一種嘌呤霉素衍生物及其制備與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種式(Ⅰ)所示嘌呤霉素衍生物及其制備與應(yīng)用，本發(fā)明首次通過工程化生物合成的方法生產(chǎn)出一種新型的能夠抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的化合物12?去甲基?dutomycin；12?去甲基?dutomycin對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌活性顯著高于其來源的天然化合物dutomycin；本發(fā)明的利用生物合成方法生產(chǎn)抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的化合物12?去甲基?dutomycin的方法及其提取工藝產(chǎn)物產(chǎn)量最高可達(dá)44mg/L，不受原料來源限制，操作過程易控制，生產(chǎn)成本低。
【專利說明】
一種嘌昤霉素衍生物及其制備與應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種革蘭氏陽性細(xì)菌抑制劑，特別涉及一種嘌呤霉素衍生物及其制備 與應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 傳染性疾病是世界上導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。在細(xì)菌傳染性疾病治療中抗 生素扮演著重要角色并且已經(jīng)拯救了數(shù)百萬人的生命。自從1928年發(fā)現(xiàn)了世界上第一種抗 生素一一青霉素以來，大量具有抗菌活性的天然化合物被分離出來并用作抗傳染性藥物， 例如四環(huán)素和卡那霉素。但是抗生素的過度使用也導(dǎo)致了微生物產(chǎn)生抗藥性。例如一種革 蘭氏陽性細(xì)菌，即耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)被看作是"超級"細(xì)菌，因?yàn)樗鼘Π?甲氧西林在內(nèi)的治療具有抗性。這些耐藥病原菌的傳播對人類健康構(gòu)成了巨大的威脅。因 此我們目前迫切需要發(fā)現(xiàn)一種新的，可以有效抑制MRSA和其它革蘭氏陽性病原細(xì)菌的抗生 素。天然產(chǎn)物是新藥的一種重要來源，包括四環(huán)素、青霉素、萬古霉素在內(nèi)的很多應(yīng)用于臨 床的抗生素都是天然產(chǎn)物。放線菌是很多抗生素的主要生產(chǎn)菌，如鏈霉菌MK277-AF1合成的 天然化合物polyketomycin以及本發(fā)明中美濃鏈霉菌合成的天然化合物dutomycin均被證 明具有顯著的革蘭氏陽性細(xì)菌抗菌活性。從自然界中不斷尋找新的抗菌分子是推動新抗生 素發(fā)展的關(guān)鍵，但通過傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)的新抗生素活性有限，且這些方法通常耗時(shí)耗力，同時(shí) 需要大量的天然產(chǎn)物資源用于抗菌活性化合物的篩選，而近年來興起的工程化生物合成的 方法可以節(jié)省抗生素發(fā)現(xiàn)過程中的時(shí)間和資源，并且代表了一個(gè)有吸引力的方法來創(chuàng)造多 樣性的抗菌活性分子化合物庫，以從中篩選抗菌活性更好的"非天然的"天然產(chǎn)物。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是通過工程化生物合成的手段生產(chǎn)一種天然抗菌活性化合物嘌呤霉 素(dutomycin)衍生物，其革蘭氏陽性細(xì)菌的抗菌活性顯著高于dutomycin，提取產(chǎn)物產(chǎn)率 高，不受原料來源限制，操作過程易控制。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種式（I)所示嘌呤霉素衍生物（即12-去甲基-dutomycin)，
[0007] 所述噪呤霉素(dutomycin)如式（n )所示：
[0009] 本發(fā)明還提供一種所述嘌呤霉素衍生物的制備方法，所述方法為:將美濃鏈霉菌 重組菌株接種在YM培養(yǎng)基中，在30 °C、250rpm下培養(yǎng)3-7天，培養(yǎng)物分離純化，獲得所述嘌呤 霉素衍生物;所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌的甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除構(gòu)建 而成;所述YM培養(yǎng)基質(zhì)量終濃度組成為:酪蛋白胨0.5 %、麥芽浸粉0.3 %、葡萄糖1 %、酵母 浸粉〇. 3%，50yg/mL安普霉素，溶劑為去離子水，pH 6.2。
