一種己烯雌酚人工抗原及其制備的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種己烯雌酚人工抗原及其制備的抗體。己烯雌酚半抗原，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅰ所示。既保留了DES分子原有的立體結(jié)構(gòu)，又有利于特異性抗體的產(chǎn)生。己烯雌酚人工抗原，它為式Ⅰ所示化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。本發(fā)明還提供了以該己烯雌酚人工抗原為免疫原制備得到的抗體，及一種檢測己烯雌酚的試劑盒，它包括己烯雌酚半抗原和/或己烯雌酚人工抗原和/或抗體。
【專利說明】
一種己烯雌酚人工抗原及其制備的抗體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種己稀雌酸人工抗原及其制備的抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 己稀雌酸((1161：117181：；^681：1'〇1，0￡5)是一種人工合成的雌激素，具有促進動物生 長、增加蛋白質(zhì)沉積、提高飼料轉(zhuǎn)化率和減少脂肪沉積的作用，因此曾作為生長促進劑廣泛 用于畜禽養(yǎng)殖中。但DES可導(dǎo)致機體代謝紊亂和發(fā)育異常，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC)研究還 發(fā)現(xiàn)DES是一種致癌物，能夠在動物源性食品如肉、蛋、奶中殘留，并通過食物鏈危害人體健 康。因此歐盟等國規(guī)定禁止在食品動物養(yǎng)殖中使用DES，我國農(nóng)業(yè)部2002年先后發(fā)布了 176 號和193號公告，明確規(guī)定了禁止在所有食用動物飼養(yǎng)中使用己烯雌酚以促生產(chǎn)或其它用 途。
[0003] 目前，國內(nèi)外己建立了多種檢測DES殘留的理化檢測方法，主要包括高效液相色譜 法(HPLC)，液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)，但儀器方法樣品前處理過程復(fù)雜，檢測時間長，儀器設(shè)備昂 貴，且需專業(yè)人員操作，嚴(yán)重限制了這種方法的推廣和應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附法卜!!^!^-linked immunosorbent assay, ELISA)具有特異性強、簡便、快速、成本低等優(yōu)點，目前已廣 泛應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域。而基于酶聯(lián)免疫吸附法的快速檢測試劑盒，更適合企業(yè)進行 現(xiàn)場監(jiān)測，方便實用，易于推廣，是目前食品安全檢測領(lǐng)域中最具有發(fā)展前景和產(chǎn)業(yè)化的檢 測手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種己烯雌酚人工抗原及其制備的抗體，本發(fā)明在DES分子 結(jié)構(gòu)中的一個酚羥基的位置引入羧基制得己烯雌酚半抗原，再與蛋白質(zhì)交聯(lián)形成偶聯(lián)物制 得己烯雌酚全抗原，既保留了 DES分子原有的立體結(jié)構(gòu)，又有利于特異性抗體的產(chǎn)生。
[0005] 本發(fā)明提供的己烯雌酚半抗原，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0007] 上述己烯雌酚半抗原(式I所示化合物)的制備方法，包括如下步驟：
[0008] (1)己烯雌酚與式II所示化合物經(jīng)取代反應(yīng)(Williamson成醚反應(yīng)），得到式m所 示化合物(己烯雌酚丁酸乙酯中間體）；式n中，X為氯、溴或碘；
[0010] (2)式m所示化合物（己烯雌酚丁酸乙酯中間體)經(jīng)水解反應(yīng)，得到式i所示化合 物。
[0011] 上述的制備方法中，步驟（1)中，所述乙烯雌酚與所述4-溴丁酸乙酯的摩爾比為1: (1~1.2)，具體為1:1;和/或，
[0012] 所述取代反應(yīng)在堿的條件下進行，所述堿與所述己烯雌酚的摩爾比可為1:(1~ 1.2)，具體為1:1;所述堿可為氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鋰中的任一種；
