一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NADPH和NADH是生物體內(nèi)重要的氧化還原反應(yīng)介質(zhì)。雖然它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)只差一 個磷酸基團(tuán)，但是生物功能具有很大差別。NADH參與分解反應(yīng)在細(xì)胞呼吸營養(yǎng)物質(zhì)代謝起 重要作用。而NADPH參與和成反應(yīng)，在反應(yīng)中消耗能量和成大分子，也是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御 系統(tǒng)的重要組成成分在細(xì)胞防御性氧(R0S)損傷方面起重要作用。因此，準(zhǔn)確定量NADPH和 NADH的細(xì)胞濃度對生物活性檢測和疾病的診斷具有重要意義。
[0003]NADPH和NADH可以通過四氮唑鹽類化合物(Tetrazoliunsalts)的氧化還原顏色 反應(yīng)檢測。1894年首次合成的TTC(2，3，5-三苯基四氮唑鹽)是脂溶性光敏感復(fù)合物，用于檢 測種子的生存能力。MTT是另一個檢測細(xì)胞存活和生長的方法，利用活細(xì)胞線粒體的琥珀酸 脫氫酶使MTT還原成水不溶解的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)，經(jīng)DMS0溶解后檢測540nm或 720nm波長吸收值。具有靈敏度高，經(jīng)濟(jì)性好等優(yōu)點，但檢測步驟繁多。1997年水溶性的WST (雙磺酸苯基四氮唑鹽)被合成，并被用于商業(yè)化活細(xì)胞活性測試中，但是，水溶性WST化合 物不易被合成和純化?；衔锛兌群唾|(zhì)量不易控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中現(xiàn)有的針對NADPH和NADH的檢測步驟繁瑣，專一性差等缺 點，提供了一類針對NADPH或和NADH檢測的高靈敏度結(jié)構(gòu)新穎的一類具有單磺酸苯基四氮 唑結(jié)構(gòu)的化合物。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：
[0006] -類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，具有以下的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)通式，
[0008] 式中：辦、1?2、1?3和R4每一個獨立的取代基包含1~50個選自C、H、N、0、S、P、Si和鹵素 原子的原子。取代基為氫原子，或者取代基為由(：、!1、10、5、？、51或鹵素原子構(gòu)成的基團(tuán)。
[0009]作為優(yōu)選，和R4獨立地選自氫原子、烷基、烷氧基、硝基、氰基、羧基或鹵素 原子。
[0010] 作為優(yōu)選，Ri、R2、R3和R4獨立地選自烷基、烷氧基、羥基、羧基、磺酰胺基或氨基。[0011]作為優(yōu)選，Ri、R2、R3和R4獨立地選自取代烷基、取代烷氧基、取代羧基、取代磺酰胺 基或取代胺基，取代基團(tuán)選自烷基、芳基、芳烷基。
[0012] 作為優(yōu)選，和R4獨立地選自包含1~50個選自C、H、N、0、S、P和鹵素原子構(gòu) 成的雜環(huán)化合物或多環(huán)化合物。
[0013] 作為優(yōu)選，一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其選自



[0018] 本發(fā)明提供的化合物，作為氫受體，被還原后在450nm具有最大光吸收，用于測定 谷氨酸脫氫酶活性或谷胺酰胺酶活性或細(xì)胞中NADPH/NADH的含量。
[0019] 本發(fā)明的苯基四氮唑鹽克服了傳統(tǒng)脂溶性四氮唑鹽毒性高的不足，具有低毒性的 優(yōu)點，又克服了水溶性四氮唑鹽合成困難，不易純化的不足，具有合成路徑短，純度質(zhì)量易 控制的優(yōu)點。由于四氮唑鹽在450nm處幾乎無光吸收，其還原產(chǎn)物甲瓚在450nm處具有較大 光吸收，因此，采用分光光度法能夠簡單快速測定細(xì)胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶酶活力，或測定細(xì)胞 中NADH的含量。
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明實施例1的具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物和還原態(tài)苯基具有 單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物的全波長掃描曲線。
