一種重組豬源抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本項(xiàng)發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及的是一種重組豬源抗菌肽及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著抗生素在飼料生產(chǎn)以及動(dòng)物養(yǎng)殖中的不斷應(yīng)用，許多問(wèn)題接踵而至，如抗生 素添加劑的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致耐藥性病原菌的產(chǎn)生，耐藥菌株的出現(xiàn)不僅威脅到了畜牧業(yè)，更 成為了人類(lèi)不得不面對(duì)的公共衛(wèi)生危機(jī)。因此，人們迫切需要開(kāi)發(fā)一種新型安全的抗菌物 質(zhì)作為飼料添加劑替代抗生素添加到飼料中，從而達(dá)到預(yù)防動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，降低 飼養(yǎng)成本目的。重組肽PR39是重組表達(dá)的一種豬源抗菌肽，含有39個(gè)氨基酸殘基。它不僅是 一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，與此同時(shí)還具有許多生物活性例如促進(jìn)傷口愈合、 促進(jìn)血管生成和降低炎癥反應(yīng)等作用。本研究利用基因工程方法在枯草芽胞桿菌中成功表 達(dá)了具有廣譜抗菌活性的重組抗菌肽PR39,為基因工程方法規(guī)?；a(chǎn)抗菌肽奠定了理論 與實(shí)踐基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種豬源抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用，是一種具有廣譜抗 菌活性的重組肽。
[0004] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種重組豬源抗菌肽PR39,其序列如序列 表Seq No.l所示。
[0005] 本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：
[0006] 1、如上所述的一種重組豬源抗菌肽PR39的制備方法，如下:根據(jù)枯草芽孢桿菌的 分泌特點(diǎn)以及下游純化技術(shù)特點(diǎn)，在豬源抗菌肽PR39基因上游融合信號(hào)肽AmyQ基因，六個(gè) 組氨酸基因，硫氧還蛋白基因以及腸激酶切位點(diǎn)基因，并在整條基因兩端添加酶切位點(diǎn) EcoRI和BamHI〇
[0007] 2、如上所述的一種重組豬源抗菌肽PR39,在治療革蘭氏陰性菌感染性疾病藥物中 的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的重組肽PR39是一種重組表達(dá)的豬源抗菌肽，它是一種具有廣譜抗菌活性 的小分子多肽，同時(shí)還具有許多生物活性例如促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)血管生成和降低炎癥反 應(yīng)等作用。其制備方法為基因工程方法規(guī)?；a(chǎn)抗菌肽奠定了理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，對(duì)建立 肽類(lèi)基因工程菌和抗菌肽研究的共性技術(shù)具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為目的基因片段酶切鑒定結(jié)果圖，
[0010] 其中，M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:空載體質(zhì)粒；2:重組表達(dá)載體質(zhì)粒；3:重組表達(dá)載體 EcoR I和BamH I雙酶切結(jié)果;4:空載體EcoR I和BamH I雙酶切結(jié)果。
[0011] 圖2為重組表達(dá)載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果圖。
[0012] 圖3為利用Tricine-SDS-PAGE對(duì)腸激酶切割融合蛋白的檢測(cè)結(jié)果圖，
[0013]其中，M:蛋白分子量Marker; 1:未切割的融合蛋白；2:切割后的融合蛋白。
[0014] 圖4為利用Tricine-SDS-PAGE純化后的PR39的檢測(cè)結(jié)果圖，
[0015] 其中，Μ:蛋白分子量Marker; 1和2均為利用陽(yáng)離子交換柱純化后的肽。
[0016]圖5為重組抗菌肽PR39的溶血活性分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0018] 實(shí)施例1目的基因的設(shè)計(jì)與合成
[0019] 根據(jù)枯草芽孢桿菌的分泌特點(diǎn)以及下游純化技術(shù)特點(diǎn)，在豬源抗菌肽PR39基因上 游融合信號(hào)肽AmyQ基因、六個(gè)組氨酸基因、硫氧還蛋白基因以及腸激酶酶切位點(diǎn)基因。具體 基因如下所示：
[0020] GCGGAATTCatgatccaaaaacgtaaacgtacagtttctttccgtcttgttcttatgtgcacacttcttttcgtttctct tcctatcacaaaaacatctgc l Q私·兌gcUUc組UiaagctacagaU:aateUtactgclgaaacatct沿i aggcgUgllcUgclgaUlctgggclccllgglgcggcccUgcaaaalgalcgclcclgllcUgaagaacUgalcaagaa atgggcgataaacttaaaatcgttaaaatcgatett^atgaaaaccaa^aaaGagctg^caaatac^gGgittatetctatccc lacaclLcUgilcUaaagaiggcgaagllgUgaaacalclgilggcUcaaacclaaagaagclcUcaagaacttgttaaca D^c^ic\Xgatgatgatgataaa cgtcgtcgtcctcgtcctccttaccttcctcgtcctcgtcctcctcctttcttccctcctcgtcttcctcctcgtat ccctcctggcttccctcctcgtttccctcctcgtttccctTAAGGATCC
