可溶性牙鲆npy重組蛋白獲得方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及可溶性牙解NPY重組蛋白，具體的說是一種可溶性牙解NPY重組蛋白 獲得方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膚Y-種內(nèi)源性的促食欲因子，屬于膜多膚家族，最早由化temoto從豬腦中 提取的一種含有36氨基酸的單鏈多膚。NPY的結(jié)構(gòu)與生物活性密切相關(guān)。NPY廣泛分布在 中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中，存在于器官、機(jī)體及腺體中，比如屯、臟、腦中等。大量研究 表明NPY能夠刺激動物攝食。通過腦室注射和腹腔注射NPY能夠促進(jìn)魚類攝食。
[000引牙解，俗稱牙化為解蝶魚類，錄屬于蝶形目、牙解科、牙解屬，是我國和日韓等國 的重要海水養(yǎng)殖魚類。提高養(yǎng)殖牙解生長速度是提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)效率中的一個關(guān)鍵過 程。
[0004] 利用細(xì)菌進(jìn)行重組表達(dá)蛋白是生物工程中常用方法，其培養(yǎng)簡單，時間短，適合于 工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明在于提供一種可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] 一種可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，構(gòu)建NPY表達(dá)載體，表達(dá)載體重組表達(dá)， 再經(jīng)蛋白純化、去內(nèi)毒素、脫鹽，而后于緩沖體系內(nèi)，得可溶性的牙解重組NPY蛋白。
[0008] 所述構(gòu)建NPY表達(dá)載體W牙解NPYcDNA序列為模板f-NPY-F和f-NPY-R為引物 進(jìn)而PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物插入pPROEX?HTa質(zhì)粒的化0I酶切位點并轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-21 (DE3)， 即得到NPY表達(dá)載體；
[0009]所述引物f-NPY-F為 5' -ATGCATCCTAACTTGGTGAG-3';和f-NPY-R為 5'-GCAGT GATGTGGATTCAACGTTGATTGC-3f。
[0010] 將NPY表達(dá)載體蛋白于LB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)至A600達(dá)到0. 8,而后經(jīng)誘導(dǎo)劑 誘導(dǎo)表達(dá)NPY重組蛋白。
[0011] 所述NPY重組蛋白的菌體經(jīng)過B-perOliermo,U巧處理、離屯、后獲得的上清液；將 收集的上清液用與其同體積的清洗緩沖液1稀釋，得稀釋的蛋白樣品，稀釋的蛋白樣品過 50%Ni-NTA純化柱4°C解育過夜，解育后依次經(jīng)清洗緩沖液1、清洗緩沖液2清洗純化柱， 而后經(jīng)洗脫緩沖液洗脫，即得純化蛋白；
[001引 其中，清洗緩沖液1為5mM化H2PO4, 30mMNaCl，20mM咪挫；
[001引 清洗緩沖液2為5mMNaHzPCM，30mM化Cl，50mM咪挫；
[0014]洗脫緩沖液為 5mMNaHzPCM，30mM化Cl，250mM咪挫。
[001引所述將純化后的蛋白溶液通過Amicon駭叫tra-15(Millipore，USA)離屯、柱濃縮 脫鹽（去咪挫），將純化后的蛋白溶液離屯、濃縮，而后濃縮液中加入含5mMNaHzPCM，30mM 化Cl的PBS緩沖液重懸，再經(jīng)離屯、濃縮，直至除去咪挫得可溶性的重組牙解NPY蛋白。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點：
[0017] 本發(fā)明是大腸桿菌獲得重組蛋白是可溶性的，避免了包涵體蛋白變性、復(fù)性過程， 保證了蛋白的活性，優(yōu)化了蛋白保存緩沖液，避免了純化、去內(nèi)毒素、脫鹽后蛋白變性沉淀， 維持了其可溶的狀態(tài)，從而維持了其活性。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實施例提供的pPROEX?HTa(Lifetechnologies)組成示意圖。
[0019] 圖2為本發(fā)明實施例提供蛋白可溶性分析。
[0020] 圖3為本發(fā)明實施提供的可溶性蛋白純化分析。
[0021] 圖4本發(fā)明實施提供的可溶性蛋白腹腔注射對攝食的影響。
[0022] 圖5本發(fā)明實施提供的可溶性蛋白腹腔注射對體重的影響。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合實施例詳述本發(fā)明的實驗步驟。
[0024] 本發(fā)明是具有活性的牙解NPY重組蛋白的獲得W及純化的方法。本發(fā)明所獲得的 可溶性重組蛋白為牙解NPY的全長蛋白，獲得重組蛋白為可溶性的具有活性的蛋白，經(jīng)純 化后該蛋白仍然保持可溶性，從而可W制成注射劑，將注射劑腹腔注射到牙解等海水魚中 可W促進(jìn)其攝食，提高生長速度，同時溶液狀態(tài)下的NPY蛋白可W噴灑到固體顆粒巧料或 與其它巧料、藥劑等混合。