[0013] 所述取代反應(yīng)在有機溶劑中進行，所述有機溶劑可為二甲基甲酰胺(DMF)或二甲 基亞砜(DMS0);和/或，
[0014] 所述取代反應(yīng)的溫度可為35~40 °C，具體可為35°C;時間可為1~2小時，具體可為 1小時。
[0015] 上述的制備方法，步驟(2)中，所述水解反應(yīng)(酯的水解)在堿的條件下進行，所述 堿可為氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀中的任一種;所述式n所示化合物與所述堿的摩爾 比可為1: (3~4)，具體可為1:3;所述堿以堿的水溶液的形式添加，所述堿的水溶液的摩爾 濃度可為1~1.2mol/L，具體可為lmol/L;和/或，
[0016] 所述水解反應(yīng)的溫度可為35~40°C，具體可為35°C，時間可為1~2小時，具體可為 1小時。
[0017]本發(fā)明提供的己烯雌酚人工抗原，它為上述己烯雌酚半抗原(式I所示化合物)與 載體蛋白的偶聯(lián)物。所述偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)式如式IV所示：
-載鉢蛋白
[0019] 上述的偶聯(lián)物中，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白（BSA)或雞卵清白蛋白（0VA)。
[0020] 上述的偶聯(lián)物中，己烯雌酚半抗原（式I所示化合物）與載體蛋白的偶聯(lián)比（摩爾 比）可為（3~10): 1，具體可為5.65:1或3.61:1。該己烯雌酚人工抗原可以作為免疫原也可 以作為包被原。將該己烯雌酚人工抗原免疫動物，可獲得高特異性的多克隆抗體，方法簡 便、易行。
[0021] 本發(fā)明還提供了上述的偶聯(lián)物在制備己烯雌酚抗體中的應(yīng)用。
[0022] 上述的應(yīng)用中，所述抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體。
[0023] 本發(fā)明提供的抗體，它為以上述任一項所述的偶聯(lián)物為免疫原制備得到的抗體。 [0024]本發(fā)明還提供了一種試劑盒，它包括己烯雌酚半抗原(式I所示化合物)和/或己烯 雌酚人工抗原(偶聯(lián)物)和/或所述的抗體。
[0025]己烯雌酚是小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，無法直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生 特異性抗體，因此需要與大分子共價結(jié)合后才能使動物免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本 發(fā)明利用4-溴丁酸乙酯與DES進行反應(yīng)，在酚羥基的位置引入羧基，再與蛋白質(zhì)交聯(lián)形成 DES-BSA偶聯(lián)物，與文獻報道方法相比，既保留了DES分子原有的立體結(jié)構(gòu)，又有利于特異性 抗體的產(chǎn)生。經(jīng)質(zhì)譜掃描鑒定，免疫產(chǎn)生高滴度抗體證實，得到了具有免疫原性和特異反應(yīng) 性的人工抗原。
【附圖說明】
[0026]圖1為己烯雌酚半抗原的合成線路圖。
[0027] 圖2為己烯雌酚半抗原的HPLC-MS圖譜。
[0028] 圖3為牛血清蛋白BSA和免疫原DES-BBAE-BSA的MALDI-T0F圖譜，其中圖3 (a)為牛 血清蛋白的MALDI-T0F圖譜，3(b)為免疫原DES-BBAE-BSA的MALDI-T0F圖譜。
[0029]圖4為實施例5中間接EL ISA法測定所得血清的IC5Q的曲線圖。
【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0033]己烯雌酚原料藥購于大連美侖生物技術(shù)有限公司，其結(jié)構(gòu)式如式V所示：
[0035]牛血清白蛋白（BSA)、雞卵清白蛋白（0VA)、l-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺 鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、4-溴丁酸乙酯、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均 購自Sigma公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。新西蘭大白兔:北京市實驗動物中心。
[0036]實施例1、制備己烯雌酚半抗原