[0010] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌（Streptomyces minoensisMTCC 19787的甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除構(gòu)建而成，具體構(gòu)建方法為：以美濃 鏈霉菌ATCC 19787基因組DNA為模板，使用引物DutMTl-F:5'_ AAAAGCTTCCTGCGCGACATGGTCCTGT-3 ' 和引物DutMT1 -R : 5 ' -AATCTAGACGACCAGGTTCTCGATCACG-3'通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增用于基因敲除實(shí)驗(yàn)的長度為 0.6kb左右的基因組DNA片段，通過限制性核酸內(nèi)切酶Hindlll和Xbal將上述擴(kuò)增反應(yīng)得到 的DNA片段連接到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139中，即得本發(fā)明所需的甲基轉(zhuǎn)移酶 DutMTl基因敲除質(zhì)粒pSW91;將基因敲除質(zhì)粒pSW91通過氯化鈣介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大 腸桿菌PUZ8002中，再通過接合作用將基因敲除質(zhì)粒pSW91轉(zhuǎn)移到美濃鏈霉菌野生型菌株 中，將包含基因敲除質(zhì)粒PSW91的美濃鏈霉菌接種在MS固體培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)20天，再 挑取菌落到3mL TSB培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)5天，然后取50yL培養(yǎng)液涂布到ISP4固體培養(yǎng)基 上，在37 °C培養(yǎng)5天，獲得敲除了甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl的美濃鏈霉菌重組菌株。
[0011] 進(jìn)一步，所述培養(yǎng)物分離純化方法為:培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物用等體積的乙酸乙酯 萃取(優(yōu)選萃取3次，合并萃取液），萃取液干燥去除乙酸乙酯，再用甲醇溶解后，在60目的硅 膠柱上用體積比為100:0、75:25、50:50、25:75、0:100的氯仿-甲醇溶液進(jìn)行洗脫，通過液相 色譜檢測流出液，收集體積比75:25氯仿-甲醇溶液的流出液，再將所述流出液利用液相色 譜分離，用流速為lmL/min的乙腈-水混合液梯度洗脫，在20分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由70: 30逐漸提高到75:25，收集目標(biāo)流出液，獲得所述嘌呤霉素衍生物。
[0012]進(jìn)一步，所述萃取液在40 °C下真空干燥至恒重。
[0013]進(jìn)一步，所述收集目標(biāo)流出液是在保持乙腈-水的體積比為75 :25再洗脫10分鐘， 收集在26.5-27.2分鐘的流出液。
[0014] 本發(fā)明還提供一種所述嘌呤霉素衍生物在制備革蘭氏陽性細(xì)菌活性抑制劑中的 應(yīng)用，所述嘌呤霉素衍生物對革蘭氏陽性細(xì)菌的最小抑菌濃度為〇. 125yg/mL。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：
[0016] (1)首次通過工程化生物合成的方法生產(chǎn)出一種新型的能夠抑制革蘭氏陽性細(xì)菌 的化合物12-去甲基-dutomycin;
[0017] (2)生物合成的化合物12-去甲基-dutomycin對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌活性顯著 高于其來源的天然化合物dutomycin;
[0018] (3)本發(fā)明的利用生物合成方法生產(chǎn)抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的化合物12-去甲基- dutomycin的方法及其提取工藝產(chǎn)物產(chǎn)量最高可達(dá)44mg/L，不受原料來源限制，操作過程易 控制，生產(chǎn)成本低。 (四）
【附圖說明】
[0019]圖1:美濃鏈霉菌重組菌株中甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除的PCR驗(yàn)證結(jié)果；1為以美 濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA為模板，用引物M13-47與DutMTl-Checkl進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié) 果;2為以美濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA為模板，用引物RM-V與DutMTl-Check2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的結(jié)果;3為以美濃鏈霉菌重組菌株基因組DNA為模板，用引物M13-47與DutMTl-Checkl 