利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種肉桂醇的制備方法，特別涉及一種利用腐敗希瓦氏菌作用將肉桂 醛選擇性加氫制備肉桂醇的方法。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 肉桂醇是一種高附加值的精細(xì)有機(jī)產(chǎn)品，可以作為香料、藥物、食品及其它化工產(chǎn) 品生產(chǎn)的重要原料和中間體，應(yīng)用廣泛。例如，肉桂醇是合成抗癌藥物紫杉醇和抗生素綠霉 素必要成分，也是合成許多芳香性化學(xué)物的中間體。通常肉桂醇由肉桂醛合成。肉桂醛分子 中存在c=c、c=o和苯環(huán)結(jié)構(gòu)，由于c=o的鍵能高于c=c的鍵能，c=c比c=o更容易加氫， 當(dāng)二者與苯環(huán)共輒時(shí)，選擇加氫C = 0則更難進(jìn)行。
[0003] 當(dāng)前以肉桂醛加氫制備肉桂醇大致可分為三類，分別以氫負(fù)離子、H2和醇作為還 原劑，利用化學(xué)催化方法制備肉桂醇。存在著還原劑和催化劑昂貴、較難保證高選擇性加 氫、制備繁瑣、制備設(shè)備有特殊要求、操作條件苛刻、產(chǎn)物與還原劑、溶劑分離困難、產(chǎn)品后 處理繁瑣、產(chǎn)生大量廢物等最多不利因素。
[0004] 近年來，由于生物催化反應(yīng)具有更好的選擇性和環(huán)境友好性，已被用在越來越多 的化合物合成中去。例如，利用阿魏酸微生物轉(zhuǎn)化合成天然香蘭素;利用微生物脂肪酶催化 合成多種芳香酯等。目前利用腐敗希瓦氏菌直接生物催化肉桂醛選擇性加氫制成肉桂醇的 研究國內(nèi)外均未見報(bào)道。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種在腐敗希瓦氏菌作用下，肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇的 方法，從而使肉桂醛簡易快捷高效地選擇性還原成肉桂醇。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，所述方法為： 以腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens)經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌懸液為催化劑，以肉桂醛為 底物，以吐溫-80為助劑，在pH值4.5-7.5、20-40°C、100-200rpm條件下進(jìn)行催化加氫反應(yīng)， 反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得肉桂醇。
[0008] 進(jìn)一步，所述腐敗希瓦氏菌優(yōu)選為腐敗希瓦氏菌CICC22940,購自中國工業(yè)微生物 菌種保藏中心，菌種編號:CICC22940,保藏日期2013年10月31日。
[0009] 進(jìn)一步，所述肉桂醛濃度為0.002-10g/L菌懸液(優(yōu)選l_6g/L)，所述助劑濃度為5-20g/L(優(yōu)選 10g/L)。
[0010] 進(jìn)一步，所述菌懸液中腐敗希瓦氏菌濃度為1 〇8-l〇13CFU/mL。
[0011] 進(jìn)一步，所述催化劑的制備方法為:將腐敗希瓦氏菌接種至TSB培養(yǎng)基，在30°C下 培養(yǎng)12小時(shí)，再以體積濃度0.1-0.5%的接種量(優(yōu)選0.1 % )轉(zhuǎn)接到新鮮的TSB培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)12h，隨后以體積濃度0.1-0.5%的接種量(優(yōu)選0.1 % )接種到新鮮TSB培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)5h至對數(shù)期，然后利用TSB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液稀釋制成腐敗希瓦氏菌菌懸液;所述TSB 培養(yǎng)基質(zhì)量濃度組成為:胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鉀2.5g/ L，葡萄糖2.5g/L，pH 7.3±0.2,溶劑為水。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇過程中，所述吐溫-80先 與肉桂醛混合，在100Hz條件下超聲混合15min，制成肉桂醛乳化液，然后再將肉桂醛乳化液 加入腐敗希瓦氏菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌懸液中進(jìn)行加氫反應(yīng)。
[0013] 本發(fā)明所述分離純化方法為:反應(yīng)完全后將反應(yīng)液離心，棄沉淀，上清液加入等體 積二氯甲烷，搖床震搖2_3h進(jìn)行萃取，離心，分出二氯甲烷層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得肉桂醇。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：
