擬莖點霉rpb2基因擴增引物及其設(shè)計方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計擬莖點霉真菌鑒別技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及擬莖點霉RPB2基因擴增 引物及其設(shè)計方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]擬莖點霉屬(Phomopsis(Sacc · )Bubak)是半知菌亞門（Deuteromycotina)、腔孢綱 (Coelomycetes)、球殼抱目（Sphaeropsidales)、球殼抱科（Sphaeropsidaceae)中的重要真 菌屬，其有性態(tài)為間座殼屬(Diaporthe)。該屬真菌已描述900多種，呈世界性分布，主要集 中在熱帶和亞熱帶地區(qū)。擬莖點霉屬真菌是農(nóng)業(yè)和林業(yè)上重要的病原菌，在我國2007年頒 布的進境植物檢疫性有害生物名錄中，其中包括6種檢疫性擬莖點霉及其有形態(tài)真菌，分別 是黃瓜黑色根腐病菌（Phomopsis sclerotioides)、向日葵莖潰瘍病菌（Diaporthe helianthi)、蘋果果腐病菌(Diaporthe perniciosa)、大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum Sacc . var. caulivora)、大豆南方莖潰瘍病菌（Diaporthe phaseolorum Sacc. var. meridionalis)、藍莓果腐病菌（Diaporthe vaccinii)〇
[0003] RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymera-ses)在基因表達的過程中扮演著很重 要的角色。其中RNA聚合酶II由12個亞基組成(RTOl~RPB12)，負責轉(zhuǎn)錄生成hnRNA和mRNA。 RPB2(the second lar-gest RNA polymerase subunit)基因負責編碼RNA聚合酶II的第2 大亞基，具有單拷貝和進化速率慢的特點。目前RPB2基因片段廣泛用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、預(yù) 測種群結(jié)構(gòu)、評估種群進化過程、生態(tài)學(xué)研究以及確定分類地位等研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一對高效的擬莖點霉RPB2基因擴增引物。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述引物的設(shè)計方法。
[0006] 本發(fā)明的進一步目的是提供上述引物在擬莖點霉種類鑒定、地理種群鑒別和檢驗 檢疫中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明設(shè)計的擬莖點霉RPB2基因擴增引物，其上游引物PR2-F有44個堿基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46個堿基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
[0008] 本發(fā)明的擬莖點霉RPB2基因擴增引物設(shè)計的步驟為:登陸GenBank搜索目前已測 定全序列的60種擬莖點霉RPB2基因，去掉不完全和部分的序列，尋找保守序列，并在5 '端加 入測序序列，從而獲得一對通用引物：其上游引物P R 2 - F有4 4個堿基： CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46個堿基： AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。擴增片斷大小在 1000bp 左右。
[0009] 可擴增擬莖點霉屬真菌RPB2基因的通用引物PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下： PCR反應(yīng)體系為25yL，內(nèi)含2X Taq MasterMix、10yM的引物PR2-F和引物PR2-R、含50 ~150ng的DNA模板溶液、ddH20。
[0010] 擴增體系：2X Taq MasterMix 12.5yL、PR2-F lyL、PR2-R lyL、Template lyL、 ddH20 9.5yL〇
[0011] 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性3min，然后94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共35 個循環(huán)，最后在72°C充分延伸lOmin。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及 亮度。
[0012] 本發(fā)明所述的擬莖點霉RPB2基因增引物可擴增擬莖點霉RPB2基因片段，能獲得單 一的目的片段，產(chǎn)物大小為lOOObp左右，并可對PCR擴增產(chǎn)物進行直接測序。其步驟為:PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)初步定量后，濃度達lOOng/yL的樣品委托公司進行雙向直接測序，測序引物為 PR2-F(10yM)和PR2-R(10yM)，序列分析儀為ABI 3730型全自動DNA測序儀。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明的擬莖點霉RPB2基因擴增引 物對我國常見擬莖點霉真菌RPB2基因進行擴增，均能獲得單一的目的DNA片斷，特異性擴增 產(chǎn)物大小為l〇〇〇bp左右，經(jīng)測序及與GenBank上同源序列的比較，證實為擬莖點霉RPB2基 因的擴增產(chǎn)物。利用本發(fā)明設(shè)計的擬莖點霉RPB2基因擴增引物，可以對擬莖點霉屬真菌進 行大規(guī)模的遺傳背景分析，準確鑒定某些難于鑒別的近緣物種，為我國擬莖點霉種類鑒定、 地理種群鑒別或檢驗檢疫工作提供了重要的工具。
【附圖說明】
[0014] 圖1為PR2-F/PR2-R擴增不同擬莖點霉RPB2基因的電泳圖譜。