進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;4為以美濃鏈霉菌重組菌株基因組DNA為模板，用引物RM-V與DutMTl-Check2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果;5為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0020]圖2液相色譜純化目標(biāo)化合物過程的檢測結(jié)果，（i)來源于實(shí)施例1美濃鏈霉菌野 生型菌株的培養(yǎng)液；（ii)來源于實(shí)施例1甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因被敲除的美濃鏈霉菌重組 菌株的培養(yǎng)液；（i i i)來源于實(shí)施例6甲基轉(zhuǎn)移酶DutMT2基因被敲除的美濃鏈霉菌重組菌株 的培養(yǎng)液；（iv)來源于實(shí)施例7糖基轉(zhuǎn)移酶DutGT2基因被敲除的美濃鏈霉菌重組菌株的培 養(yǎng)液。
[0021 ] 圖3 dutomycin與12-去甲基-dutomycin的質(zhì)譜檢測圖。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0023] 實(shí)施例1
[0024] (1)甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
[0025] 用植物基因組DNA提取試劑盒純化菌株編號為ATCC 19787的美濃鏈霉菌 (Streptomyces minoensis)野生型菌株的基因組DNA;以純化的美濃鏈霉菌野生型菌株基 因組DNA作為模板，使用引物DutMTl-F: 5 ' -AAAAGCTTCCTGCGCGACATGGTCCTGT-3 ' 和引物 DutMTl-R:5'-AATCTAGACGACCAGGITCTCGATCACG-3'通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增用于基因敲除 實(shí)驗(yàn)的長度為0.61cb左右的基因組DNA片段，通過限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和XbaI將上述 擴(kuò)增反應(yīng)得到的DNA片段連接到大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139中，即得本發(fā)明所需的 甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除質(zhì)粒pSW91;上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系包括：10 X擴(kuò)增緩沖液 1 〇此，4種dNTP混合物各200wiio 1 /L，2種引物各1 Opmo 1，模板DNA0.5yg，Taq DNA聚合酶2.5酶 活力單位，Mg2+1.5mmol/L，加雙蒸水至100yL;反應(yīng)的條件為98°C 15秒，60°C 15秒，72°C 30 秒，30個(gè)循環(huán)。
[0026] 上述的美濃鏈霉菌（Streptomyces minoensis)野生型菌株購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品 收藏中心(ATCC)，編號為ATCC 19787;植物基因組DNA提取試劑盒及大腸桿菌-鏈霉菌穿梭 載體pKCl 139購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Taq DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切 酶Hindlll和Xbal及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需生化試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；引物 DutMTl -F和DutMTl -R訂購自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0027] (2)美濃鏈霉菌中甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因的敲除
