擬南芥At1g52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種擬南芥Atlg52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用。
【背景技術】
[0002]葉片是植物進行光合作用，合成有機物，增加農作物產量的重要器官。植物葉片的過早衰老往往造成作物減產甚至不育。植物葉片的衰老受到生長環(huán)境和植物內部激素信號的調節(jié)。眾多研究表明，植物激素脫落酸(abscisicacicUABA)是植物應答外界環(huán)境脅迫所產生的一種重要逆境激素，它可以提高植物對逆境(如干旱、高溫、冷害、鹽堿等)的抗性。因為同幼嫩葉片相比，ΑΒΑ在衰老的葉片中含量較高和對葉片噴施ΑΒΑ可以促進葉片過早衰老，所以長期以來ΑΒΑ被認為促進葉片的衰老。但是對于ΑΒΑ是促進還是抑制植物葉片衰老仍缺少遺傳學證據。闡明ΑΒΑ在調控植物葉片衰老中的作用對于防止植物葉片早衰，增加農作物產量具有重要意義。
[0003]擬南芥Atlg52340基因屬于植物激素合成酶類基因，編碼一個定位于細胞胞質內的脫氫還原酶，促進植物黃質醛向ΑΒΑ醛的轉化。該基因的⑶S長度為858個堿基，編碼252個氨基酸的蛋白，已有研究表明其與植物種子的萌發(fā)，植物發(fā)育和氣孔的運動有關，但是關于對植物葉片衰老的報道還很少報道，而由此介導的負調節(jié)葉片的衰老更未見到相關報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供擬南芥Atlg52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用，以拓展Atlg52340基因的應用范圍。
[0005]為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案如下:擬南芥Atlg52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用，將Atlg52340基因連接到不同種類載體上，通過不同的表達載體轉化獲得抗衰老相關的轉基因作物，所述Atlg52340基因的CDS長度為858個堿基，編碼252個氨基酸的蛋白，編碼一個定位于細胞胞質內的脫氫還原酶。
[0006]本發(fā)明通過化學誘變將擬南芥Atlg52340基因突變，獲得突變體(easl-l、easl-
2)，圖位克隆和測序表明突變基因為擬南芥At lg52340基因的突變所致。
[0007]本發(fā)明通過暗處理，發(fā)現突變體的葉片表現出更早衰老的現象，尤其在暗處理的后期，關變體的葉片;S老更快。
[0008]本發(fā)明通過滲透和氧化脅迫處理，發(fā)現突變體在應答逆境脅迫時葉片出現明顯的更早衰老的癥狀，突變體更容易衰老。
[0009]本發(fā)明通過對野生型和突變體植株的衰老細胞染色及細胞死亡的生理學分析，發(fā)現突變體的細胞凋亡率明顯高于野生型。
[0010]本發(fā)明利用藥理學、轉基因技術和電生理技術發(fā)現鈣離子可能參與了ΑΒΑ對葉片早期衰老的調控。
[0011]本發(fā)明將野生型和突變體植株與衰老相關的基因進行表達分析表明，Atlg52340基因可以通過調節(jié)與衰老相關的基因的表達來影響植物葉片的衰老。
[0012]擬南芥Atlg52340基因參與植物葉片細胞衰老的調控，通過抑制葉片細胞的早期衰老進行調節(jié)。
[0013]本發(fā)明的技術方案是基于下述的原理得出的:首先通過圖位克隆和測序，確定擬南芥Atlg52340基因的突變體是Atlg52340基因突變所致;該突變體對暗處理的耐受性差，表現出更快衰老的現象;該突變體對于滲透和氧化脅迫，表現出明顯的更早衰老的癥狀;該突變體的細胞凋亡率明顯高于野生型植株;該突變體的大量與衰老相關的基因的表達明顯被改變。由此看出，Atlg52340基因在多種環(huán)境脅迫下均對植物葉片的衰老起到重要的調控作用，通過抑制葉片細胞的早期衰老進行調節(jié)。本發(fā)明從細胞學、分子生物學的角度對Atlg52340基因調控植物葉片的衰老機制進行了闡述，對揭示植物葉片感受多種逆境脅迫的機理具有實質性的參考價值，且對農業(yè)生產和農作物改良具有重要的現實意義。