[0021] 圖2是本發(fā)明實施例2的具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物與谷氨酸脫氫酶反 應(yīng)后，在450nm處光吸收情況。
[0022] 圖3是本發(fā)明實施例3的具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物與谷胺酰胺酶反應(yīng) 后，在450nm處光吸收情況。
[0023] 圖4是本發(fā)明實施例3的具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物與活細(xì)胞反應(yīng)后，在 450nm處光吸收情況。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0025] 實施例1 [0026]制備如下化合物
[0028] 2-(4-硝基苯基)-3-( 2-甲氧基-4-硝基苯基)-5(2-磺酸苯基)-2H-四氮唑單鈉鹽
[0029]代表性合成步驟
[0030] 步驟A:向30mL甲醇中加入對硝基苯肼6mmol，溶解后，加入苯甲醛-2-磺酸鈉 6mmo1，升溫至60°C攪拌反應(yīng)1~24hour，過濾，干燥，得到橙紅色固體產(chǎn)物苯甲醛-2-磺酸鈉 對硝基苯腙，產(chǎn)率87.1%。
[0031] 步驟B:將2_〇1的2-甲氧基-4-硝基苯胺加入至燒瓶，冰浴條件下加入lml水，再加 入0.6ml濃鹽酸，然后加入已溶解在lml水中的2.2mmolNaN〇2，繼續(xù)攪拌反應(yīng)20min~5hour， 得到2-甲氧基-4-硝基苯胺的重氮鹽。
[0032]步驟C:將2_〇1苯甲醛-2-磺酸鈉對硝基苯腙溶解于甲醇中，降溫到0°C，加入步驟 B現(xiàn)制的2-甲氧基-4-硝基苯胺的重氮鹽2mmol，再加入NaOH溶液，攪拌反應(yīng)1~24hour。過濾 干燥，柱層析分離得甲瓚，產(chǎn)率為87.2%。
[0033] 步驟D:取lmmo1步驟C制備的甲瓚，溶解于甲醇中，冰浴條件下加入濃鹽酸18mmo1， 在加入ISmmol雙氧水，攪拌反應(yīng)5小時。過濾干燥，柱層析分離得暗棕黃色固體，四氮唑鹽， 產(chǎn)率為33%。
[0034] 4 MMR(500MHz，DMS0):S8.54(d，J = 8.9Hz，2H)，8.37(d，J = 8.8Hz，lH)，8.24(dd， J = 8.8,2.0Hz 1H) ,8.05(d,J = 9.4Hz,3H),7.81-7.70(m,3H) ,7.44-7.35(m, 1H),3.71 (s, 3H).
[0035] MP:105°C
[0036] FAB-MS：m/z=499[M+H]+
[0037]權(quán)利要求書中的一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，都能夠根據(jù)上述步驟 選擇合適底物合成。
[0038] 實施例2
[0039]由類似的合成程序，步驟B中，底物為1-萘胺，產(chǎn)物為1-萘胺的重氮鹽，制備如下化 合物。
[0041] 2-(4-硝基苯基)-3-(1-萘基)-5(2-二磺酸苯基)-2H-四氮唑單鈉鹽黑色固體，產(chǎn) 率47.4%
[0042] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0)：58.46(d,J =8.4Hz,lH),8.29(d,J =7.4Hz,1H), 8.21 (dd, J =9.3Hz lH),8.06(d,J =7.9Hz,2H),7.88(d,J =9.5Hz,2H),7.62(d,J =7.8Hz,2H) ,7.43 (t,J =7.6Hz,2H),7.36(t,J =7.4Hz,2H),7.25(d,J= 6.6Hz 2H).
[0043] MP:102°C
[0044] FAB-MS：m/z=429[M+H]+
[0045] 實施例3
[0046]由類似的合成程序，步驟B中，底物為8-氨基喹啉，產(chǎn)物為8-氨基喹啉的重氮鹽，制 備如下化合物。
[0048] 2-(4-硝基苯基)-3-(8-喹啉基)-5(2-磺酸苯基)-2H-四氮唑單鈉鹽黑紅色固體， 產(chǎn)率67.17%
[0049]咕匪1?(5001取，0150):38.81((1，了= 4.3!^，1!1)，8.72((1，了= 7.8!^，1!1)，8.66-8.55(m,2H),8.35(d,J = 9.1Hz,lH) ,7.81(t,J = 7.6Hz,2H),7.72-7.68(m,2H) ,7.58-7.50 (m,2H),7.42(d ,J = 6.4Hz,lH),7.36(t ,J = 7.1Hz,lH),7.25(d ,J = 7.4Hz,lH).