[0028]參照《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(第2版)介紹的方法，將基因敲除質(zhì)粒pSW91通過氯化 鈣介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入大腸桿菌PUZ8002中，再通過接合作用將基因敲除質(zhì)粒pSW91轉(zhuǎn) 移到美濃鏈霉菌野生型菌株中，將包含基因敲除質(zhì)粒PSW91的美濃鏈霉菌接種在MS固體培 養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)20天，再挑取菌落到3mL TSB培養(yǎng)基中，在28°C培養(yǎng)5天，然后取50yL培 養(yǎng)液涂布到ISP4固體培養(yǎng)基上。在37°C培養(yǎng)5天，長出的菌株應(yīng)該為敲除了甲基轉(zhuǎn)移酶 DutMTl的美濃鏈霉菌重組菌株。所述MS固體培養(yǎng)基質(zhì)量終濃度組成為:硝酸鉀0.19%、硝酸 銨0. 165 %、磷酸二氫鉀0.017 %、七水硫酸鎂0.037 %、二水氯化鈣0.044 %、碘化鉀 0.000083 %、硼酸0.00062 %、四水硫酸錳0.00223 %、七水硫酸鋅0.00086 %、二水鉬酸鈉 0 ? 000025 %、五水硫酸銅0 ? 0000025%、氯化鈷0 ? 0000025%、乙二胺四乙酸二鈉0 ? 00373 %、 七水硫酸亞鐵0.00278%、肌醇0.01 %、甘氨酸0.0002%、鹽酸硫胺素0.00001 %、鹽酸吡哆 醇0.00005 %、煙酸0.00005 %、蔗糖3 %、瓊脂0.7 %，溶劑為去離子水，pH值7.0;滅菌;所述 TSB培養(yǎng)基終濃度組成為:胰蛋白胨1.5 %、大豆蛋白胨0.5 %、氯化鈉0.5 %，溶劑為去離子 水，pH 7.2，滅菌后添加安普霉素50yg/mL;所述ISP4固體培養(yǎng)基終濃度組成為:可溶性淀粉 1 %、磷酸氫二鉀0.1 %、七水硫酸鎂0.1 %、氯化鈉0.1 %、硫酸銨0.2 %、碳酸鈣0.2 %、七水 硫酸亞鐵0.0001 %、七水氯化錳0.0001 %、瓊脂2%，滅菌后添加安普霉素50yg/mL，溶劑為 去咼子水，pH值7.0;
[0029] 上述配制培養(yǎng)基所用的化學(xué)試劑購自杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，生化試劑及大 腸桿菌PUZ8002購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0030] (3)美濃鏈霉菌重組菌株中甲基轉(zhuǎn)移酶Du tMT 1基因敲除的驗(yàn)證
[0031]用植物基因組DNA提取試劑盒純化步驟(2)美濃鏈霉菌重組菌株的基因組DNA，分 別以純化的美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株的基因組DNA作為模板，分別使用引物M13-47:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ,與引物DutMTl-Checkl:5,-ATGACAGCTCCCGCTCTCGAA-3 '，以及引物RM-V: 5 ' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ' 與引物 DutMTl-Check2: 5 '-ATTTAITGGCGTCATCAGGTTGT-3 '，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)證明美濃鏈霉菌 重組菌株中甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因被成功敲除；上述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的體系包括：10 X擴(kuò) 增緩沖液1〇此，4種dNTP混合物各200wnol/L，2種引物各lOpmol，模板DNA0.5yg，Taq DNA聚 合酶2.5酶活力單位，1%2+1.5111111〇1/1，加雙蒸水至100此;反應(yīng)的條件為98°(：15秒，60°(：15 秒，72°C 30秒，30個(gè)循環(huán)；如圖1所示：以美濃鏈霉菌重組菌株的基因組DNA作為模板，能夠 擴(kuò)增得到一段長度為〇.9kb左右的基因片段，而以美濃鏈霉菌野生型菌株的基因組DNA作為 模板，無法擴(kuò)增得到該基因片段。
[0032]植物基因組DNA提取試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；引物組3_ 47、0此]?1'1-〇^^1^1、1^，和0此]\〇'1-〇16〇1^2訂購自生工生物工程（上海）股份有限公司；丁39 DNA聚合酶及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所需生化試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0033] (4)新型化合物的提取、分析和純化
