黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑及其基因和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑及其基因，該黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，編碼黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，本發(fā)明通過(guò)原核表達(dá)手段獲得的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑具有很強(qiáng)的胰蛋白酶抑制活性，并且還具有體外生產(chǎn)方便、抑制胰蛋白酶活性強(qiáng)大的特點(diǎn)，可做為胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑及其基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及黑眶蟾蜍研究領(lǐng)域，特別涉及一種黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑及其 基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑眶蟾蜍，無(wú)尾目，蟾蜍科，蟾蜍屬，是傳統(tǒng)中藥材"干蟾"的主要來(lái)源之一，一般于 夏、秋二季捕捉;味辛、涼，有毒，歸肝、脾、肺經(jīng)，具有消腫解毒、止痛、利尿的功效，常用于慢 性氣管炎、癰癤疔瘡、咽喉腫痛、水腫和小便不利等癥治療；民間也有用于癌癥(尤其是乳腺 癌)等的驗(yàn)方，但目前關(guān)于其功效的分子機(jī)制研究較少。
[0003] 絲氨酸蛋白酶(serine protease)是一類(lèi)以絲氨酸作為活性中心的蛋白水解酶， 屬于蛋白水解酶，存在于自然界各種各樣的生物中。絲氨酸蛋白酶有一個(gè)獨(dú)特的反應(yīng)活性 絲氨酸殘基，其在生物有機(jī)體內(nèi)通過(guò)對(duì)蛋白酶原的激活或者抑制從而起到調(diào)節(jié)因子的作 用，并且在組織重建、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、病毒入侵以及血管生成等生理生化反應(yīng)過(guò)程中 發(fā)揮著重要作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)是一類(lèi)具有抑制絲氨酸蛋白酶水解活性的 物質(zhì)，其廣泛存在于自然界各種各樣的生物體中。絲氨酸蛋白酶作為生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的 重要調(diào)節(jié)因子，其在生物體內(nèi)許多重要的生理生化活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，例如細(xì)胞基質(zhì) 構(gòu)建、蛋白質(zhì)折疊、補(bǔ)體激活、血凝、細(xì)胞分化、細(xì)胞迀移、免疫和炎癥反應(yīng)以及腫瘤抑制等。 目前黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑尚未見(jiàn)報(bào)道。
[0004] 將本發(fā)明的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑氨基酸全序列及其編碼基因分別對(duì)蛋 白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了比對(duì)搜索，均未發(fā)現(xiàn)有任何相同序列信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種黑眶蟾蜍絲氨酸蛋 白酶抑制劑及其基因和應(yīng)用。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑，該黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的氨基酸序 列如SEQ ID N0:2所示，其是一種單鏈多肽，分子量11604.道爾頓，等電點(diǎn)7.33。
[0008] 本發(fā)明另一目的是提供一種編碼所述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的基因，其核 苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆方法如下：
[0010] 黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建CDNA文庫(kù)，以黑眶蟾蜍CDNA為模板，根據(jù)保 守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增絲氨酸蛋白酶抑制劑部分序列，引物為5'PCR primer F1和5'PCR primer F2與3'primer R1。根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì)引物（3'primer R2和3'primer R3)，與建庫(kù)用5'PCR primer II A再次進(jìn)行巢式PCR，相關(guān)反應(yīng)條件同前，最 終獲取黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑全長(zhǎng)0RF。
[00"] 1、引物：
[0018] 2、將0.5yl rTaq，10yl PCR緩沖液、8yl dNTP混合物（各2.5yM)、6yl MgCl2、2yl 尺祖、引物5'？0?口1'；[11161?1、5'？0?口1'；[11161?2和3'口1'；[111611?1:各2111、65.5111去離子水、放 入離心管中進(jìn)行反應(yīng)。
[0019] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：
[0020] ① 95°C 5 分鐘
[0021] ②30個(gè)循環(huán)：
[0022] 95 °C 30 秒鐘
[0023] 55 °C 30 秒鐘；
[0024] 72 °C 30 秒鐘；
[0025] ③72 °C延伸5分鐘。
