一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，包括以下步驟：（1）縊蟶預(yù)處理；（2）酶解；（3）超濾分離；（4）快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化；（5）高效液相色譜系統(tǒng)分離純化。本發(fā)明以縊蟶為原料，通過(guò)中性蛋白酶酶解縊蟶，并利用超濾技術(shù)、快速蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化后得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽（ACE 抑制肽），提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，為從縊蟶中制備高活性的ACE抑制肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利說(shuō)明】
一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高血壓是困擾當(dāng)今的一種心血管疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，對(duì)人類健康危害極大。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Ang1tensin-converting enzyme，ACE)在機(jī)體血壓調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用，一方面ACE將無(wú)活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)烈收縮全身微動(dòng)脈，使血壓升高的血管緊張素Π;另一方面ACE能促進(jìn)有降血壓作用的緩激肽分解，引起血壓升高。
[0003]現(xiàn)今人工合成的卡托普利、依那普利和賴諾普利等ACE抑制劑，這些藥物具有很強(qiáng)的降血壓作用，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生眩暈、惡心、劇烈咳嗽、味覺(jué)異常、腎功能損害等副作用。許多研究表明源于食物中的短肽具有降血壓的功效，Da1-Hung Ngo等以太平洋鱈魚(yú)皮為原料，用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，經(jīng)分離純化后得到降血壓肽:Thr-Cys-Ser-Pro ； Hasan F等利用胃蛋白酶酶解鰹魚(yú)肉，經(jīng)分離純化后得到高活性降血壓肽(IKYGD);源于食物中的生物活性肽具有安全、無(wú)毒副作用，且易于機(jī)體吸收等特點(diǎn)。因此，從食物源中制備分離出高活性的ACE抑制肽仍是研究的熱點(diǎn)。
[0004]縊蟶(Sinonovacula )是我國(guó)沿海常見(jiàn)的貝類，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白源?？O蟶提取物具有抗氧化、抗腫瘤和提高機(jī)體免疫作用等功效。但目前尚未見(jiàn)與縊蟶降血壓肽相關(guān)的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的是為了提供一種提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，產(chǎn)品穩(wěn)定性好、純度高的縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，包括以下步驟:
(I)縊蟶預(yù)處理:將縊蟶除殼剝?nèi)夂?，用清水把蛤肉洗凈，?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后，用異丙醇浸泡縊蟶肉3?5h，過(guò)濾后濾渣用純化水泡洗至無(wú)異丙醇異味，脫水得縊蟶肉渣，備用。對(duì)縊蟶預(yù)處理主要是脫雜蛋白和除去脂質(zhì)。
[0007](2)酶解:將步驟(I)中的縊蟶肉渣加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:3-4,加酶量1500~20001]/^，？!1值6.5-7.5,酶解溫度50?60°C，酶解時(shí)間9?12 h，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷后離心，得上清液。
[0008](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3 ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得到超濾液。
[0009](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到二個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該二個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A。
[0010](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到三個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該三個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測(cè)后，即得氨基酸序列為:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。
[0011]作為優(yōu)選，步驟(I)中，縊蟶與異丙醇的質(zhì)量比為1:3?5。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(2)中，酶解期間不斷攪拌。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(2)中，預(yù)冷至4?6°C。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(2)中，離心工藝條件為:轉(zhuǎn)速5000?10000rpm/min，離心時(shí)間10?30mino
[0015]作為優(yōu)選，步驟(4)中，快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用DEAE-SepharoseFF離子交換層析柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，將凝膠裝柱，Tris-Hcl平衡后(pH為7.4 )，將超濾液配制成20Omg/mI的溶液，每次上樣量為3mL，分別用Tr i s-He I (pH為7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為2.2ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ；收集各峰。
[0016]作為優(yōu)選，步驟(5)中，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用葡聚糖凝膠G-25層析柱(尺寸:2.6 X 80cm；柱料:Sephadex G-25)，將組分B配制成200mg/ml的溶液，上樣量:2.0mL;流動(dòng)相:超純水;洗脫液流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm；自動(dòng)收集速度:
4.0min/管;收集各峰。
[0017]作為優(yōu)選，步驟(5)中，組分B純度檢測(cè)方法為:采用ZORBAXSB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μ??，4.6 X 150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脫方式:80%A，20%B ；流速:1.0 mL/min ；柱溫:25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm0