[0034]將美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株分別接種在1L的YM培養(yǎng)基中，在30°C、 250rpm下培養(yǎng)3天，用等體積的乙酸乙酯對上述培養(yǎng)物萃取三次，將萃取液合并，在40 °C下 真空干燥至恒重，用甲醇再溶解后，在60目的硅膠柱上用體積比為100:0、75:25、50:50、25: 75、0:100的氯仿-甲醇（v/v)溶液進(jìn)行洗脫，可得到5個(gè)組分，通過液相色譜檢測不同的組 分，確定在75: 25的洗脫組分中包含目標(biāo)化合物，再將該組份在液相色譜上用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(5wii，250mmX4.6mm)分離，用流速為lmL/min的乙腈-水混合液梯 度洗脫，在20分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由70:30逐漸提高到75: 25，保持乙腈-水的體積比為 75:25再洗脫10分鐘，分別收集在24.5-26分鐘或26.5-27.2分鐘的流出液，最終分別從美濃 鏈霉菌野生型菌株與重組菌株的培養(yǎng)物中分離得到38mg(產(chǎn)量38mg/L)與30mg(產(chǎn)量30mg/ L)兩種純的化合物;對這兩種化合物進(jìn)行了核磁共振和質(zhì)譜分析，證明它們分別為已知化 合物d u t 〇 my c i n及其去甲基的衍生物，該衍生物為一種新型的化合物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)，命名為 12-去甲基-dutomyc in;表1、2為dutomycin與12-去甲基-dutomycin的核磁共振數(shù)據(jù)；圖2為 使用液相色譜純化目標(biāo)化合物過程的檢測圖；圖3為dutomycin與12-去甲基-dutomycin的 質(zhì)譜檢測結(jié)果;dutomycin結(jié)構(gòu)如式（II)所示，12-去甲基-dutomycin的結(jié)構(gòu)如式（I)所示； 所述YM培養(yǎng)基質(zhì)量終濃度組成為:酪蛋白胨0.5%、麥芽浸粉0.3%、葡萄糖1 %、酵母浸粉 〇. 3%，溶劑為去離子水，pH 6.2;滅菌后添加安普霉素50yg/mL。
[0035] 上述提取化合物所用的化學(xué)試劑購自杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，配制培養(yǎng)基所 用的生化試劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0036] 表 1 :Dutomycin與 12-去甲基-dutomycin在CDC13中的 13C NMR數(shù)據(jù)（75MHz)

[0039]表2 :Dutomycin與 12-去甲基-dutomycin在CDC13中的1H NMR數(shù)據(jù)(300MHz)

[0042] (5)化合物的最小抑菌濃度測試
[0043] 在37°C、250rpm下，用96孔板，將革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌XL-lBlue、革蘭氏陽性 細(xì)菌金黃色葡萄球菌(SA)以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)分別培養(yǎng)在具有不同測 試化合物終濃度(64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.064邱/11^)的1^培養(yǎng)基中，20小 時(shí)后，通過分析菌體生長情況，確定測試化合物的最小抑菌濃度，具體實(shí)施方法為:利用酶 標(biāo)儀測定96孔板中菌體培養(yǎng)液在600nm下的吸光度，測試樣品的吸光度值與不含測試化合 物與菌體的對照樣品的吸光度值差值與對照樣品吸光值比值小于或等于5%，同時(shí)測試樣 品未見渾濁，認(rèn)為有抑制活性；比值大于5%，同時(shí)測試樣品可見明顯渾濁，認(rèn)為無抑制活 性，具有抑制活性的最小測試化合物濃度確定為該化合物的最小抑菌濃度，如表3所示，卡 那霉素對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌XL-lBlue的最小抑制濃度為lyg/mL，對革蘭氏陽性細(xì)菌 SA的最小抑制濃度為2yg/mL，而對革蘭氏陽性細(xì)菌MRSA基本沒有抑制作用；dutomycin及 12-去甲基-dutomycin均對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌XL-lBlue基本沒有抑制作用， (1111:〇1]15^;[11對被測試的兩種革蘭氏陽性細(xì)菌的最小抑制濃度均為0.25邱/1]11，而12-去甲基-dutomy c i n對被測試的兩種革蘭氏陽性細(xì)菌的最小抑制濃度均為0.125yg/mL，表明12-去甲 基-dutomycin對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制活性顯著高于dutomycin;所述LB培養(yǎng)基質(zhì)量終濃 度組成為:胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化鈉l%，pH 7.0,溶劑為去離子水;滅菌；
