一種從白耙齒菌中提取多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽的提取。更具體地，涉及一種從白耙齒菌中提取多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白耙齒菌(Irpex lacteus)為耙齒菌的一種，耙齒菌分為灰色、白色、褐色等幾個(gè)品種，白耙齒菌與其他幾個(gè)品種相比，其藥用價(jià)值最高，且生物活性是其他品種的近10倍。白耙齒菌是獨(dú)產(chǎn)于長(zhǎng)白山密林深處的一種珍貴的食藥用菌，只在雷雨天后進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。白耙齒菌含有多糖、肽、皂甙、有機(jī)酸、生物堿及17種氨基酸，以及多種細(xì)胞強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)素，具有軟化血管壁，恢復(fù)毛細(xì)血管彈性，促進(jìn)腎小球、腎小管的再生，改善腎小球的微循環(huán)，增加腎小球的血流量，提高腎小球的濾過(guò)功能，恢復(fù)腎臟的活力，尤其在治療腎炎，腎小球炎、尿蛋白等方面有顯著療效。
[0003]肽是兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸以肽鍵相連的化合物，因氨基酸的組份和順序各不相同而組成不同的肽。含兩個(gè)氨基酸的稱二肽，含三個(gè)的稱三肽，依次類推。肽是精準(zhǔn)的蛋白質(zhì)片斷，其分子只有納米般大小，腸胃，血管及肌膚皆極容易吸收在，在人體內(nèi)起重要生理作用及功能。具有活性的多肽稱為活性肽，又稱生物活性肽或生物活性多肽，可分為:多肽類激素、神經(jīng)多肽和腦肽、激肽、蛙皮肽和昆蟲肽等，目前，肽成為全世界研究的熱點(diǎn)、大量的國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明:不同的生物肽具有不同的結(jié)構(gòu)和生理功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血壓、免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、抑菌、降膽固醇等作用。
[0004]白耙齒菌由于其顯著的藥理活性越來(lái)越受到研究學(xué)者們的關(guān)注，目前在國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的報(bào)道中，對(duì)于白耙齒菌的研究多集中在對(duì)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)、多糖、氨基酸等活性成分及藥理活性上，而對(duì)于白耙齒菌的另外一種重要活性物質(zhì)一一肽的相關(guān)研究尤其是肽的制備未見報(bào)道，關(guān)于多肽的制備方法有很多，化學(xué)合成法成本比較高，且副反應(yīng)多；提取法過(guò)程復(fù)雜；基因重組法存在生產(chǎn)效率的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種從白耙齒菌中提取多肽的方法，該方法簡(jiǎn)單，且所得多肽純度達(dá)70%以上。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0007]—種從白耙齒菌中提取多肽的方法，包括如下步驟:
[0008]1)將白耙齒菌去雜，冷凍干燥，粉碎至40目，用超臨界C(V流體萃取法脫脂，得到白耙齒菌粉末；
[0009]2)向上述所得白耙齒菌粉末中加入質(zhì)量濃度為0.2-0.3%的NaOH溶液，于4°C溫度下靜置8-10h，每隔30-40min攪拌一次；
[0010]3)將步驟2)所得物離心，去除上清液；
[0011]4)向步驟3)所得溶液中加入質(zhì)量濃度5%的蛋白酶，將溶液PH調(diào)至7-8，加熱，恒溫酶解，酶解完全后，加熱至酶滅活，降溫至室溫，過(guò)濾得濾液；