[0050] MP:102°C
[0051] FAB-MS：m/z = 475[M+H] +
[0052] 實施例4
[0053]苯基四氮唑鹽及還原態(tài)苯基甲瓚的全波長掃描情況如圖1所示。
[0054]其中的苯基四氮唑鹽為實施例1中合成的2-(4-硝基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基 苯基)-5 (2-磺酸苯基)-2H-四氮唑單鈉鹽。
[0055] 苯基四氮唑鹽（10mM;在450nm幾乎無吸收；下方曲線)在1-甲氧基PMS和50mMTris pH8存在的條件下，可以被NADH還原成橘黃色的甲瓚(最大吸收波長為450nm;上方曲線）。因 此可作為NADH類還原劑的檢測方法。
[0056] 實施例5
[0057]谷氨酸脫氫酶活性檢測是通過催化谷氨酸脫氫生成NADPH/NADH，NADH將苯基四氮 唑還原成橘黃色的甲瓚，如圖2。
[0058]其中的苯基四氮唑鹽為實施例2中合成的2-(4-硝基苯基)-3-(1-萘基)-5(2-二磺 酸苯基)-2H-四氮唑單鈉鹽。
[0059] 苯基四氮唑鹽在450nm幾乎無吸收;苯基四氮唑鹽與1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲 酯鹽，NADP，谷氨酸，谷胺酸脫氫酶作用后，在450nm波長處存在光吸收。且吸收光的強(qiáng)度和 谷胺酸脫氫酶的量成正比。
[0060]苯基四氮唑鹽可以用于測定谷胺酸脫氫酶活性和藥物篩選。
[0061] 實施例6
[0062]谷胺酰胺酶催化反應(yīng)生成谷氨酸，谷氨酸可以用實施例5中的谷氨酸脫氫酶反應(yīng) 來定量，在450nm處測量光吸收情況，如圖3。
[0063] 苯基四氮唑鹽在450nm幾乎無吸收;測定0 .l_25mMol/L的苯基四氮唑鹽在1-甲基 PMS，NADP，谷氨酰胺，谷胺酰胺酶，谷胺酸脫氫酶的緩沖體系中反應(yīng)2h，測定不同濃度的苯 基四氮唑底物在450nm波長處光吸收。
[0064]吸收光的強(qiáng)度和谷胺酰胺酶的量成正比。
[0065] 苯基四氮唑鹽可以用于測定谷胺酰胺酶活性和藥物篩選。
[0066] 實施例7
[0067]苯基四氮唑鹽與活細(xì)胞反應(yīng)后，在450nm處測量光吸收情況，如圖4。
[0068]其中的苯基四氮唑鹽為實施例3中合成的2-(4-硝基苯基)-3-(8-喹啉基)-5(2-磺 酸苯基)-2H-四氮唑單鈉鹽。
[0069] 苯基四氮唑鹽在450nm幾乎無吸收;苯基四氮唑鹽與細(xì)胞中的NADH/NADPH作用后， 在450nm波長處存在光吸收。并且吸收光的強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)量呈相關(guān)性。
[0070]因此，苯基四氮唑鹽可以用于測定活細(xì)胞的量。
[0071]總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所作的均等 變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其特征在于，具有以下的化學(xué)分子結(jié)構(gòu) 通式：式中：Ri、R2、R3和R4每一個獨立的取代基包含1~50個選自C、H、N、0、S、P、Si和鹵素原子 的原子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其特征在于:Ri、 R2、R3和R4獨立地選自氫原子、烷基、烷氧基、硝基、氰基、羧基或鹵素原子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其特征在于:Ri、 R2、R3和R4獨立地選自羥基、磺酰胺基或氨基。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其特征在于:Ri、 R2、R3和R4獨立地選自取代烷基、取代烷氧基、取代羧基、取代磺酰胺基或取代胺基，取代基 團(tuán)選自烷基、芳基、芳烷基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其特征在于:Ri、 R2、R3和R4獨立地選自包含1~50個選自C、H、N、0、S、P和鹵素原子構(gòu)成的雜環(huán)化合物或多環(huán) 化合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，其選自：7.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的化合物測定谷氨酸脫氫酶活性或谷胺酰胺酶活性或NADPH/ NADH在細(xì)胞中的含量。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一類具有單磺酸苯基四氮唑結(jié)構(gòu)的化合物，具有2-(R1苯基)-5(2-磺酸苯基)-2H-四氮唑的結(jié)構(gòu)通式，本發(fā)明的一類含2-磺酸苯基四氮唑鹽，具有低毒性、合成路徑短、純度質(zhì)量易控制等優(yōu)點。由于2-磺酸苯基四氮唑鹽在450nm處幾乎無光吸收，而其還原產(chǎn)物在450nm處具有較大光吸收，因此，采用分光光度法能夠簡單快速測定細(xì)胞內(nèi)谷氨酸脫氫酶酶活力或NADH/NADPH含量。
【IPC分類】G01N21/31, C07D405/04, C07D403/04, C12Q1/32, C07D409/04, C07D257/04, C07D401/04, C12Q1/34, C07D413/04, C07D417/04
【公開號】CN105418526
【申請?zhí)枴緾N201510757078
【發(fā)明人】阮奔放, 阮健昵福
【申請人】杭州伽瑪生物科技有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月9日