[0044] 上述的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus)購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心 (ATCC)，編號分別為ATCC 25923及ATCC 33591;大腸桿菌XL-lBlue購自北京鼎國昌盛生物 技術(shù)有限責(zé)任公司。
[0045] 表3 :卡那霉素、dutomycin與12-去甲基-dutomycin對不同細(xì)菌的最小抑菌濃度 (單位:yg/mL)
[0047] 實(shí)施例2新型化合物的提取、分析和純化
[0048] 美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株在YM培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為4天，其它操作同 實(shí)施例1，最終分別從美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株的培養(yǎng)物中分離得到41mg的 dutomycin(產(chǎn)量41mg/L)與34mg的 12-去甲基-dutomycin(產(chǎn)量34mg/L)。
[0049] 實(shí)施例3新型化合物的提取、分析和純化
[0050] 美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株在YM培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為5天，其它操作同 實(shí)施例1，最終分別從美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株的培養(yǎng)物中分離得到45mg的 dutomycin(產(chǎn)量45mg/L)與38mg的 12-去甲基-dutomycin(產(chǎn)量38mg/L)。
[0051 ]實(shí)施例4新型化合物的提取、分析和純化
[0052]美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株在YM培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為6天，其它操作同 實(shí)施例1，最終分別從美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株的培養(yǎng)物中分離得到50mg的 dutomycin(產(chǎn)量50mg/L)與43mg的 12-去甲基-dutomycin(產(chǎn)量43mg/L)。
[0053]實(shí)施例5新型化合物的提取、分析和純化
[0054]美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株在YM培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間為7天，其它操作同 實(shí)施例1，最終分別從美濃鏈霉菌野生型菌株與重組菌株的培養(yǎng)物中分離得到52mg的 dutomycin(產(chǎn)量52mg/L)與44mg的 12-去甲基-dutomycin(產(chǎn)量44mg/L)。
[0055]實(shí)施例6美濃鏈霉菌中甲基轉(zhuǎn)移酶DutMT2基因的敲除及重組菌株的產(chǎn)物分析 [0056]以純化的美濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA作為模板，使用引物DutMT2-F:5'_ AAAAGCTTGCTCTACCGGATGCTGCGCT-3 ' 和引物DutMT2-R : 5 ' -AATCTAGACTTCAGGACGTACGCGTCGC-3 '擴(kuò)增用于敲除甲基轉(zhuǎn)移酶DutMT2基因DNA片段，敲除質(zhì) 粒的構(gòu)建及美濃鏈霉菌中甲基轉(zhuǎn)移酶DutMT2基因的敲除實(shí)施方法與實(shí)施例1相同；分別使 用引物113-47:5，-。6(^八6661'1'1'1'(：(^八61'〇八〇6八(：-3，與引物〇1^]\^2-(：116。1^1:5'-ATGACAGCTCCCGCTCTCGAA-3 '，以及引物RM-V: 5 ' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ' 與引物 DutMT2-Check2: 5 '-ATTTAITGGCGTCATCAGGTTGT-3 '，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)證明美濃鏈霉菌 重組菌株中甲基轉(zhuǎn)移酶DutMT2基因被成功敲除；目標(biāo)化合物的提取、分析方法與實(shí)施例1相 同，使用液相色譜純化目標(biāo)化合物過程的檢測結(jié)果如圖2所示，未檢測到12-去甲基-dutomycin或類似化合物的合成，證明敲除了甲基轉(zhuǎn)移酶DutMT2基因的美濃鏈霉菌重組菌 株無法合成12-去甲基-dutomyc in或其它有類似抗菌活性的化合物。