[0014]本發(fā)明的有益效果如下:
本發(fā)明通過上述內容，提出了擬南芥At lg52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用；通過暗處理、逆境脅迫、細胞工程技術及基因工程技術等一系列實驗手段，證實擬南芥Atlg52340基因是一個能夠通過調節(jié)植物衰老相關的基因的表達從而影響植物衰老，并且在細胞水平上對調節(jié)植物葉片細胞的衰老凋亡發(fā)揮作用，這種調控機理也參與植物對逆境如滲透和氧化脅迫的應答。通過轉基因技術可以將該基因用于開展作物育種，延緩作物過早衰老，實現增產豐收。
【附圖說明】
[0015]圖1為擬南芥WT、easl_l和超表達(0E-EAS1)在不同時期的Fv/Fm，葉綠素含量和衰老表型結果；
圖2為擬南芥WT和easl-Ι在滲透脅迫和氧化脅迫下葉片的衰老情況；
圖3為擬南芥WT和easl-Ι在不同發(fā)育時期的細胞凋亡表型和數據統(tǒng)計；
圖4為擬南芥WT和easl-1 7天的不同時期葉片部分與衰老相關基因的表達分析。
【具體實施方式】
[0016]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步清楚闡述本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的保護內容不僅僅局限于下面的實施例。
[0017]擬南芥Atlg52340基因屬于植物激素合成酶類基因，編碼一個定位于細胞胞質內的脫氫還原酶，促進植物黃質醛向ΑΒΑ醛的轉化。該基因的⑶S長度為858個堿基，編碼252個氨基酸的蛋白。
[0018]通過乙酰甲基磺酸(EMS)對擬南芥野生型進行誘變處理，葉綠素熒光儀對M2代突變體進行篩選，獲得兩個葉片早衰的突變體，即eas 1-1和eas 1_2。通過遺傳分析和基因克隆發(fā)現兩個突變體為ABA2基因的等位突變體，故述實施例僅以easl-Ι為材料進行分析。
[0019]實施例1
擬南芥Atlg52340基因與葉片的衰老相關
參閱圖1，將擬南芥野生型(wildtype，WT)和突變體(eas 1_1)種子接種于0.8%瓊脂的MS培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)，光/暗周期為16/8h，溫度為22°C，相對濕度為70%，WT和eas 1-1種子萌發(fā)并生長7天后轉移至營養(yǎng)土中并放于溫室進行培養(yǎng)。對不同時期生長的WT和eas 1_1植物葉片的最大光化學速率(Fv/Fm)和葉綠素含量進行測定，結果表明:相比WT植株的葉片，突變體eas 1-1的葉片在早期有更高的葉綠素含量和更高的光合作用效率，30天后其葉綠素含量和光合作用效率則明顯下降(圖1A-C)，葉片過早衰老。此外，正常生長在土壤中的WT和easl-Ι植物，與WT植物相比，突變體easl-Ι的輪座葉片表現出更快的葉片衰老現象(圖1D)。
[0020]上述結果表明Atlg52340基因能夠調控葉片衰老，尤其是對幼苗早期葉片的衰老調控。
[0021 ] 實施例2
擬南芥At lg52340基因調控葉片的衰老受滲透和氧化脅迫的影響參閱圖2，利用人工施加逆境脅迫對WT和easl-Ι突變體的的離體第5片葉子進行滲透和氧化脅迫處理，同時對它們的衰老表型、葉綠素含量及葉片的離子滲漏進行檢測。數據表明:同WT相比，eas 1 -1突變體在應答逆境脅迫時，其葉片明顯表現出更早的出現衰老的癥狀，如變黃和過多的死亡斑(圖2A);葉片的DNA含量也明顯下降更快(圖2B)。葉綠素含量和離子滲漏數據也支持了這一觀點，隨著脅迫時間的延長，突變體easl-Ι離體葉片的葉綠素含量明顯下降更快，而離子滲漏則明顯增加(圖2C-F)。