[0012]5)將步驟4)所得濾液過(guò)5000道爾頓超濾膜超濾，得超濾液，凍干，所得凍干粉即為白耙齒菌多肽。
[0013]優(yōu)選地，步驟2)中，白耙齒菌粉末與NaOH溶液的質(zhì)量比為1:25-1:30 ;所述提取的時(shí)間為10-12h。
[0014]優(yōu)選地，步驟3)中，所述離心的離心速度為3000_3500r/min，離心時(shí)間為20-25mino
[0015]優(yōu)選地，步驟4)中，所述蛋白酶選自酶活力為50u/mg的木瓜蛋白酶或酶活力為1000u/mg的中性蛋白酶。
[0016]優(yōu)選地，步驟4)中，所述酶解的溫度為45-60 °C，酶解時(shí)間為3_5h。
[0017]本發(fā)明中，用超臨界C(V流體萃取法脫脂的具體方法是:將白耙齒菌粉末放入萃取池中，0)2和甲醇分別由C0 2栗和修飾劑栗打入各栗的腔體中，經(jīng)流體混合器混合后，流入萃取器中的集流腔，在集流腔壓力達(dá)27.6MPa，溫度達(dá)31°C后，進(jìn)入萃取池開始萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)，超臨界C(V流體經(jīng)限流器流入收集瓶后減壓排放，流體帶出的物質(zhì)溶于收集液中予以收集，在30、60、90、120min各收集1次，收集液減壓濃縮，干燥。
[0018]本發(fā)明的有益效果如下:
[0019]本發(fā)明的方法中采用凍干法將白耙齒菌冷凍干燥，且在低溫4°C條件下用NaOH提取出蛋白質(zhì)及肽類物質(zhì)，有效地保持了白耙齒菌中多肽的活性；進(jìn)一步的采用蛋白酶對(duì)提取物進(jìn)行酶解，不加入試劑發(fā)酵，安全無(wú)污染，投入生產(chǎn)設(shè)備少，且副反應(yīng)及附加產(chǎn)物少。
[0020]本發(fā)明研究工藝簡(jiǎn)單且成本低，易于操作和推廣，同時(shí)可有效提高產(chǎn)物的得率，采用超濾的方法又進(jìn)一步提高了所得多肽的純度。
【具體實(shí)施方式】
[0021]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]實(shí)施例1
[0023]從白耙齒菌中提取多肽的方法，包括如下步驟:
[0024]1)取100g白耙齒菌，去雜，冷凍干燥，并粉碎至40目，用超臨界C(V流體萃取法脫月旨。具體方法為:將白耙齒菌粉末放入萃取池中，C02和甲醇分別由C02栗和修飾劑栗打入各栗的腔體中，經(jīng)流體混合器混合后，流入萃取器中的集流腔，在集流腔壓力達(dá)27.6MPa，溫度達(dá)31°C后，進(jìn)入萃取池開始萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)，超臨界0)2流體經(jīng)限流器流入收集瓶后減壓排放，流體帶出的物質(zhì)溶于收集液中予以收集，在30、60、90、120min各收集1次，收集液減壓濃縮，干燥，得白耙齒菌粉末；
[0025]2)將白耙齒菌粉末溶于質(zhì)量濃度為0.3%的NaOH溶液中，白耙齒菌粉末與NaOH溶液的質(zhì)量比為1:25，在4°C溫度下靜置8h，每隔30min攪拌一次；
[0026]3)將步驟2)所得物在轉(zhuǎn)速為3000r/min的離心機(jī)中離心，離心時(shí)間為20min，去除離心后的上清液；
[0027]4)向步驟3)所得溶液中加入質(zhì)量濃度為5%的酶活力為50u/mg的木瓜蛋白酶，將溶液PH調(diào)至7，加熱，在45°C溫度下恒溫酶解3h，酶解完全后，高溫使酶滅活，降溫至室溫，過(guò)濾得濾液；
[0028]5)將步驟4)所得濾液過(guò)5000道爾頓超濾膜超濾，得超濾液，凍干，所得凍干粉即為白耙齒菌多肽。本方法白耙齒菌多肽的提取率為0.27%，提取得到的白耙齒菌多肽的純度為71%。
[0029]實(shí)施例2
[0030]從白耙齒菌中提取多肽的方法，包括如下步驟:
