一種提取古代生物骨骼dna的裂解液及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物DNA提取技術領域，具體涉及一種提取古代生物骨骼DNA的裂解 液及方法。
【背景技術】
[0002] 從古代生物骨骼中提取DNA對于探索古代生物的生命奧秘以及人類文明的發(fā)展 具有重要意義。骨骼是一種比較特殊的生物檢測材料，因為外部有堅硬的保護組織，所以相 對于生物體的其他組織臟器器官的降解比較慢。因此，對于高度腐化的樣本來說，骨骼是進 行DNA檢測的有效檢測材料之一。由于受周圍環(huán)境中核酸酶和微生物的作用，古代生物骨 骼中的DNA鏈會發(fā)生斷裂、缺失甚至降解，不易獲得足夠的DNA樣本。因此，目前尚需尋找 一種更有效的DNA提取方法，為最大程度地提取和保存陳舊骨骼中的DNA。
[0003] 由于骨骼組織異常堅固，提取DNA較其他軟組織困難。而現(xiàn)有的一些舊方法存在 組織裂解不完全，DNA丟失較多，同時獲取的樣本含雜質太多，苯酚/氯仿法對人體毒性大， 即便脫鈣法也存在占用時間太長等缺點。本發(fā)明提供了一種新的骨組織DNA提取液，無需 脫鈣處理和利用苯酚/氯仿，通過提高舊方法裂解液中SDS、EDTA和蛋白酶K的組分，增強 裂解液對骨組織的裂解程度，使骨組織裂解更充分。骨骼裂解離心后，再將上清液利用異 丙醇、去蛋白液，DNA漂洗液等處理，借助離心柱可更大程度地獲取高純度古代生物骨骼的 DNA〇

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。該裂解液及配 套使用的方法能夠使得組織裂解完全，獲取的樣本雜質少，更大程度地獲取高純度古代生 物骨骼的DNA，而且使用環(huán)境無毒、操作簡便，時間短、效率高。
[0005] -種提取古代生物骨骼DNA的裂解液，所述裂解液配方是在去離子水中溶 解：pH8. 5Tris-HCl，10mM;EDTA，10-15mM;SDS，1. 0-1. 5wt% ;NaCl，150mM;蛋白酶K， 0. 3-〇. 5mg/ml〇
[0006] 所述裂解液優(yōu)選配方是在去離子水中溶解：pH8. 5Tris-HCl，lOmM;EDTA，15mM; SDS，1. 5wt% ;NaCl，150mM;蛋白酶Κ，0· 5mg/ml。
[0007] 利用所述的裂解液提取古代生物骨骼DNA的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)剪取一小塊出土的古代人骨豁，將其碾碎，稱取0. 3-0. 4g放入1. 5ml的EP管 中；
[0009] 2)加入 250-300μ1 的裂解液，55-57°C孵育 12 - 16h;
[0010] 3) 12000rpm離心10_15min，取200-250μ1上清液入新EP管，按照體積比1:1加 入250μ1異丙醇，輕輕混勻后4°C靜置至少lOmin;
[0011] 4)輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心l-2min，棄收集管 內的液體；
[0012] 5)加入500μ1去蛋白液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液；
[0013] 6)加入600μ1的漂洗液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液，并重復一次操作， 本步驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇；
[0014] 7)打開蓋子，24-26°C至少風干 10 - 15min;
[0015] 8)加入75°C預熱的去離子水30-50μ1洗脫DNA;
[0016] 9)將收集的DNA液加入離心柱內，相同條件下再次洗脫。
[0017]所述的方法，優(yōu)選包括以下步驟：
[0018] 1)剪取一小塊出土的古代人骨骼，將其碾碎，稱取0. 3g放入1. 5ml的ΕΡ管中；
[0019] 2)加入 300μ1 的裂解液，55°C孵育 12 - 16h;
[0020] 3) 12000rpm離心lOmin，取250μ1上清液入新EP管，按照體積比1:1加入250μ1 異丙醇，輕輕混勻后4°C靜置至少lOmin;
[0021] 4)輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心lmin，棄收集管內 的液體；
[0022] 5)加入500μ1去蛋白液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液；