[0057]實(shí)施例7美濃鏈霉菌中糖基轉(zhuǎn)移酶DutGT2基因的敲除及重組菌株的產(chǎn)物分析 [0058]以純化的美濃鏈霉菌野生型菌株基因組DNA作為模板，使用引物DutGT2-F:5'_ AAAAGCTTACGGCATCCTGGACGAGCAT-3 ' 和引物DutGT2-R : 5 ' -AATCTAGAITCGGCTGGGCGACGATCAA-3'擴(kuò)增用于敲除糖基轉(zhuǎn)移酶DutGT2基因DNA片段，敲除質(zhì) 粒的構(gòu)建及美濃鏈霉菌中糖基轉(zhuǎn)移酶DutGT2基因的敲除實(shí)施方法與實(shí)施例1相同；分別使 用引物113-47:5'-〇6(^八6661'1'1'1'(：(^八61'〇八〇6八(：-3'與引物〇1^6丁2-(：116。1^1:5'- AGATCAAGCACAGTCCGGA-3 '，以及引物RM-V: 5 ' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ' 與引物 DutGT2-Check2:5 ' -AAGCGACTCTGGAAGAGG-3 '，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)證明美濃鏈霉菌重組菌 株中糖基轉(zhuǎn)移酶DutGT2基因被成功敲除；目標(biāo)化合物的提取、分析實(shí)施方法與實(shí)施例1相 同，使用液相色譜純化目標(biāo)化合物過程的檢測結(jié)果如圖2所示，未檢測到12-去甲基-dutomycin，但檢測到另一種化合物的合成，通過與實(shí)施例1中相同的實(shí)施方法對該化合物 進(jìn)行最小抑菌濃度測試，結(jié)果表明該化合物對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌基本沒有抑制作 用，對被測試的兩種革蘭氏陽性細(xì)菌的最小抑制濃度為250iig/mL，證明敲除了糖基轉(zhuǎn)移酶 DutGT2基因的美濃鏈霉菌重組菌株無法合成12-去甲基-dutomycin或其它有類似顯著抗菌 活性的化合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種式(I)所示嘌呤霉素衍生物，2. -種權(quán)利要求1所述嘌呤霉素衍生物的制備方法，其特征在于所述方法為:將美濃鏈 霉菌重組菌株接種在YM培養(yǎng)基中，在30 °C、250rpm下培養(yǎng)3-7天，培養(yǎng)物分離純化，獲得所述 嘌呤霉素衍生物;所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌的甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除 構(gòu)建而成。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述美濃鏈霉菌重組菌株是將美濃鏈霉菌 (Streptomyces minoensis)ATCC 19787的甲基轉(zhuǎn)移酶DutMTl基因敲除構(gòu)建而成。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)物分離純化方法為:培養(yǎng)結(jié)束后，將 培養(yǎng)物用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取液干燥去除乙酸乙酯，再用甲醇溶解后，在60目的硅 膠柱上用體積比為100:0、75:25、50:50、25:75、0:100的氯仿-甲醇溶液進(jìn)行洗脫，通過液相 色譜檢測流出液，收集體積比75:25氯仿-甲醇溶液的流出液，再將所述流出液利用液相色 譜分離，用流速為lmL/min的乙腈-水混合液梯度洗脫，在20分鐘內(nèi)，乙腈-水的體積比由70: 30逐漸提高到75:25，收集目標(biāo)流出液，獲得所述嘌呤霉素衍生物。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述萃取液在40°C下真空干燥至恒重。6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述收集目標(biāo)流出液是在保持乙腈-水的體 積比為75:25再洗脫10分鐘，收集在26.5-27.2分鐘的流出液。7. -種權(quán)利要求1所述嘌呤霉素衍生物在制備革蘭氏陽性細(xì)菌活性抑制劑中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述嘌呤霉素衍生物對革蘭氏陽性細(xì)菌的最 小抑菌濃度為0.125yg/mL。
【文檔編號】C12P19/56GK105820198SQ201610270341
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】占紀(jì)勛, 于大禹
【申請人】杭州唯鉑萊生物科技有限公司