[0026] ④以反應(yīng)產(chǎn)物為模板繼續(xù)進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)條件同上。
[0027] 根據(jù)以上擴(kuò)增出的絲氨酸蛋白酶抑制劑部分序列設(shè)計(jì)引物
[0028] 其序列為：5'^160厶1〇：11^1'1'(^6611^^6-3'，
[0029] 反向擴(kuò)增引物序列為5'-〇^1711^〇：1'11^^^0六11'〇：1'-3'；
[0030] 所獲陽(yáng)性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定，基因測(cè)序結(jié)果表明編碼黑眶蟾蜍絲氨 酸蛋白酶抑制劑的基因由333個(gè)核苷酸組成，其序列如SEQ ID NO: 1所示，
[0031 ]黑眶蟾蜍成熟絲氨酸蛋白酶抑制劑由110個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為如 SEQIDN0:2**。
[0032]黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的原核表達(dá)、純化方法如下：
[0033] 原核表達(dá)：
[0034] 1.將挑選的陽(yáng)性克隆pET32a-Hyl菌株接種到含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，180rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
[0035] 2.按1%的接種量將培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)接到100ml含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C， 180rpm培養(yǎng)大約4h，至0D600處于0.4-0.6之間，取出10ml的
[0036]菌液放入無(wú)菌的試管中繼續(xù)培養(yǎng)，用來(lái)作為未誘導(dǎo)對(duì)照。剩下的菌液加入終濃度 為0 ? 4mM的異丙基-0-D-硫代半乳糖（Isopropyl 0-D-1-Thiogalactopyranoside; IPTG)，30 °C，160rpm進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0037] 3.繼續(xù)培養(yǎng)4-5h，取出10ml誘導(dǎo)后的菌液，12000rpm離心5min，棄去上清液收集菌 體沉淀。
[0038] 4.確定重組蛋白是以可溶性狀態(tài)還是以包涵體狀態(tài)存在于宿主菌體中。具體的檢 測(cè)方法為:將誘導(dǎo)前后的菌體沉淀重新懸浮于15ml的20mM磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4)中，使用 超聲波破碎儀器對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞破碎，功率為200W，超6s停4s，總工作時(shí)間為15min，在冰浴中 對(duì)菌體進(jìn)行破碎。4 °C，12000g離心20min。沉淀溶解于8M尿素中，和上清液一起放置于4 °C冰 箱保存。
[0039] 5.取細(xì)胞破碎之后的上清液和重新溶解后的沉淀進(jìn)行小肽聚丙烯酰氨凝膠電泳 (tricine sodium dodecyl sulfatepoly acrylamide gel electrophoresis;Tricine-SDS-PAGE)，觀察重組蛋白在細(xì)胞中的定位。
[0040] 純化：
[0041 ] 1.將誘導(dǎo)后的100ml菌液10000g離心5min，收集菌體沉淀，加入15ml的20mM磷酸鹽 緩沖液(pH 7.4)，渦旋震蕩使其充分混勻，10000g離心5min，重復(fù)兩次。
[0042] 2.加入15ml 20mM的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，渦旋震蕩使其充分混勻，冰浴30min 后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體，4°C，12000g離心20min，重復(fù)兩次離心，收集上清液，將上 清液加入到Ni2+柱上，靜置30min，使帶有His標(biāo)簽的融合蛋白能夠盡可能的結(jié)合到Ni2+柱 上，結(jié)合30min后除去濾液。
[0043] 3.向Ni2+柱中緩慢地加入5-6倍柱體積的結(jié)合緩沖液(Binging byffer)清洗。
[0044] 4.加入5-6倍柱體積的洗脫緩沖液(Elytion byffer，含有200mM咪唑），收集洗脫 液。
[0045] 5 ?將收集的洗脫液加入到50ml超濾管中（3000MWC0)，4°C，4000rpm離心40-50min， 然后倒掉套管內(nèi)的濾液，再向超濾管內(nèi)加入12ml的20mM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行換液（重復(fù)兩 次），最后收集濾膜上的蛋白濃縮液。
[0046] 6.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃縮液的濃度。
[0047]構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a_Hyl，轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)于含氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，超聲破碎離心取上清，進(jìn)行親和層析獲得 融合黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑;經(jīng)超濾后用腸激酶進(jìn)行消化后，純化即得重組黑眶蟾 蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑，該絲氨酸蛋白酶抑制劑具有強(qiáng)烈的抑制胰蛋白酶活性。
[0048]本發(fā)明另一目的是將黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑應(yīng)用在制備胰蛋白酶抑制劑 中。