[0015] 本發(fā)明所述的利用腐敗希瓦氏菌催化由肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇的方法與 現(xiàn)有技術(shù)相比，具有反應(yīng)條件溫和，成本低廉，選擇性好，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，肉桂醇的得率在 80%以上。 (四）
【附圖說明】
[0016] 圖1為肉桂醛在腐敗希瓦氏菌作用下定向轉(zhuǎn)化為肉桂醇反應(yīng)式。
[0017] 圖2為含207yg/mL肉桂醛的腐敗希瓦氏菌反應(yīng)液Omin時(shí)的總離子流圖（a，肉桂醛； b，肉桂醇）。
[0018] 圖3為含207yg/mL肉桂醛的腐敗希瓦氏菌反應(yīng)液180min時(shí)的總離子流圖（a，肉桂 醛;b，肉桂醇）。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0020] 實(shí)施例1.乳化肉桂醛加入量不同
[0021] 將2g肉桂醛加入100mL吐溫80溶液（10g/L)中，超聲（100Hz，15min)乳化，制成乳化 肉桂醛。
[0022] 腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens)CICC22940購自中國工業(yè)微生物菌種 保藏中心，菌種編號：CICC22940,保藏日期2013年10月31日。將腐敗希瓦氏菌CICC22940接 種至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，在30°C下培養(yǎng)12小時(shí)，再轉(zhuǎn)接體積濃度0.1 %到新鮮 的TSB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)12h，隨后接種體積濃度0.1 %到新鮮TSB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)5h至 對數(shù)期，然后利用TSB培養(yǎng)基將培養(yǎng)液稀釋，獲得菌體濃度為108CFU/mL的腐敗希瓦氏菌菌 懸液100mL，pH值為7。
[0023] 按表1所需濃度，加入不同體積的乳化肉桂醛于腐敗希瓦氏菌菌懸液中，混勻，25 °(3于搖床中，以180rpm速度振蕩培養(yǎng)反應(yīng)6h后，離心分離，用GC-MS進(jìn)行定性分析，條件如 下：色譜柱：TG-5，30m X 0.25mm X 0.25μπι;載氣：氮?dú)?，流速：lmL/min;程序升溫：初始溫度 100°C，以20°C/min的速率升溫至130°C，再以5°C/min的速率升溫至170°C，再以50°C/min的 速率升溫至230°C;進(jìn)樣口溫度;230°C;進(jìn)樣量：ΙμL。質(zhì)譜條件：電離方式:EI;傳輸線溫度： 230°C ;電離能量:70eV;掃描質(zhì)量范圍：40-500m/z;溶劑延遲:3min。用HPLC進(jìn)行定量分析， 條件如下:流動相：乙腈-水(〇-l〇min內(nèi)由35 :65線性變化到38:62，在10-1511^11內(nèi)由38:62線 性變化到50:50);流速：lmL/min;檢測波長：肉桂醛:290nm，肉桂醇：250nm;柱溫:30°C;進(jìn)樣 量：1〇μ1。
[0024] 反應(yīng)時(shí)間6h，不同加入量肉桂醛下肉桂醛的轉(zhuǎn)化率和得率見表1。
[0025] 表1不同肉桂醛加入量下肉桂醛的轉(zhuǎn)化率和得率
[0027]實(shí)施例2.腐敗希瓦氏菌催化反應(yīng)時(shí)間不同
[0028] 將2g肉桂醛加入100mL吐溫80溶液（10g/L)中，超聲（100Hz，15min)乳化，制成肉桂 醛乳化液。
[0029] 向pH值為6.8、108CFU/mL腐敗希瓦氏菌菌懸液100mL (制備方法同實(shí)施例1)中加入 lmL肉桂醛乳化液，混勾，30°C于搖床中以180rpm速度振蕩培養(yǎng)反應(yīng)5min-6h(見表2)，離心， 去除腐敗希瓦氏菌沉淀，用GC-MS進(jìn)行定性分析，測定分析上清夜。GC-MS條件、質(zhì)譜條件同 實(shí)施例1。用HPLC進(jìn)行定量分析，條件同實(shí)施例1。表2給出了不同反應(yīng)時(shí)間下肉桂醛的轉(zhuǎn)化 率和得率。
[0030] 表2不同反應(yīng)時(shí)間下肉桂醛的轉(zhuǎn)化率和得率
[0032]備注：肉桂醛加入量為2g/L。
[0033]實(shí)施例3.腐敗希瓦氏菌加入量不同
[0034] 將2g肉桂醛加入100mL吐溫80溶液（10g/L)中，超聲（100Hz，15min)乳化，制成肉桂 醛乳化液。
[0035] 分別向pH值為5.5、不同濃度(表3)腐敗希瓦氏菌菌懸液100mL(制備方法同實(shí)施例 1)中培養(yǎng)液中加入lmL肉桂醛乳化液，混勻，37°C于搖床中以180rpm速度振蕩培養(yǎng)反應(yīng)6h 后，離心，去除腐敗希瓦氏菌沉淀，用GC-MS進(jìn)行定性分析，測定分析上清夜。GC-MS、質(zhì)譜條 件同實(shí)施例1，用HPLC進(jìn)行定量分析，條件同實(shí)施例1。表3給出了不同腐敗希瓦氏菌濃度下 肉桂醛的轉(zhuǎn)化率和得率。