[0037] -、制備過程
[0038] 按照圖1所示合成線路圖進行制備，具體步驟如下：
[0039] (1)將536mg己稀雌酸原料藥溶于5mLDMF，攪拌15min后于室溫加入68 ? 57mg70%的 氫化鈉，磁力攪拌反應(yīng)1小時。然后滴加390mg 4-溴丁酸乙酯磁力攪拌反應(yīng)1小時，將反應(yīng)液 滴加到45ml冰水中析出類白色固體，過濾，濾餅用10ml水洗，收集濾餅45 °C鼓風(fēng)干燥4小時， 得到己烯雌酚丁酸乙酯中間體。
[0040] (2)在圓底燒瓶中加入500mg己烯雌酚丁酸乙酯中間體和10ml THF，25°C磁力攪拌 20min后滴加3.5ml 1M氫氧化鋰水溶液，磁力攪拌3小時后40°C減壓濃縮，殘留物中加入 20ml水，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.5-6.0,析出類白色固體，過濾，濾餅用10ml水洗，收集濾餅45°C 鼓風(fēng)干燥5小時得到己烯雌酚丁酸半抗原，簡稱DES-BBAE。
[0041] 二、表征
[0042] 半抗原DES-BBAE經(jīng)HPLC-MS鑒定，結(jié)果見圖2JES-BBAE的分子量理論應(yīng)為354,此 次鑒定試驗采用的是負(fù)離子模式，由此可知353.5對應(yīng)的峰對應(yīng)的峰即為半抗原DES-BBAE， 說明半抗原DES-BBAE合成成功。
[0043]實施例2、制備己烯雌酚人工抗原
[0044] 一、己烯雌酚免疫原
[0045] 1、己烯雌酚免疫原的制備過程
[0046] 按照如下步驟制備免疫原(DES-BBAE-BSA):
[0047] (1)將15.86mg實施例1中制備得到的己烯雌酚半抗原用1.5mL DMF溶解，200rpm攪 拌lOmin，加入21.5mg EDC，溶解后再加入13mg NHS，室溫攪拌（500rpm)活化2h。
[OO48] (2)稱取50mg牛血清白蛋白溶于3.5mL 0? 1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌lOmin， 使其充分溶解，將步驟1反應(yīng)液在反應(yīng)盒中冰?。?lt;4°C)攪拌（lOOOrpm)中逐滴加入（lmL/ min)，攪拌(500rpm)反應(yīng)24h。
[0049] (3)將反應(yīng)產(chǎn)物裝入干凈透析袋，在1L 0.01M PBS(pH7.2)透析液中4°C攪拌 (lOOrpm)透析3天，每天換液3次，將透析產(chǎn)物5000rpm離心6min，1.5mL/管分裝，得到己稀雌 酚免疫原，簡稱DES-BBAE-BSA，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 2、己烯雌酚免疫原的表征
[00511采用MALDI-T0F技術(shù)，對合成的抗原進行鑒定，牛血清蛋白BSA質(zhì)譜峰質(zhì)荷比為 66538.973，人工抗原DES-BBAE-BSA的質(zhì)譜峰質(zhì)荷比分別為68539.643，見圖3，說明半抗原 DES-BBAE成功結(jié)合了 BSA，經(jīng)計算其結(jié)合比為5.65:1。
[0052] 二、己烯雌酚包被原
[0053] 1、己烯雌酚包被原的制備過程
[0054] (1)將15.86mg實施例1中制備得到的己烯雌酚半抗原用1.5mL DMF溶解，200rpm攪 拌lOmin，加入21.5mg EDC，溶解后再加入13mg NHS，室溫攪拌（500rpm)活化2h。
[0055] (2)稱取33.6mg雞卵清白蛋白溶于3.5mL 0.1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌 lOmin，使其充分溶解，將步驟1反應(yīng)液在反應(yīng)盒中冰浴(<4°C)攪拌（lOOOrpm)中逐滴加入 (lmL/min)，攪拌（500rpm)反應(yīng)24h。
[0056] (3)將反應(yīng)產(chǎn)物裝入干凈透析袋，在1L 0.01M PBS(pH7.2)透析液中4°C攪拌 (lOOrpm)透析3天，每天換液3次，將透析產(chǎn)物5000rpm離心6min，1.5mL/管分裝，得到己稀雌 酚包被原，簡稱DES-BBAE-OVA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0057] 2、表征
[0058] 采用TNBS法測定結(jié)合比，己烯雌酚包被原DES-BBAE-OVA的結(jié)合比3.61:1。
[0059]實施例3、多克隆抗體的制備