[0023] 6)加入600μ1的漂洗液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液，并重復一次操作， 本步驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇；
[0024] 7)打開蓋子，25°C至少風干10 - 15min;
[0025] 8)加入75°C預熱的去離子水50μ1洗脫DNA;
[0026] 9)將收集的DNA液加入離心柱內，相同條件下再次洗脫。
[0027]DNA的濃度和純度用生物分光光度計測定，DNA樣本的擴增按照常規(guī)PCR方法實 施，擴增循環(huán)為40次。
[0028] 本發(fā)明通過將SDS、EDTA和蛋白酶K的組分分別提高至1. 5%、15mM和0. 5mg/ml， 可明顯提高新裂解液對骨組織的裂解程度。骨骼裂解離心后，再將上清液利用異丙醇、去蛋 白液，DNA漂洗液等處理，借助尚心柱可明顯減少DNA樣品中的雜質成分，有利于提尚PCR的 擴增效果，從而有助于獲取高純度古代生物骨骼的DNA。
【附圖說明】
[0029] 圖1為不同裂解液對古代人骨骼裂解效果對比；
[0030]A:舊裂解液對骨組織的裂解；B:本發(fā)明新裂解液對骨組織的裂解更充分；
[0031] 圖2為本發(fā)明方法/舊方法提取的樣品擴增人β-actin基因片段效果對比；
[0032]A:舊方法；B:本發(fā)明方法。
【具體實施方式】
[0033] 以下結合【具體實施方式】旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0034]本發(fā)明提供的新裂解液配方：pH8. 5Tris-Hcl，10mM;EDTA，15mM;SDS，1. 5% ;
[0035]NaCl，150mM;蛋白酶K，0. 5mg/ml。
[0036] 其余試劑及耗材：異丙醇，DNA離心柱，去蛋白液，DNA漂洗液，無水乙醇等
[0037] 本發(fā)明所實施的步驟：
[0038](操作前，預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇）
[0039] 1、剪取一小塊出土的古代人骨骼，用研磨器將其碾碎，并稱取0. 3g放入1. 5ml的 EP管中，剩余粉末可收集，_20°C保存；
[0040] 2、加入 300μ1 的裂解液，55°C孵育 12 - 16h;
[0041]3、12000rpm離心lOmin，取250μ1上清液入新EP管，加入250μ1異丙醇（1:1)， 輕輕混勻后4°C靜置lOmin;
[0042] 4、輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心lmin，棄收集管內 的液體；
[0043] 5、加入500μ1去蛋白液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液；
[0044] 6、加入600μ1的漂洗液，12000rpm離心lmin，棄廢液，并重復一次操作；
[0045] 7、打開蓋子，室溫風干10 - 15min;
[0046] 8、加入75°C預熱的去離子水50μ1洗脫DNA;
[0047] 9、將收集的DNA液加入離心柱內，再次洗脫；
[0048] 10、DNA的濃度和純度用生物分光光度計測定，DNA樣本的擴增按照常規(guī)PCR方法 實施，擴增循環(huán)為40次。
[0049] 舊裂解液配方：pH8. 5Tris-Hcl，10mM;EDTA，5mM;SDS，0. 2% ;NaCl，150mM;蛋白酶 K，0·lmg/ml〇
[0050] 其余試劑：異丙醇。
[0051] 舊方法操作步驟：
[0052] 1、剪取一小塊出土的古代人骨骼，用研磨器將其碾碎，并稱取0. 3g放入1. 5ml的 EP管中，剩余粉末可收集，_20°C保存；
[0053] 2、加入 300μ1 的裂解液，55°C孵育 12 - 16h;
[0054]3、12000rpm離心lOmin，取250μ1上清液入新EP管，加入250μ1異丙醇（1:1)， 輕輕混勻后4°C靜置lOmin;
[0055] 4、12000rpm離心lmin，棄上清液，用30-50μ1去離子水溶解DNA;
[0056] 5、DNA的濃度和純度用生物分光光度計測定，DNA樣本的擴增按照常規(guī)PCR方法實 施，擴增循環(huán)為40次。
[0057] 現(xiàn)有的技術相比，本發(fā)明方法無需脫鈣處理骨組織，步驟相對簡單，同時骨組織裂 解更完全（圖1)，能提取出高濃度和高純度的DNA樣本（表1)。利用PCR技術檢測顯示， 在相同樣本濃度（l〇〇ngDNA)下，本發(fā)明方法分離的樣本可更有效地擴增出DNA產(chǎn)物（圖 2)〇