[0049] 所述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑為活性成分的胰蛋白酶抑制藥物。
[0050] 所述的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備胰蛋白酶抑制藥物方面的應(yīng)用。
[0051] 本發(fā)明中所用黑眶蟾蜍來(lái)源于云南省西雙版納州，從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)得。
[0052] 相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0053] 本發(fā)明由黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行原核 表達(dá)，純化后的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑具有強(qiáng)烈的抑制胰蛋白酶的活性，該黑眶蟾 蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑具有體外生產(chǎn)方便、抑制胰蛋白酶活性強(qiáng)大的特點(diǎn)。
[0054]本發(fā)明提供的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑在2yM濃度可抑制62%的胰蛋白酶活 性，8yM濃度黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制約80 %的胰蛋白酶活性。
【附圖說(shuō)明】
[0055] 圖1為黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶抑制活性與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 下面通過(guò)附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于 此，本實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常 規(guī)試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0057]實(shí)施例1:黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆 [0058] 一、黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取
[0059] A、將活體黑眶蟾蜍用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時(shí)，取皮膚組織，稱(chēng)重，取 300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizo 1溶液，美國(guó)Invi trogen公司產(chǎn)品），于 20ml玻璃勻漿器中勻漿10分鐘；
[0060] B、加入等體積酚/氯仿溶液，振蕩混勻，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心10分 鐘，吸取上層水相液體；
[0061 ] C、在上清液中加入上清液1/2體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4°C下7500g離心10 分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為黑眶蟾蜍皮膚總RNA。
[0062] 二、黑眶蟾蜍皮膚cDNA文庫(kù)合成
[0063]采用CL0NTECH公司CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒 cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作如下：
[0064] 4、〇0嫩第一鏈合成(1^熟反轉(zhuǎn)錄），具體步驟如下：
[0065] 1、在0.5ml無(wú)菌的離心管加入lyl黑眶蟾蜍皮膚總RNA、lyl SMART IV寡聚核苷酸、 lyl CDS 111/3'？0?引物，加如1去離子水使總體積達(dá)到如1;
[0066] 2、混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C保溫2分鐘；
[0067] 3、將離心管在冰上孵育2分鐘；
[0068] 4、在離心管中加入以下試劑2.0yl 5X第一鏈緩沖、l.Oiil 20mM二硫蘇糖醇、l.Oy 1 10mM dNTP混合物、l.Oul PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶；
[0069] 5、混合離心管中試劑并短暫離心，在42 °C保溫1小時(shí)；
[0070] 6、將離心管置于冰上中止第一鏈的合成；
[0071] 7、從離心管取2yl所合成的cDNA第一鏈備用。
[0072] B、采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈，具體內(nèi)容如下：
[0073] 1、95。(：預(yù)熱？0?儀；
[0074] 2、將2yl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄）、80yl去離子水、10yl lOXAdvantage 2 PCR 緩沖、2yl 50XdNTP混合物、2yl 5'PCR引物、2yl CDS III/3'PCR引物以及2yl大腸桿菌聚 合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)；
[0075] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：
[0076] ① 95°C 20 秒鐘
[0077] ②22個(gè)循環(huán)：
[0078] 95 °C 5 秒鐘
[0079] 68 °C 6 分鐘；
[0080] 4、循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行后續(xù)過(guò)程。