[0060]以實施例2制備得到的DES-BBAE-BSA作為免疫原，免疫3-4月齡新西蘭大白兔。首 次免疫，將制備好的免疫原與等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，于腋下、頸背部皮下多點注 射。加強免疫，將弗氏完全佐劑換成弗氏不完全佐劑，免疫劑量和免疫方法同上。每次免疫 間隔為3周。從第四次免疫起，每次免疫的第七天于耳緣靜脈采血，用間接競爭ELISA法檢測 抗體效價和IC5Q。待抗體性能參數(shù)達到要求后，心臟采血，離心分離多抗血清(抗體）。
[0061] 實施例4、抗體純化
[0062]以protein A-Sepharose 4B作為親和層析介質(zhì)，采用免疫親和層析法對多抗血清 進行純化。用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液(3 .Omol/L的NaCl，100mmol/L檸檬酸/磷酸鹽緩沖液， pH9.0)沖洗柱子，流速為5ml/min，用磷酸緩沖液稀釋多抗血清后上柱，流速為0.5ml/min， 繼續(xù)添加結(jié)合緩沖液，當(dāng)280nm的吸光值回到基線時，加洗脫緩沖液（100mM檸檬酸/磷酸鹽 緩沖液，pH3.0)，流速0.5ml/min，迅速用1M Tri s中和抗體，將抗體裝入透析袋，4°C條件下 PBS溶液透析，測定濃度，4 °C保存。
[0063]實施例5、抗體效價、IC5Q的確定
[0064] (1)采用間接ELISA法測定實施例4所得血清的抗體效價，具體步驟如下：
[0065] 1)包被:96孔酶標(biāo)板每孔加入100此濃度為2iig/mL的"己烯雌酚-0VA"溶液（用包被 緩沖液進行稀釋），4°C包被過夜，用PBST洗滌3次。
[0066]包被緩沖液:pH9.6、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(溶劑為水，溶質(zhì)及其濃 度如下：Na2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0067] 2)封閉：每孔加入150yL/孔的封閉液，在37°C孵育2h，棄封閉液，PBST洗滌3次，拍 干。置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0068]封閉液:含有0.5% (體積百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸鹽緩 沖液，PH7.4。
[0069] 3)競爭反應(yīng)：每孔加入100yL實施例4制備的血清的梯度稀釋液（采用pH7.4、 0.01m〇l/L的PBS緩沖液進行梯度稀釋），37°C孵育30min，洗板4次，拍干。采用將未經(jīng)任何免 疫的4月齡的雌性新西蘭大白兔的血清作為實施例4制備的血清的陰性對照。采用pH7.4、 0.01m〇l/L的PBS緩沖液作為血清稀釋液的空白對照。
[0070] 4)加酶標(biāo)二抗：HRP標(biāo)羊抗兔IgG抗體（Jackson ImmunoResearch公司，貨號 111- 035-003)，100yl/孔，37°C 孵育 30min，PBST洗滌 4次，拍干。
[0071] 5)顯色：四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-雙氧水溶液100ul/孔，室溫顯色15min。
[0072] 6)終止：加入終止液（2M H2S〇4)50yl/孔。
[0073] 7)讀數(shù)：以450nm單波長測定各孔0D值，以與陰性對照孔（以PBS代替待測樣品的對 照)0D值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為血清效價的臨界點。其中P/N =(標(biāo)本OD45〇nm 值一空白對照〇D45Qr?值)/ (陰性對照0D45Qr?值一空白對照0D45Qr?值）。
[0074] ELISA結(jié)果判定方法:抗體效價以P/N>2.1的血清最大稀釋倍數(shù)表示。
[0075]結(jié)果表明血清中的抗體效價為1:10000。
[0076] (2)采用間接ELISA法測定所得血清的IC5Q，具體步驟如下：
[0077] 1)包被:96孔酶標(biāo)板每孔加入100此濃度為2iig/mL的"己烯雌酚-0VA"溶液（用包被 緩沖液進行稀釋），4°C包被過夜，用PBST洗滌3次。