[0022]以上結果表明，擬南芥Atlg52340基因參與植物葉片受逆境脅迫誘導衰老的調控。
[0023]實施例3
擬南芥Atlg52340基因調控葉片衰老的細胞學證據
參閱圖3，通過葉片衰老染色和葉片細胞死亡的生理學證據對比，發(fā)現突變體easl-Ι的葉片在臺盼藍染色的情況下，輪座葉片的衰亡斑比WT面積更大，更明顯(圖3A);而DAPI和PI染色能夠更清楚地顯示:突變體easl-Ι的葉片，不管是葉肉細胞，葉表皮細胞還是保衛(wèi)細胞，都表現出細胞膜被更早破壞的現象(圖3B)。
[0024]為了更進一步的說明easl-Ι的葉片細胞的衰老情況，本發(fā)明對葉肉細胞進行細胞流失分析，觀察和統(tǒng)計它們的凋亡率，結果表明:在25天后，easl-Ι的葉片的細胞凋亡率明顯高于WT(圖3C-D)。
[0025]由此可以證明，擬南芥Atlg52340基因參與植物葉片細胞衰老的調控，通過抑制葉片細胞的早期衰老進行調節(jié)。
[0026]實施例4
擬南芥Atlg52340基因調控葉片衰老的分子機理驗證
參閱圖4，為進一步驗證擬南芥Atlg52340基因參與植物葉片的衰老，本發(fā)明對WT和easl-Ι植株的不同時期葉片部分與衰老相關的基因進行表達分析。結果表明:大量與衰老相關的基因的表達明顯被改變(圖4)，尤其是SAG12AAG12基因是一個調節(jié)植物葉片衰老的主要基因。對于25天的葉片，該基因在easl-Ι植株中的表達量是WT的大約1500倍。
[0027]上述結果明確表明，Atlg52340基因通過調節(jié)衰老相關基因的表達來影響植物葉片的發(fā)老。
[0028]綜上，擬南芥Atlg52340基因通過調節(jié)植物衰老相關基因的表達從而影響植物的衰老，并且在細胞水平上對調節(jié)植物葉片細胞衰老凋亡發(fā)揮作用。上述調控機理也參與植物對逆境如滲透和氧化脅迫的應答。通過基因工程手段可以將該基因用于開展作物育種，延緩作物過早衰老，實現增產豐收。
[0029]最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，本領域普通技術人員對本發(fā)明的技術方案所做的其他修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
【主權項】
1.擬南芥Atlg52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用，其特征在于:將Atlg52340基因連接到不同種類載體上，通過不同的表達載體轉化獲得抗衰老相關的轉基因作物，所述Atlg52340基因的⑶S長度為858個堿基，編碼252個氨基酸的蛋白，編碼一個定位于細胞胞質內的脫氫還原酶。
【專利摘要】本發(fā)明涉及擬南芥At1g52340基因在調控植物葉片衰老方面的應用，屬于基因工程技術領域，將At1g52340基因連接到不同種類載體上，通過不同的表達載體轉化獲得抗衰老相關的轉基因作物，所述At1g52340基因的CDS長度為858個堿基，編碼252個氨基酸的蛋白，編碼一個定位于細胞胞質內的脫氫還原酶。本發(fā)明證實擬南芥At1g52340基因是一個能夠通過調節(jié)植物衰老相關的基因的表達從而影響植物衰老，并且在細胞水平上對調節(jié)植物葉片細胞的衰老凋亡發(fā)揮作用，這種調控機理也參與植物對逆境如滲透和氧化脅迫的應答。通過轉基因技術可以將該基因用于開展作物育種，延緩作物過早衰老，實現增產豐收。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105463013
【申請?zhí)枴緾N201610042944
【發(fā)明人】宋玉偉, 向福友, 苗雨晨, 宋純鵬
【申請人】南陽師范學院
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月22日