一種制備低分子降壓肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生化技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是以大豆分離蛋白液為原料，利用復(fù)合酶法制備低分子降壓肽，即同時運用三種水解酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)來水解大豆分離蛋白，再將水解液通過活性炭吸附、超濾等純化方法從中獲取較純的低分子大豆降壓肽。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是一種常見的心血管疾病，它發(fā)病率高，常伴有心臟、血管、肺以及腎臟等器官功能性或器質(zhì)性改變，是引發(fā)心、腦、腎和眼血管等各種并發(fā)癥和導(dǎo)致中風(fēng)、促進動脈粥樣硬化、冠心病的一個重要危險因子。高血壓發(fā)病率在發(fā)達國家達到20%以上，世界各國的平均發(fā)病率為10%?20%，且人群分布廣，包括老年人、中年人和兒童全世界每年因高血壓死亡的人數(shù)達1200萬。我國曾進行了三次全國性的高血壓普查，1959年的發(fā)病率是5.11 %, 1979?1980年發(fā)病率為7.73 %, 1990?1991年發(fā)病率為11.26 %。目前，我國現(xiàn)有高血壓患者己超過1.2億人口。因此，治療和預(yù)防高血壓病是當(dāng)今社會十分重要的課題。
[0003]高血壓一般有兩種類型:原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性的高血壓，前者主要是由于周圍小動脈血管口徑變小或血液粘滯度增加，造成外用阻力過高所致；而血容量與心輸出量的增高、血管的僵硬程度與血管的充盈程度均影響血壓的變化；同時植物性神經(jīng)系統(tǒng)對血壓的調(diào)節(jié)作用也是一個重要因素。繼發(fā)性的高血壓，也叫癥狀性高血壓，是在某些疾病過程中并發(fā)的血壓升高，其成因主要有內(nèi)分泌病、腎臟疾病、心臟功能異常等。
[0004]血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ang1tensinconverting enzyme., ACE)是一種含鋅的二肽酶，能被氯離子激活并具有較寬的底物特異性。ACE廣泛分布在哺乳動物的組織中。在腎素一血管緊張素系統(tǒng)(renin-ang1tensin system, RAS)和激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)中，ACE對機體血壓和心血管功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。抑制ACE的活性被認為是治療高血壓的一種重要而有效的方法。目前，大量高效、特異的ACE抑制劑在治療高血壓病和充血性心力衰竭中發(fā)揮著重要作用。
[0005]食物蛋白來源豐富，方便易得，用食物蛋白來生產(chǎn)活性肽成本較低、安全性高、適合大規(guī)模生產(chǎn)。來源于食品的降壓肽只對高血壓患者起到降壓的作用，對血壓正常者無降壓作用，不會產(chǎn)生降壓過度的問題；這些肽用食用級的酶在溫和條件下制得的，其安全性極高，無毒副作用；除了有降壓的功能外，還同時具有抗氧化、促消化、降血糖、抗血小板凝集、增強人體免疫力等作用；具有較高的熱穩(wěn)定性、水溶性等優(yōu)點，可作為功能因子添加到飲料、食品中去，市場前景極好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是生產(chǎn)較純的低分子大豆降壓肽。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:以大豆分離蛋白液為原料，利用復(fù)合酶法制備低分子降壓肽，即同時運用三種水解酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)來水解大豆分離蛋白，再將水解液通過活性炭吸附、超濾等純化方法從中獲取較純的低分子大豆降壓肽。本發(fā)明具有工藝簡單，操作安全，成本較低的特點，非常適用于規(guī)?；笊a(chǎn)。包括如下步驟:
(1)將底物濃度為4%?6%的大豆分離蛋白溶液在85°C水浴加熱預(yù)處理15min?30min;
(2)待料液冷卻到40°C?60 °C后，先加入E/S為6%?8%的堿性蛋白酶，pH 7.5?9.0條件下微波水浴加熱10?20 min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S為8%?10%的中性蛋白酶，溫度為50°C?60°C，pH7.5?9.0條件下酶解10?20 min ；
(4)最后再加入E/S為9%?11%的胰蛋白酶，溫度為50°C?60°C，pH7.5?9.0條件下酶解15?30 min ；
(5)料液用4kDa?2kDa的超濾膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa對料液超濾30min?50min ；
(6)超濾透過液經(jīng)沸水浴10?20min徹底滅酶處理后，再3000r?5000r/ min離心10?30min，收集上清液，真空冷凍干燥，即三酶水解大豆多肽。
【具體實施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0009]實施例1
以大豆分離蛋白液為原料，利用復(fù)合酶法制備低分子降壓肽，即同時運用三種水解酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)來水解大豆分離蛋白，再將水解液通過活性炭吸附、超濾等純化方法從中獲取較純的低分子大豆降壓肽。包括如下步驟:
(1)將底物濃度為4%的大豆分離蛋白溶液在85°C水浴加熱預(yù)處理20min;