[0025] 實施例1
[0026]NPY表達(dá)載體的構(gòu)建
[0027] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的牙解NPYcDNA序列（GenBankaccession NO.AB055211. 1)，設(shè)計全長NPY(f-NPY)的引物（見表1)，使用P化高保真酶擴(kuò)增目的片段， 插入pPROEX?HTa質(zhì)粒的化0I酶切位點并轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-21 (DE3)，經(jīng)LB+Amp培養(yǎng)基 篩選陽性菌落，提取質(zhì)粒后分別Wf-NPY-F/R為引物進(jìn)行PCR鑒定并進(jìn)行測序，篩選到編碼 框正確的陽性重組菌分別命名為f-NPY/HTa(參見圖1)。
[002引表1引物序列
[0029]
[0030] 實施例2
[0031]NPY重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0032] 挑取f-NPY/HTa單菌落于5血LB培養(yǎng)基中37°C，200巧m過夜培養(yǎng)，次日W1 %的 接種量接于50mLLB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至A600達(dá)到0. 8,此時取出ImL培養(yǎng)液作為非誘導(dǎo) 對照樣品，然后向剩余培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑0. 8mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖巧）誘導(dǎo)重 組蛋白的表達(dá)，培養(yǎng)時間為3小時，而后于6000巧m離屯、5min后棄上清，用50μLPBS和 50μL2XSDS-PAGE上樣緩沖液重懸菌體，同時將對照樣品也于600化pm離屯、5min后棄上 清，用50μLPBS和50μL2XSDS-PAGE上樣緩沖液重懸菌體，所得重懸菌體分別煮沸5min 后進(jìn)行SDS-PAGE檢測使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。
[003引實施例3
[0034] 蛋白可溶性檢測
[0035] 將上述大量培養(yǎng)的誘導(dǎo)菌體于6000巧m離屯、20分鐘，棄上清。然后按照2-5血/ 克菌體（濕重）比例加入B-per(Thermo，肥）緩沖液?；靹蚝?，室溫靜止30分鐘，然后 1500化pm離屯、30分鐘，將上清液倒入一個新的離屯、管中。沉淀中再加入上述溶解菌體所 用B-per緩沖液體積的一半的B-per緩沖液，混勻、離屯、后將上清液倒入新的離屯、管，重復(fù)2 次。將上清液混勻，用50μL上清液和50μL2XSDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸5min后 進(jìn)行SDS-PAGE檢測，使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色（參見圖2)。
[0036] 由圖2可見所提取的蛋白位于上清液中，即為可溶性的。
[0037] 實施例4 [00測蛋白純化
[0039] 在將上述（實施例3)獲得上清液中的蛋白純化的過程中發(fā)現(xiàn)蛋白容易發(fā)生沉淀， 為此將純化緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后的整個過程如下：
[0040] 將上述（實施例3)得到的上清液用與其相同體積的清洗緩沖液U5mMNaHzPCM， 30mM化Cl，20mM咪挫）稀釋，得稀釋的蛋白樣品待用；
[0041] 將50 %Ni-NTA純化柱加入空柱中，待Ni-NTA保存液流凈后加入平衡緩沖液 度-per:清洗緩沖液1 (v/v) = 1:1)進(jìn)行平衡；
[004引按照1 :4(柱體積：上樣量，v/v)加入稀釋的蛋白樣品，4°C解育過夜，待全部通過Ni-NTA純化柱后，用8倍柱體積的清洗緩沖液1清洗純化柱，用8倍柱體積的清洗緩沖液 2巧mlNaHzPCM，30mM化C1，50mM咪挫）清洗緩沖柱，然后用4倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫 巧ml化H2PO4, 30mM化C1，250mM咪挫），ImL/管分布收集洗脫液。SDS-PAGE分析蛋白的純 度及管數(shù)，最后將所有高純度的蛋白混在一起（參見圖3)。由圖3可見純化后的蛋白純度 很局。
[004引實施例5
[0044]濃縮、脫鹽（去咪挫）緩沖液優(yōu)化
[004引將純化后的蛋白溶液通過Amicon?叫tra-15(Millipore，USA)離屯、柱濃縮脫鹽 (去咪挫），在此過程中發(fā)現(xiàn)蛋白容易產(chǎn)生沉淀，為此對濃縮脫鹽（去咪挫）過程進(jìn)行了優(yōu) 化。比如將24mL蛋白洗脫液離屯、后，濃縮至3血，先離屯、濃縮至3血，然后加入稀釋的PBS 緩沖液，離屯、6次后，每次查看上清液中是否出現(xiàn)蛋白沉淀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用1-5倍稀釋的PBS 緩沖液時都會出現(xiàn)沉淀，而在采用10倍稀釋的PBS緩沖液時沒有出現(xiàn)沉淀，并且蛋白得到 濃縮，因此采用10倍稀釋的PBS做為最后的濃縮、脫鹽的緩沖液。