[0036] 表3不同反應(yīng)時(shí)間下肉桂醛的轉(zhuǎn)化率和得率
[0037]
[0038] 備注：肉桂醛加入量為2g/L，反應(yīng)時(shí)間6h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所述方法為：以 腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens)經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌懸液為催化劑，以肉桂醛為底 物，以吐溫-80為助劑，在pH值4.5-7.5、20-40°C、100-200rpm條件下進(jìn)行催化加氫反應(yīng)，反 應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得肉桂醇。2. 如權(quán)利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述腐敗布瓦氏困為腐敗布瓦氏困CICC22940。3. 如權(quán)利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述肉桂醛濃度為〇.〇〇2-1(^/1菌懸液，所述助劑濃度為5-2(^/1菌懸液。4. 如權(quán)利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述菌懸液中腐敗希瓦氏菌濃度為108-10 13CFU/mL。5. 如權(quán)利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述催化劑的制備方法為:將腐敗希瓦氏菌接種至TSB培養(yǎng)基，在30°C下培養(yǎng)12小時(shí)，再以體 積濃度0.1-0.5 %的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的TSB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)12h，隨后以體積濃度0. Ιο. 5 % 的接種量接種到新鮮 TSB 培養(yǎng)基中， 30°C 培養(yǎng) 5h 至對數(shù)期 ，然后利用 TSB 培養(yǎng)基將培養(yǎng) 液稀釋成腐敗希瓦氏菌菌懸液;所述TSB培養(yǎng)基質(zhì)量濃度組成為:胰蛋白胨17g/L，大豆蛋白 胨3g/L，氯化鈉5g/L，磷酸氫二鉀2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH 7.3 ±0.2，溶劑為水。6. 如權(quán)利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述吐溫-80先與肉桂醛混合，在100Hz條件下超聲混合15min，制成肉桂醛乳化液，然后再將 肉桂醛乳化液加入腐敗希瓦氏菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌懸液中進(jìn)行加氫反應(yīng)。7. 如權(quán)利要求1所述利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，其特征在于所 述分離純化方法為:反應(yīng)完全后將反應(yīng)液離心，棄沉淀，上清液加入等體積二氯甲烷，搖床 震搖2-3h進(jìn)行萃取，離心，分出二氯甲烷層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得肉桂醇。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用腐敗希瓦氏菌選擇性加氫制備肉桂醇的方法，所述方法為：以腐敗希瓦氏菌(Shewanella？putrefaciens)經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌懸液為催化劑，以肉桂醛為底物，以吐溫-80為助劑，在pH值4.5-7.5、20-40℃、100-200rpm條件下進(jìn)行催化加氫反應(yīng)，反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液分離純化，獲得肉桂醇；本發(fā)明所述的利用腐敗希瓦氏菌催化由肉桂醛選擇性加氫制備肉桂醇的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有反應(yīng)條件溫和，成本低廉，選擇性好，轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)，肉桂醇的得率在80％以上。
【IPC分類】C12P7/22, C12R1/01
【公開號】CN105524950
【申請?zhí)枴緾N201610039007
【發(fā)明人】呂飛, 丁玉庭, 魏倩倩, 劉璘
【申請人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月20日