(shè)置Ξ個(gè)平行。每個(gè)平行刺參稚參40頭（初 始體重0. 198 + 0. 008)。其中，對(duì)照組W鼠尾藻粉為基礎(chǔ)飼料，益生菌組是在基礎(chǔ)飼料中按 109CRJ/g添加上述地衣芽抱桿菌DN29,混合均勻投喂刺參稚參。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)海水系統(tǒng) 開(kāi)展，共進(jìn)行30天，每天投巧兩次，每天換水50%，海水鹽度28-3化pt，pH8. 0 + 0. 3,水溫 20-22 °C，溶氧充足。
[0031] 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)刺參稚參進(jìn)行計(jì)數(shù)并稱(chēng)重，計(jì)算其特定生長(zhǎng)率。每個(gè)平 行中隨機(jī)取6頭刺參稚參，自刺參腹腔抽取體腔液，1:1加入抗凝劑，取一部分抗凝體 腔液直接用于計(jì)數(shù)體腔細(xì)胞，測(cè)定吞隧活性、呼吸爆發(fā)活力；另一部分抗凝體腔液離屯、 lOmin(3000Xg，4°C)收集體腔細(xì)胞沉淀，繼而超聲破碎后，再次離屯、lOmin(3000Xg，4°C) 所得上清液為體腔細(xì)胞破碎上清液（CLS)，用于酪氧化酶（PO)活力和酸性憐酸酶（AC巧活 力的測(cè)定。W燦爛弧菌為病原菌，腹腔注射刺參，進(jìn)行2周的觀察，統(tǒng)計(jì)累積死亡率。
[0032] 表2地衣芽抱桿菌DN29對(duì)刺參幼苗生長(zhǎng)、免疫及抗病力的影響
[0033]
[0034]
[0035] 注：不同的字母表示差異顯著（P< 0. 05)。
[0036] 從表2的結(jié)果可W看出，與對(duì)照組相比，添加了地衣芽抱桿菌DN29的益生菌組中 刺參稚參的特定生長(zhǎng)率、細(xì)胞密度、吞隧活性、呼吸爆發(fā)活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶 活性分別提高了 23. 5%、58. 7%、70%、77. 4%、9. 7%和0. 9%，而累計(jì)死亡率下降了 32%， 從而說(shuō)明本發(fā)明所述地衣芽抱桿菌DN29對(duì)刺參稚參的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用，可W有效 提高刺參稚參的免疫力及對(duì)燦爛弧菌的抵抗能力，因此可W作為益生菌廣泛應(yīng)用于刺參稚 參的養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中。
[0037] 實(shí)施例3 :包含地衣芽抱桿菌DN29的復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑對(duì)刺參幼參生長(zhǎng)的影響
[0038] 本實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和益生菌組，每組分別設(shè)置Ξ個(gè)平行，每個(gè)平行30頭刺參幼參 (初始體重4. 928 + 0. 008)。W鼠尾藻粉、魚(yú)粉、面粉等為基礎(chǔ)原料，配制成含蛋白21. 5%， 含脂肪4. 5%的基礎(chǔ)飼料。其中，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，益生菌組是先在基礎(chǔ)飼料中按 109C即/g添加地衣芽抱桿菌DN29,按1. 25g/kg和200mg/kg的比例分別添加葡聚糖和膚聚 糖，混合均勻后再進(jìn)行飼喂。
[0039] 實(shí)驗(yàn)在循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周，每日按海參體重的2-3%投喂巧料，根 據(jù)攝食量情況隨時(shí)對(duì)投巧量進(jìn)行調(diào)整，每天早晚各投喂一次，并吸底排污一次。實(shí)驗(yàn)期間溶 氧> 6mg/l，溫度17 +rC，鹽度28-30,P冊(cè).0 + 0. 3。實(shí)驗(yàn)在循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)持續(xù) 每日按海參體重的投喂巧料，
[0040] 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)刺參幼參進(jìn)行計(jì)數(shù)并稱(chēng)重，計(jì)算特定生長(zhǎng)率。從每個(gè)平行中 隨機(jī)取6頭刺參，自海參腹腔抽取體腔液，1:1加入抗凝劑，取一部分抗凝體腔液直接用于 計(jì)數(shù)體腔細(xì)胞，測(cè)定吞隧活性、呼吸爆發(fā)活力；另一部分抗凝體腔液離屯、l〇min(3000Xg， 4°C)收集體腔細(xì)胞沉淀，繼而超聲破碎后，再次離屯、lOmin(3000Xg，4°C)所得上清液為體 腔細(xì)胞破碎上清液（CLS)，用于酪氧化酶（P0)活力和酸性憐酸酶（AC巧活力的測(cè)定。W燦 爛弧菌為病原菌，腹腔注射刺參，進(jìn)行2周的觀察，統(tǒng)計(jì)累積死亡率。