(2)待料液冷卻到40°C°(:后，先加入E/S為6%的堿性蛋白酶，pH 8.0條件下微波水浴加熱10 min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S為8%的中性蛋白酶，溫度為50°C，pH8.0條件下酶解10 min ；
(4)最后再加入E/S為9%的胰蛋白酶，溫度為50°C，pH8.0條件下酶解15 min ；
(5)料液2kDa的超濾膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa對料液超濾30min;
(6)超濾透過液經(jīng)沸水浴lOmin徹底滅酶處理后，再3000r/ min離心lOmin，收集上清液，真空冷凍干燥，即三酶水解大豆多肽。
[0010]實施例2
(1)將底物濃度為5%的大豆分離蛋白溶液在85°C水浴加熱預(yù)處理20min;
(2)待料液冷卻到50°C后，先加入E/S為7%的堿性蛋白酶，pH8.5條件下微波水浴加熱15min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S為9的中性蛋白酶，溫度為55°C，pH8.5條件下酶角軍15min ；
(4)最后再加入E/S為10%的胰蛋白酶，溫度為55°C，pH8.5條件下酶解20 min ;
(5)料液用3kDa的超濾膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa對料液超濾40min ; (6)超濾透過液經(jīng)沸水浴15min徹底滅酶處理后，再4000r / min離心20min，收集上清液，真空冷凍干燥，即三酶水解大豆多肽。
[0011]實施例3
(1)將底物濃度為6%的大豆分離蛋白溶液在85°C水浴加熱預(yù)處理30min;
(2)待料液冷卻到60°C后，先加入E/S為8%的堿性蛋白酶，pH9.0條件下微波水浴加熱20 min;
(3)酶解后的料液中再加入E/S為10%的中性蛋白酶，溫度為60°C，pH9.0條件下酶解20 min ；
(4)最后再加入E/S為11%的胰蛋白酶，溫度為60°C，pH9.0條件下酶解30
min ；
(5)料液用4kDa的超濾膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa對料液超濾50min;
(6)超濾透過液經(jīng)沸水浴20min徹底滅酶處理后，再5000r/min離心30min，收集上清液，真空冷凍干燥，即三酶水解大豆多肽。
[0012]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種制備低分子降壓肽的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)將底物濃度為4%?6%的大豆分離蛋白溶液在85°C水浴加熱預(yù)處理15min?30min; (2 )待料液冷卻到40 °C?60 °C后，先加入E/S為6%?8%的堿性蛋白酶，pH 7.5?9.0條件下微波水浴加熱10?20 min; (3)酶解后的料液中再加入E/S為8%?10%的中性蛋白酶，溫度為50°C?60°C，pH7.5?9.0條件下酶解10?20 min ； (4)最后再加入E/S為9%?11%的胰蛋白酶，溫度為50°C?60°C，pH7.5?9.0條件下酶解15?30 min ； (5)料液用4kDa?2kDa的超濾膜于40°C，0.1MPa?0.2MPa對料液超濾30min?50min ； (6)超濾透過液經(jīng)沸水浴10?20min徹底滅酶處理后，再3000r?5000r/ min離心10?30min，收集上清液，真空冷凍干燥，即三酶水解大豆多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，大豆分離蛋白溶液的濃度為4%?6%，在85°C水浴加熱預(yù)處理15min?30min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，在溫度為40°C?60°C，pH7.5?9.0條件下，先加入E/S為6%?8%的堿性蛋白酶，微波水浴加熱10?20 min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，在溫度為50°C?60°C，pH7.5?9.0條件下再加入E/S為8%?10%的中性蛋白酶，酶解10?20 min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，溫度為50°C?60°C，pH7.5?9.0條件下，最后再加入E/S為9%?11%的胰蛋白酶酶解15?30 min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(5)中，料液用8kDa?4kDa的超濾膜于 40 °C，0.1MPa ?0.2MPa 對料液超濾 30min ?50min。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(6)中，超濾透過液經(jīng)沸水浴10?20min徹底滅酶處理后，再3000r?5000r / min離心10?30min，收集上清液，真空冷凍干燥，即三酶水解大豆多肽。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備低分子降壓肽的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以大豆分離蛋白液為原料,利用復(fù)合酶法制備低分子降壓肽,即同時運用三種水解酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶)來水解大豆分離蛋白,再將水解液通過活性炭吸附、超濾等純化方法從中獲取較純的低分子大豆降壓肽。本發(fā)明具有工藝簡單，操作安全，成本較低的特點，非常適用于規(guī)?；笊a(chǎn)。
【IPC分類】C07K1/34, C12P21/06
【公開號】CN105368903
【申請?zhí)枴緾N201510826578
【發(fā)明人】劉乃山, 宋立明, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月25日