[0021] 其中，下劃線(xiàn)為限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)，斜體為腸激酶酶切位點(diǎn)，虛線(xiàn)是組氨酸標(biāo) 簽，雙下劃線(xiàn)為硫氧還蛋白編碼基因，加粗大寫(xiě)為終止密碼子TAA。
[0022] 上述整條融合基因 AmyQ-6 X His-Thioredoxin-Enterokinase site_PR39由上海 生工生物技術(shù)有限公司合成。
[0023]實(shí)施例2重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0024]將合成的含有上述目的片段的克隆載體和表達(dá)載體PGJ148分別進(jìn)行BamH I、EcoR I雙酶切，再分別回收目的片段后進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物利用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌 WB800N中，提取質(zhì)粒，采用酶切和測(cè)序方法對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。結(jié)果如圖1-圖2所示。將鑒 定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為PAN39。
[0025]實(shí)施例3目的蛋白的表達(dá)及重組抗菌肽PR39的純化
[0026]將篩選的陽(yáng)性克隆接種到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，所得重組抗菌肽PR39利用 Ni-NTA親和層析柱純化，再進(jìn)行腸激酶酶切處理后，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE定性，考馬斯亮 藍(lán)定量分析以及質(zhì)譜分析。
[0027]實(shí)施例4抗菌活性的測(cè)定
[0028]利用微量肉湯稀釋法測(cè)定重組抗菌肽PR39的最小抑菌濃度。利用化學(xué)合成的抗菌 肽PR39和蜂毒素 ME26為對(duì)照，驗(yàn)證重組抗菌肽PR39的抑菌效果。以肉湯(MHB)培養(yǎng)基作為稀 釋液，使用2倍稀釋法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，每孔100此。然后分別添加等體積的待測(cè)菌液(~10 5個(gè)/mL)于各孔中。分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì) 照(含有菌液而不含有抗菌肽)和陰性對(duì)照(既不含菌液也不含肽）。37°(：恒溫培養(yǎng)20h，以肉 眼未見(jiàn)孔底部有混濁現(xiàn)象的即為最小抑菌濃度。利用化學(xué)合成的抗菌肽PR39和蜂毒素 ME26 為對(duì)照，驗(yàn)證重組抗菌肽PR39的抑菌效果。結(jié)果如表1所示。重組抗菌肽PR39對(duì)革蘭氏陰性 菌有良好的抑制效果。
[0029]表1重組抗菌肽PR39的最小抑菌濃度
[0030]
[0031]實(shí)施例5溶血活性的測(cè)定
[0032]采集雞的新鮮血液lmL，肝素抗凝后溶解到2mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS)溶液中， 1000g離心5min，收集紅細(xì)胞；用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3遍，再用10mL PBS重懸;取50yL 紅細(xì)胞懸液與50yL用PBS溶解的不同濃度的抗菌肽溶液混合均勻，在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵 育lh后取出，4°C、1000g離心5min;取出上清液用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)光吸收值;每組取平均 值，并比較分析。其中50yL紅細(xì)胞加50yL PBS作為陰性對(duì)照；50yL紅細(xì)胞加50yL 0.1% Tritonx-100作為陽(yáng)性對(duì)照。最小溶血濃度是抗菌肽引起10%溶血率時(shí)的抗菌肽濃度。結(jié)果 如圖4所示。表明重組抗菌肽PR39無(wú)溶血性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組豬源抗菌肽PR39，其特征在于，其序列如序列表Seq No. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豬源抗菌肽PR39，其特征在于，制備方法如下：根據(jù) 枯草芽孢桿菌的分泌特點(diǎn)以及下游純化技術(shù)特點(diǎn)，在豬源抗菌肽PR39基因上游融合信號(hào)肽 AmyQ基因，六個(gè)組氨酸基因，硫氧還蛋白基因以及腸激酶切位點(diǎn)基因，并在整條基因兩端添 加酶切位點(diǎn)EcoR I和BamH I。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豬源抗菌肽PR39在治療革蘭氏陰性菌感染性疾病藥 物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種重組豬源抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。重組豬源抗菌肽PR39，其序列如序列表Seq？No.1所示。制備方法是：利用基因工程方法人工合成PR39融合基因片段，并在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)了重組抗菌肽PR39。進(jìn)一步研究表明，重組抗菌肽PR39明顯抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)。本抗菌肽是一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，同時(shí)還具有許多生物活性例如促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)血管生成和降低炎癥反應(yīng)等作用。
【IPC分類(lèi)】C12N15/75, C07K14/47, A61K38/17, A61P31/04
【公開(kāi)號(hào)】CN105622744
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610177901
【發(fā)明人】單安山, 王玨
【申請(qǐng)人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年3月25日