[0031]1)取100g白耙齒菌，去雜，冷凍干燥，并粉碎至40目，用超臨界C(V流體萃取法脫月旨。具體方法為:將白耙齒菌粉末放入萃取池中，C02和甲醇分別由C02栗和修飾劑栗打入各栗的腔體中，經(jīng)流體混合器混合后，流入萃取器中的集流腔，在集流腔壓力達(dá)27.6MPa，溫度達(dá)31°C后，進(jìn)入萃取池開始萃取，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)，超臨界0)2流體經(jīng)限流器流入收集瓶后減壓排放，流體帶出的物質(zhì)溶于收集液中予以收集，，在30、60、90、120min各收集1次，收集液減壓濃縮，干燥，得白耙齒菌粉末；
[0032]2)將白耙齒菌粉末溶于質(zhì)量濃度為0.3%的NaOH溶液中，白耙齒菌粉末與NaOH溶液的質(zhì)量比為1:30，在4°C溫度下靜置10h，每隔40min攪拌一次；
[0033]3)將步驟2)所得物在轉(zhuǎn)速為3500r/min的離心機(jī)中離心，離心時(shí)間為25min，去除離心后的上清液；
[0034]4)向步驟3)所得溶液中加入質(zhì)量濃度為5%的酶活力為1000u/mg的中性蛋白酶，將溶液PH調(diào)至8，加熱，在60°C溫度下恒溫酶解5h，酶解完全后，高溫使酶滅活，降溫至室溫，過(guò)濾得濾液；
[0035]5)將步驟4)所得濾液過(guò)5000道爾頓超濾膜超濾，得超濾液，凍干，所得凍干粉即為白耙齒菌多肽。本方法白耙齒菌多肽的提取率為0.36%，提取得到的白耙齒菌多肽的純度為72.4%。
[0036]顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從白耙齒菌中提取多肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將白耙齒菌去雜，冷凍干燥，粉碎至40目，用超臨界C(V流體萃取法脫脂，得到白耙齒菌粉末； 2)向上述所得白耙齒菌粉末中加入質(zhì)量濃度為0.2-0.3%的NaOH溶液，于4°C溫度下靜置8-10h，每隔30-40min攪拌一次； 3)將步驟2)所得物離心，去除上清液； 4)向步驟3)所得溶液中加入質(zhì)量濃度5%的蛋白酶，將溶液PH調(diào)至7-8，加熱，恒溫酶解，酶解完全后，加熱至酶滅活，降溫至室溫，過(guò)濾得濾液； 5)將步驟4)所得濾液過(guò)5000道爾頓超濾膜超濾，得超濾液，凍干，所得凍干粉即為白耙齒菌多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，白耙齒菌粉末與NaOH溶液的質(zhì)量比為1:25-1:30 ;所述提取的時(shí)間為10-12ho3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，所述離心的離心速度為3000-3500r/min，離心時(shí)間為 20_25min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，所述蛋白酶選自酶活力為50u/mg的木瓜蛋白酶或酶活力為1000u/mg的中性蛋白酶。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，所述酶解的溫度為45-60°C，酶解時(shí)間為3-5h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從白耙齒菌中提取多肽的方法，包括如下步驟：將白耙齒菌除雜、冷凍、粉碎后，用超臨界CO2流體萃取法脫脂，再用NaOH溶液提取出蛋白質(zhì)及肽類物質(zhì)，進(jìn)一步酶解、超濾后完成白耙齒菌中多肽的提取。本發(fā)明方法工藝簡(jiǎn)單，安全無(wú)污染，所得產(chǎn)物純度及提取率高，且副反應(yīng)及附加產(chǎn)物少，易于操作和推廣，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/12, C07K1/34
【公開號(hào)】CN105368907
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510979858
【發(fā)明人】李春娥, 郭奕, 楊靜, 楊坤
【申請(qǐng)人】通化吉通藥業(yè)有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請(qǐng)日】2015年12月23日