[0081] 三、黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑編碼基因的擴(kuò)增
[0082] 1、95。(：預(yù)熱？0?儀；
[0083] 2、將2yl cDNA雙鏈(上述產(chǎn)物）、75.5yl去離子水、10yl PCR緩沖液、8yl dNTP混合 物(各2.5yM)、2yl正向擴(kuò)增引物、2yl反向擴(kuò)增引物以及0.5yl大腸桿菌DNA聚合酶放入離心 管中進(jìn)行反應(yīng);正向擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為23個(gè)核苷酸，其 3'（5已0 10從)：3)，反向擴(kuò)增引物序列為5'-〇^1'1'11^〇：1'11^^^〇厶11'〇：1'-3'（5￡0 10從):4); [0084] 3、在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：
[0085] (1)預(yù)變性
[0086] 95 °C 5 分秒鐘
[0087] (幻邪個(gè)循環(huán)：
[0088] 95 °C 30 秒鐘
[0089] 56 °C 40 秒鐘
[0090] 72 °C 30 秒鐘
[0091] (3)后擴(kuò)增
[0092] 72 °C 5 分鐘
[0093] 4、循環(huán)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用TIANGEN公司的DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行抽提回收，步 驟如下：
[0094] (1)將PCR產(chǎn)物與等體積的膜結(jié)合液顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室 溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合，12000rpm離心分1鐘，倒掉收集管中的廢液；
[0095] (2)加入700iU的漂洗液(含乙醇)于離心純化柱中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集 管中的廢液；
[0096] (3)重復(fù)步驟2;
[0097] (4)12000rpm 離心 3 分鐘；
[0098] (5)將離心純化柱置于新的離心管中；
[0099] (6)加入30yl超純水，在室溫下靜置5分鐘；
[0100] (7)12000rpm離心1分鐘，管底溶液即為純化過(guò)的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑編 碼基因PCR產(chǎn)物。
[0101]四、大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0102] 1、挑取單個(gè)DH5a菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜， 次日取上述菌液按比例1:100再接種于50ml LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩2小時(shí)。當(dāng)0D600值達(dá)到 0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物；
[0103] 2、將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml預(yù)冷的無(wú)菌聚丙烯管中，冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷 卻；
[0104] 3、于4°C下4100rpm離心10min，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置lmin以使殘留的培養(yǎng)基流 盡；
[0105] 4、每50ml初始培養(yǎng)液用30ml預(yù)冷的O.lmol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/L MgCl2， 20mmol/L CaCl2)重懸細(xì)胞沉淀；
[0106] 5、于4 °C下41 OOrpm離心1 Omin，吸出上清液，并將管倒置lmin以使殘留的液體流 盡；
[0107] 6、每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的O.lmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后備 用。
[0108]五、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0109] 1、在微量離心管中加入lyl Takara pMD19-T simple載體、4yl黑眶蟾蜍絲氨酸蛋 白酶抑制劑編碼基因PCR產(chǎn)物及5yl的連接酶緩沖混合物；
[0110] 2、16。(：反應(yīng) 3 小時(shí)；
[0111] 3、全量(10yl)加入至100yl DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；
[0112] 4、42 °C加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘；
[0113] 5、加入37 °C溫浴過(guò)的LB培養(yǎng)基890y 1，37 °C緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘；
[0114] 6、取200yl涂布于含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-0-D-半乳糖苷）、IPTG(異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷）、氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)以形成單菌落。
[0115] 六、黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因克隆篩選及鑒定