[0058] 表1本發(fā)明方法/舊方法提取古代人骨骼DNA的濃度和純度對比
[0059]
[0060] 本發(fā)明裂解液配方的部分探索過程見下表2:每種成分都做了單因素試驗，以確 定最優(yōu)的濃度范圍。
[0061] 表 2
[0062]
[0063]
【主權項】
1. 一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液，其特征在于，所述裂解液配方是在去離子水 中溶解：pH8. 5Tris-HCl，10mM;EDTA，10-15mM;SDS，1. 0-1. 5wt% ;NaCl，150mM;蛋白酶K， 0. 3-〇. 5mg/ml〇2. 根據(jù)權利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的裂解液，其特征在于，所述裂解液配 方是在去離子水中溶解：pH8. 5Tris-HCl，10mM;EDTA，15mM;SDS，L5wt% ;NaCl，150mM;蛋 白酶Κ，0· 5mg/ml。3. 利用權利要求1或2所述的裂解液提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括 以下步驟： 1) 剪取一小塊出土的古代人骨骼，將其碾碎，稱取〇. 3-0. 4g放入1. 5ml的EP管中； 2) 加入 250-300μ1 的裂解液，55-57°C孵育 12 - 16h; 3) 12000rpm離心10-15min，取200-250μ1上清液入新EP管，按照體積比1:1加入 250μ1異丙醇，輕輕混勻后4°C靜置至少lOmin; 4) 輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心l-2min，棄收集管內的 液體； 5) 加入500μ1去蛋白液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液； 6) 加入600μ1的漂洗液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液，并重復一次操作，本步 驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇； 7) 打開蓋子，24_26°C至少風干10 - 15min; 8) 加入75°C預熱的去離子水30-50μ1洗脫DNA; 9) 將收集的DNA液加入離心柱內，相同條件下再次洗脫。4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 剪取一小塊出土的古代人骨骼，將其碾碎，稱取〇. 3g放入1. 5ml的EP管中； 2) 加入300μ1的裂解液，55°C孵育12 - 16h; 3) 12000rpm離心lOmin，取250μ1上清液入新EP管，按照體積比1:1加入250μ1異 丙醇，輕輕混勻后4°C靜置至少lOmin; 4) 輕輕吹打混合液，并將混合液轉移至離心柱，12000rpm離心lmin，棄收集管內的液 體； 5) 加入500μ1去蛋白液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液； 6) 加入600μ1的漂洗液，12000rpm離心lmin，棄收集管內廢液，并重復一次操作，本步 驟操作前，須預先在漂洗液中加入3倍體積的無水乙醇； 7) 打開蓋子，25°C至少風干10 - 15min; 8) 加入75°C預熱的去離子水50μ1洗脫DNA; 9) 將收集的DNA液加入離心柱內，相同條件下再次洗脫。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。所述裂解液配方：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。通過將SDS、EDTA和蛋白酶K的組分分別提高，可明顯提高新裂解液對骨組織的裂解程度。同時在使用時再利用去蛋白液，DNA漂洗液處理，以及DNA離心柱法可明顯減少DNA樣品中的雜質成分，有利于提高PCR的擴增效果，從而有助于獲取高純度古代生物骨骼的DNA。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105420229
【申請?zhí)枴緾N201610014145
【發(fā)明人】李志遠, 馬文波, 鄧思浩, 李彩月, 陳旦, 劉亮
【申請人】中南大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月8日