[0015] 其中M:DNA分子量標準（100bp DNA Ladder)，N:陰性對照，1 - 16:依次為大豆擬 莖點種腐病菌(Phomopsis longicolla)、黃瓜黑色根腐病菌(Phomopsis sclerotioides)、 小麥擬莖點霉（Phomopsis controversa)、茴香擬莖點霉（Phomopsis foeniculi)、十字花 擬莖點霉（Phomopsis cruciferae)、杏擬莖點霉（Phomopsis amygdali)、苘麻擬莖點霉 (Phomopsis abutilonis)、扁桃擬莖點霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯擬莖點霉 (Phomopsis fukushii)、蘆輿擬莖點霉(Phomopsis asparagi)、粽竹擬莖點霉(Phomopsis rhapidis)、前褐紋擬莖點霉（Phomopsis vexans)、棒擬莖點霉(Phomopsis cinnamom)、蔓 綠絨擬莖點霉(Phomopsis philodendri)、花燭擬莖點霉(Phomopsis anthurii)、蘋果擬莖 點菌（Phomopsis mali)〇
【具體實施方式】
[0016] 登陸GenBank搜索目前已測定序列的60種擬莖點霉RPB2基因，去掉不完全和部分 的序列，尋找保守序列，并在5'端加入測序序列，從而獲得一對通用引物:其上游引物PR2-F 有 44個堿基:CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R 有 46 個堿 基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。
[0017]可擴增擬莖點霉屬真菌RPB2基因的通用引物PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下： PCR反應(yīng)體系為25yL，內(nèi)含2X Taq MasterMix、10yM的引物PR2-F和引物PR2-R、含50 ~150ng 的DNA 模板溶液、ddH20。反應(yīng)體系為：2X Taq MasterMix 12.5yL、PR2-F lyL、 PR2-R lyL、Template lyL、ddH20 9.5yL。擴增條件為：94°C預(yù)變性3min，然后94°C變性30s， 56°C退火30s，72°C延伸60s，共35個循環(huán)，最后在72°C充分延伸10min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及亮度。
[0018]本發(fā)明所述的擬莖點霉RPB2基因增引物能擴增擬莖點霉屬真菌RPB2基因，均能獲 得單一的目的DNA片段，產(chǎn)物大小為lOOObp左右，并對所有PCR擴增產(chǎn)物進行直接測序。其 步驟為：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)初步定量后，濃度達lOOng/yL的樣品委托公司進行雙向直接測 序，測序引物為M13F-47(10yM)和RV-M(lOyM)，序列分析儀為ABI 3730型全自動DNA測序 儀。
[0019] 本發(fā)明的擬莖點霉RPB2基因擴增引物對我國常見擬莖點霉真菌RPB2基因進行擴 增，均能獲得單一的目的DNA片斷，特異性擴增產(chǎn)物大小為lOOObp左右，經(jīng)測序及與GenBank 上同源序列的比較，證實為擬莖點霉RPB2基因的擴增產(chǎn)物。其主要擴增的擬莖點霉真菌包 括以下種類：大豆擬莖點種腐病菌（Phomopsis 1〇1^4〇11&)、黃瓜黑色根腐病菌 (Phomopsis sclerotioides)、小麥擬莖點霉（Phomopsis controversa)、茴香擬莖點霉 (Phomopsis foenicul i )、十字花擬莖點霉（Phomopsis cruciferae )、杏擬莖點霉 (Phomopsis amygdali)、苘麻擬莖點霉（Phomopsis abutilonis)、扁桃擬莖點霉 (Phomopsis amygdal iana)、梨干枯擬莖點霉（Phomopsis fukushi i )、蘆輿擬莖點霉 (Phomopsis asparagi)、粽竹擬莖點霉（Phomopsis rhapidis)、前褐紋擬莖點霉 (Phomopsis vexans)、棒擬莖點霉（Phomopsis cinnamom)、蔓綠絨擬莖點霉（Phomopsis philodendri)、花燭擬莖點霉(Phomopsis anthurii)、蘋果擬莖點菌(Phomopsis mali)。其 電泳圖譜如圖1所示，從而可對擬莖點霉真菌進行分析鑒別。
【主權(quán)項】
1. 擬莖點霉RPB2基因擴增引物，其特征是將測序序列和擴增序列結(jié)合在一起，其上游 引物 PR2-F 有44個堿基:CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R 有 46 個堿基:AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。2. 權(quán)利要求1所述擴增引物的設(shè)計方法，其特征包括如下步驟:找出已測定全序列的60 種擬莖點霉RPB2基因，去掉不完全和部分序列，進行同源性比較，尋找保守序列，并在5'端 加入測序序列，從而獲得一對通用引物。3. 權(quán)利要求1中所述擬莖點霉RPB2基因擴增引物在物種鑒定、地理種群分析以及口岸 檢驗檢疫中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了擬莖點霉RPB2基因擴增引物及其設(shè)計方法和應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計的是針對擬莖點霉屬真菌的通用引物。其上游引物PR2-F有44個堿基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGCCTACATGAAGCGATG，下游引物PR2-R有46個堿基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAATCTCACAATGCGTGTACATGT。本發(fā)明設(shè)計的RPB2引物對擬莖點霉屬通用性強，擴增測序成功率高，具有合適的片段長度，便于高通量測序與分析，為擬莖點霉分子生態(tài)學(xué)研究以及檢疫鑒定工作提供了重要工具。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105567680
【申請?zhí)枴緾N201510872765
【發(fā)明人】胡佳續(xù), 劉鵬, 郭京澤, 王金成, 廖芳, 羅加鳳, 張瑩, 黃國明
【申請人】天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月2日