[0116] 挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件同前述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑編碼基因的擴(kuò)增條件； 將經(jīng)PCR確證的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取后，以美國(guó)Applied Biosystems3730A全自動(dòng)核苷酸 序列測(cè)定儀進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定；測(cè)序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47 (5'CGCCAGGGmTCCCAGTCACGAC 3'），其序列如SEQ ID N0:1 所示
[0117] 黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因核苷酸序列長(zhǎng)度為333個(gè)堿基，序列類(lèi)型：核 酸，鏈數(shù):單鏈，拓?fù)鋵W(xué):直鏈狀，序列種類(lèi):cDNA，來(lái)源:黑眶蟾蜍皮膚。
[0118] 編碼黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑為第1-333位核苷酸，編碼110個(gè)氨基酸殘基其 氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0119] 實(shí)施例2:黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的原核表達(dá)、純化
[0120] -、黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0121]根據(jù)編碼黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的基因設(shè)計(jì)引物，正向嵌套引物序列兩 條，加入K p n I限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)和腸激酶酶切位點(diǎn)，F(xiàn) 1序列為5 ' -GGTACCGACGACGACGACAAGATGC-S^SEQ ID N0：5) ；F2j^^lJ^j5，-ACAAGATGCATCCTTGTTCTGGTTG-3 '（ SEQ ID NO : 6 );反向弓| 物R序列為5'_ AAGCTTCTATTTCACCTTTGGACATTC-3'（SEQ ID N0:7)，加入Hind III酶切位點(diǎn)，經(jīng)PCR、膠回收 后，進(jìn)行雙酶切;PCR、膠回收操作步驟同前實(shí)施例1中的步驟三。
[0122] 在PCR管中配制下列酶切體系： PCR產(chǎn)物/環(huán)狀載體 500 ddHbO 30 ul l〇xM BLiffcr 10 ul
[0123] f Kpn I 5 ul (15 M) Hind HI 5 .ul (15 M) 總體積 ]0().ul
[0124] 37 °C酶切10小時(shí)，在反應(yīng)管中加入6 X溴酚蘭載樣緩沖液20iil，混勻后于1.0 %瓊 脂糖凝膠中電泳，根據(jù)條帶大小回收目的片段，操作步驟同前實(shí)施例1中的步驟三。
[0125] 在PCR管中配制下列連接體系： 載體 DNA 200 ng 插入片段DNA 30 ng
[0126] 連接酶1 OX緩沖液 2 0 T4 DNA連接酶 2 M 加無(wú)核酸酶水至20 (il
[0127] 15°C連接18小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞并篩選陽(yáng)性克隆，操作 步驟同前實(shí)施例1中的步驟三。
[0128] 二、黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的誘導(dǎo)表達(dá)
[0129] 1、37 °C 搖床培養(yǎng)至0D600到0 ? 4-1 (建議0D600為0 ? 6);
[0130] 2、加入100mM IPTG儲(chǔ)液至終濃度0.4mM，繼續(xù)培養(yǎng)2-3小時(shí)；
[0131] 3、將搖瓶置于冰上5分鐘，5000g 4°C離心5分鐘收集菌體；
[0132] 4、重懸細(xì)胞于0.25倍體積預(yù)冷的20mM磷酸鈉，20mM咪唑(pH7.4)中，離心；
[0133] 5、除去上清，菌體保存于_70°C冰箱或繼續(xù)純化。
[0134] 三、黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的純化
[0135] 1、超聲破碎提取蛋白
[0136] 以20mM磷酸鈉，20mM咪唑（pH7.4)重懸細(xì)胞后，于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，功率 100-200W，每次超聲3s，間歇7s，總時(shí)間15min，離心取上清即可用于親和層析；
[0137] 2、親和層析柱的準(zhǔn)備
[0138] 組裝層析柱后，用蒸餾水沖洗以去除末端的氣泡，關(guān)閉層析柱流出口，保持層析柱 下端有部分水存在，重懸Ni Sepharose 6 Fast Flow填料后，連續(xù)單次將其裝入層析柱，打 開(kāi)層析柱出口，將恒流栗設(shè)置為所需流速后，完成至少3個(gè)柱體積的洗脫、備用；
[0139] 3、親和層析
[0140] 以150cm/h的線性流速用5到10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液（20mM磷酸鈉，20mM咪唑， pH7.4)平衡層析柱，加入前述樣品，用結(jié)合緩沖液洗柱子，直至280nm處吸收回復(fù)至基線處， 用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH7.4)進(jìn)行線性梯度洗脫，收集60 %-100%洗脫組分，即為黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑融合蛋白；
[0141] 4、超濾
[0142] 使用截留分子量3kD的超濾離心管進(jìn)行超濾，于常溫下4000轉(zhuǎn)離心30min，加入等 體積ddH20后重復(fù)離心步驟兩次，收集離心管上方的液體進(jìn)行后續(xù)操作；