[0078]包被緩沖液:pH9.6、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(溶劑為水，溶質(zhì)及其濃 度如下：Na2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0079] 2)封閉：每孔加入150yL/孔的封閉液，在37 °C孵育2h，棄封閉液，PBST洗滌3次，拍 干。置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0080] 封閉液:含有0.5% (體積百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸鹽緩 沖液，PH7.4。
[00811 3)競爭反應(yīng)：陽性孔中先后加入己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液和己烯雌酚抗體各50ul，以 1 OmM PBS代替己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為陰性對照孔。37 °C孵育30min，洗板4次，拍干。
[0082] 4)加酶標(biāo)二抗：HRP標(biāo)羊抗兔IgG抗體（Jackson ImmunoResearch公司，貨號 111- 035-003)，100yl/孔，37°C 孵育 30min，PBST洗滌 4次，拍干。
[0083] 5)顯色：四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-雙氧水溶液100ul/孔，室溫顯色15min。
[0084] 6)終止：加入終止液（2M H2S〇4)50yl/孔。
[0085] 7)讀數(shù)：以450nm單波長測定各孔0D值，即0D45Qnm。以己烯雌酚濃度為橫坐標(biāo)，以B/ Bo為縱坐標(biāo)建立曲線。B為加入己烯雌酚溶液后得到0D45Qnm值，Bo為加入PBS緩沖液后得到的 0D45Q?值。曲線見圖4。IC5Q為0.025ng/mL。
【主權(quán)項】
1. 式I所示化合物；2. 權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，包括如下步驟： (1) 己烯雌酚與式π所示化合物經(jīng)取代反應(yīng)，得到式m所示化合物;式π中，X為氯、溴 或碘；(2) 式m所示化合物經(jīng)水解反應(yīng)，得到式I所示化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟（1)中，所述乙烯雌酚與所述4-溴 丁酸乙酯的摩爾比為1:(1~1.2);和/或， 所述取代反應(yīng)在堿的條件下進行，所述堿與所述己烯雌酚的摩爾比為1:(1~1.2);所 述堿具體為氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鋰中的任一種;和/或， 所述取代反應(yīng)在有機溶劑中進行，所述有機溶劑為二甲基甲酰胺或二甲基亞砜；和/ 或， 所述取代反應(yīng)的溫度為35~40 °C，時間為1~2小時。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述水解反應(yīng)在堿的 條件下進行;所述式Π 所示化合物與所述堿的摩爾比為1: (3~4);所述堿具體為氫氧化鋰、 氫氧化鈉和氫氧化鉀中的任一種;和/或， 所述堿以堿的水溶液的形式添加，所述堿的水溶液的摩爾濃度為1~1.2mol/L;和/或， 所述水解反應(yīng)的溫度為35~40 °C，時間為1~2小時。5. 權(quán)利要求1所述化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的偶聯(lián)物，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白或雞卵清 白蛋白。7. 權(quán)利要求5或6所述的偶聯(lián)物在制備己烯雌酚抗體中的應(yīng)用。8. 以權(quán)利要求5或6所述的偶聯(lián)物為免疫原制備得到的抗體。9. 一種檢測己烯雌酚的試劑盒，它包括權(quán)利要求1所述的化合物和/或權(quán)利要求5或6所 述的偶聯(lián)物和/或權(quán)利要求8所述的抗體。
【文檔編號】C07K14/765GK105820033SQ201610247793
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】霍峰, 林曉莉, 董艷峰, 秦譽, 覃丹鳳, 賈良曦, 李寧, 彭瑋, 于靜泉, 張巍, 張治成, 梅巖松, 張磊, 劉中成, 梁代華
【申請人】哈爾濱市獸藥飼料監(jiān)察所, 北京維德維康生物技術(shù)有限公司, 谷實農(nóng)牧集團股份有限公司