[0041] 表3包含地衣芽抱桿菌DN29的復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫及抗病力的影 響
[0042]

[0043] 注：不同的字母表示差異顯著（P< 0. 05)。
[0044] 從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W看出，與對(duì)照組相比，添加本發(fā)明所述包含地衣芽抱桿菌 DN29的復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑的益生菌組中刺參的特定生長(zhǎng)率、細(xì)胞密度、吞隧活性、呼吸爆發(fā) 活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶活性分別提高了 23. 4%、17. 4%、130%、26. 1 %、51. 8% 和13. 8%，累計(jì)死亡率下降了 36. 1%。從而說(shuō)明本發(fā)明提供的復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑能有效促 進(jìn)刺參幼參的生長(zhǎng)，提高幼參的抗病能力。
[0045] 綜上，本發(fā)明提供的地衣芽抱桿菌DN29既能有效抑制病原菌，減少養(yǎng)殖動(dòng)物病害 發(fā)生的幾率，同時(shí)還能作為飼料添加劑，顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物 生長(zhǎng)，有助于提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，本發(fā)明提供的地衣芽抱桿菌DN29還可W與其 他物質(zhì)，例如多糖類(lèi)免疫增強(qiáng)劑、維生素類(lèi)、中草藥等進(jìn)行復(fù)配，應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、郵蟹等水產(chǎn)動(dòng) 物的飼料中，能夠使水產(chǎn)動(dòng)物的主要免疫指標(biāo)值提高5-10%，全周期存活率提高10-20%， 生長(zhǎng)率提高10-15%，飼料系數(shù)降低5-10%，應(yīng)用前景廣闊。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株地衣芽孢桿菌，其保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2015482。2. -種包含權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌的飼料添加劑。3. 如權(quán)利要求2所述的飼料添加劑，其特征在于，所述的飼料添加劑還包括多糖、維生 素、中草藥、酶或乳化劑中的一種或多種的組合。4. 權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及功能微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一株新型地衣芽孢桿菌DN29(Bacillus？licheniformis？DN29)，其保藏編號(hào)為CCTCC？NO：M2015482。本發(fā)明篩選到的地衣芽孢桿菌DN29，能有效抑制燦爛弧菌和假交替單胞菌等病原菌，減少養(yǎng)殖動(dòng)物病害發(fā)生的幾率，同時(shí)還能作為飼料添加劑，顯著提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。所述地衣芽孢桿菌DN29可作為益生菌應(yīng)用于刺參的養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)刺參的生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，還可以有效提高刺參的免疫力及對(duì)燦爛弧菌的抵抗能力。CCTCC NO:M201548220150810
【IPC分類(lèi)】A23K10/18, A23K50/80, C12R1/10, C12N1/20
【公開(kāi)號(hào)】CN105368750
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510896838
【發(fā)明人】周怡, 于朝磊, 許宏偉, 茍萬(wàn)里, 陳琳
【申請(qǐng)人】青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月4日