[0143] 5、腸激酶切割及純化
[0144] 取上述蛋白5mg，加入重組腸激酶20M，10 X反應(yīng)緩沖液100iil，總體積lml; 25°C反 應(yīng)12小時(shí)后，進(jìn)行親和層析，收集層析柱不能結(jié)合的組分，再次進(jìn)行超濾，即得純度超過(guò) 99 %的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑。
[0145] 實(shí)施例3:黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的應(yīng)用
[0146] 檢測(cè)黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶抑制活性。
[0147] 以生色底物Na-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride為反應(yīng)底 物，將牛胰蛋白酶(〇.2ng/反應(yīng))與反應(yīng)緩沖液、不同濃度的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑 (終濃度2_811]\〇，混合后置于室溫5111；[11，加入加-136112071-1^-&作;[11；[116 4-11；[1：1'0&11；[11(16 hydrochloride至終濃度為400yM，37°C孵育30min后檢測(cè)410nm處吸光度(記為Abo I)，設(shè)置 加入重組黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的作為對(duì)照(記為Abo C)，計(jì)算抑制率，計(jì)算方法為 (Abo C-Abo I)/Abo CX100%o
[0148]結(jié)果如圖1所示，黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑具有強(qiáng)大的胰蛋白酶抑制活性，在 2yM濃度時(shí)可抑制62 %的胰蛋白酶活性，8yM濃度黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑可抑制78 % 的胰蛋白酶活性，而且這種抑制作用十分迅速，在60秒內(nèi)2iiM黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑 即可抑制50%的胰蛋白酶活性，實(shí)驗(yàn)證明其可以作為絲氨酸蛋白酶抑制劑使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在于:所述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制 劑的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑的基因，其特征在于:其核苷 酸序列如SEQ ID N0:1所示。3. -種權(quán)利要求2所述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆方法，其特征在于，其 具體步驟為：黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及設(shè)計(jì)引物并利用PCR方法篩選黑眶蟾蜍絲 氨酸蛋白酶抑制劑基因，其中正向擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸， 其序列為：5 ' -ATGCATCCTTGTTCTGGTTGTG-3 '， 反向擴(kuò)增引物序列為5 ' -CTATTTCACCTTTGGACATTCCT-3 '。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆方法，其特征在于， 其具體步驟為:黑眶蟾蜍皮膚總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫(kù)，以黑眶蟾蜍cDNA為模板，根 據(jù)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增絲氨酸蛋白酶抑制劑部分序列，引物為5' PCR primer F1和5'PCR primer F2與3'primer R1;根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì)引物：3' primer R2和3'primer R3,與建庫(kù)用5'PCR primer II A再次進(jìn)行巢式PCR，最終獲取黑眶 蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑全長(zhǎng)0RF。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆方法，其特征在于， 其中，5 ' PCR primer FI: 5 ' -TGYGGNWSNGCNTGYCCN-3 ' 5'PCR primer F2:5'-CCNTGYGTNGARGGNTGYGTNTGY-3' 5'PCR primer II A:5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' 3. primer R1:5 '-ATTGACTCGAGTCGACATCGA-3 ' 3. primer R2:5 '-ATGGACATTCTTCCTTTGGGA-3 ' 3. primer R3:5 '-AGGACCTATAACATATCC-3 ' 〇6. 以權(quán)利要求1所述黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑為活性成分的胰蛋白酶抑制藥物。7. 權(quán)利要求1所述的黑眶蟾蜍絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備胰蛋白酶抑制藥物方面的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N15/15GK105820239SQ201610323050
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】宋玉竹, 盧文成, 劉銳, 張阿梅, 韓芹芹, 劉娃
【申請(qǐng)人】昆明理工大學(xué)