[0046] 具體步驟如下：將上述純化后的蛋白溶液通過Amicon?叫tra-15(Millipore， USA)離屯、柱濃縮脫鹽（去咪挫），將純化后的蛋白溶液加入超濾管中，4000g，30min，補(bǔ)充加 入PBS(5mMNaH2P04,30mM化C1)，多次離屯、至咪挫濃度很低（<lmM)。
[0047] 實施例6
[0048] 腹腔注射分析NPY的促生長效果
[0049] 將上述得到的濃縮、脫鹽的NPY蛋白定量，然后稀釋到30ug/ml，然后采用腹腔注 射的方法Wlug/g體重的劑量注射到牙解中，同時注射同等劑量PBS為對照，30天后分析攝 食及體重情況。結(jié)果顯示注射NPY的牙解攝食較對照組有17%的增長（圖4)。在注射10 天左右，NPY組（20. 92g)和對照組（21. 03g)沒有差別，而在20天時NPY組較對照組出現(xiàn) 微小差異，而在30天時NPY組體重達(dá)到31. 05g，而對照組只有29. 05g(圖5)。經(jīng)過AN0VA t-檢驗分析發(fā)現(xiàn)NPY組和對照組的攝食和體重具有明顯的差異（p<0. 05)。
【主權(quán)項】
1. 一種可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，其特征在于：構(gòu)建NPY表達(dá)載體，表達(dá)載體 重組表達(dá)，再經(jīng)蛋白純化、去內(nèi)毒素、脫鹽，而后于緩沖體系內(nèi)，得可溶性的牙解重組NPY蛋 白。2. 按權(quán)利要求1所述的可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，其特征在于：所述構(gòu)建NPY 表達(dá)載體W牙解NPY CDNA序列為模板f-NPY-F和f-NPY-R為引物進(jìn)而PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物插入 pPROEXTMma質(zhì)粒的化O I酶切位點并轉(zhuǎn)化大腸桿菌化-21 〇)E3)，即得到NPY表達(dá)載體。3. 按權(quán)利要求2所述的可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，其特征在于：所述引物 f-NPY-F為 5' -ATGCATCCTAACTTGGTGAG-3';和f-NPY-R為 5'-GCAGTGATGTGGATTCAACGT TGATTGC-3< 。4. 按權(quán)利要求1所述的可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，其特征在于：將NPY表達(dá) 載體蛋白于LB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)至A600達(dá)到0. 8,而后經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)NPY重組蛋 白。5. 按權(quán)利要求1所述的可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，其特征在于：所述NPY重組 蛋白的菌體經(jīng)過B-per(Thermo，U巧處理、離屯、后獲得的上清液；將收集的上清液用與其同 體積的清洗緩沖液1稀釋，得稀釋的蛋白樣品，稀釋的蛋白樣品過50%Ni-NTA純化柱4°C 解育過夜，解育后依次經(jīng)清洗緩沖液1、清洗緩沖液2清洗純化柱，而后經(jīng)洗脫緩沖液洗脫， 即得純化蛋白； 其中，清洗緩沖液1為5mMNaH2P04,30mM化Cl，20mM咪挫； 清洗緩沖液2為5mMNaHzPCM, 30mM化Cl, 50mM咪挫； 洗脫緩沖液為5mMNaH2P04,30mM化Cl，250mM咪挫。6. 按權(quán)利要求1所述的可溶性牙解NPY重組蛋白獲得方法，其特征在于：所述將純化 后的蛋白溶液通過41[11〇〇11@叫付曰-15^111口〇成1]54)離屯、柱濃縮脫鹽（去咪挫），將純 化后的蛋白溶液離屯、濃縮，而后濃縮液中加入含5mMNaHzPCM, 30mM化Cl的PBS緩沖液重 懸，再經(jīng)離屯、濃縮，直至除去咪挫得可溶性的重組牙解NPY蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明涉及可溶性牙鲆NPY重組蛋白，具體的說是一種可溶性牙鲆NPY重組蛋白獲得方法。具體，構(gòu)建NPY表達(dá)載體，表達(dá)載體重組表達(dá)，再經(jīng)蛋白純化、去內(nèi)毒素、脫鹽，而后于緩沖體系內(nèi)，得可溶性的牙鲆重組NPY蛋白。本發(fā)明是大腸桿菌獲得重組蛋白是可溶性的，避免了包涵體蛋白變性、復(fù)性過程，保證了蛋白的活性，優(yōu)化了蛋白保存緩沖液，避免了純化、去內(nèi)毒素、脫鹽后蛋白變性沉淀，維持了其可溶的狀態(tài)，從而維持了其活性。
【IPC分類】C12N15/70, C07K14/46
【公開號】CN105368864
【申請?zhí)枴緾N201510981570
【發(fā)明人】譚訓(xùn)剛, 李美潔, 王倩, 隋玉嫘, 焦爽, 吳志昊, 尤鋒
【申請人】中國科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月24日