[0018]因此，本發(fā)明具有如下有益效果:以縊蟶為原料，通過(guò)中性蛋白酶酶解縊蟶，并利用超濾技術(shù)、快速蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化后得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE抑制肽)，提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，為從縊蟶中制備高活性的ACE抑制肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。
[0020]實(shí)施例1
(I)縊蟶預(yù)處理:將縊蟶除殼剝?nèi)夂?，用清水把蛤肉洗凈，?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后，用異丙醇浸泡縊蟶肉5h，縊蟶與異丙醇的質(zhì)量比為1:5，過(guò)濾后濾渣用純化水泡洗至無(wú)異丙醇異味，脫水得縊蟶肉渣，備用。
[0021](2)酶解:將步驟(I)中的縊蟶肉渣加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:4，加酶量2000U/g，pH值7.5，酶解溫度60°C，酶解時(shí)間12 h，酶解期間不斷攪拌，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷至6°C后以轉(zhuǎn)速10000rpm/min離心30min，得上清液。
[0022](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3 ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得到超濾液。
[0023](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)(Apurifier UPC-1OO型快速蛋白純化儀，GE生命科學(xué)公司)進(jìn)行分離純化，得到二個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該二個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A，快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用DEAE-SepharoseFF離子交換層析柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，將凝膠裝柱，Tris-Hcl平衡后(pH為7.4 )，將超濾液配制成20 Omg/m I的溶液，每次上樣量為3mL，分別用Tr i s -He I (pH為7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為2.2ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm ；收集各峰。
[0024](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到三個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該三個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測(cè)后，即得氨基酸序列為:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用葡聚糖凝膠G-25層析柱(尺寸:2.6 X 80cm;柱料:Sephadex G_25)，將組分B配制成200mg/ml的溶液，上樣量:2.0mL;流動(dòng)相:超純水;洗脫液流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm；自動(dòng)收集速度:4.0min/管;收集各峰;組分B純度檢測(cè)方法為:采用ZORBAXSB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μπι，4.6 X 150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脫方式:80%A，20%B；流速:1.0 mL/min ；柱溫:25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:20yL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。
[0025]實(shí)施例2
(I)縊蟶預(yù)處理:將縊蟶除殼剝?nèi)夂螅们逅迅蛉庀磧?，?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后，用異丙醇浸泡縊蟶肉3h，縊蟶與異丙醇的質(zhì)量比為1:3，過(guò)濾后濾渣用純化水泡洗至無(wú)異丙醇異味，脫水得縊蟶肉渣，備用。
[0026](2)酶解:將步驟(I)中的縊蟶肉渣加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:3，加酶量1500U/g，pH值6.5，酶解溫度50°C，酶解時(shí)間9h，酶解期間不斷攪拌，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷至4°C后以轉(zhuǎn)速5000rpm/min離心lOmin，得上清液。
[0027](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3 ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得到超濾液。
[0028](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到二個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該二個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A，快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用DEAE-SepharoseFF離子交換層析柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，將凝膠裝柱，Tris-HcI平衡后(pH為7.4)，將超濾液配制成200mg/ml的溶液，每次上樣量為3mL，分別用Tris-Hcl(pH為7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為2.2ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;收集各峰。
[0029](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到三個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該三個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測(cè)后，即得氨基酸序列為:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用葡聚糖凝膠G-25層析柱(尺寸:2.6 X 80cm;柱料:Sephadex G_25)，將組分B配制成200mg/ml的溶液，上樣量:2.0mL;流動(dòng)相:超純水;洗脫液流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm；自動(dòng)收集速度:4.0min/管;收集各峰;組分B純度檢測(cè)方法為:采用ZORBAXSB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μπι，4.6 X 150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脫方式:80%A，20%B；流速:1.0 mL/min ；柱溫:25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:20yL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。
[0030]實(shí)施例3
(I)縊蟶預(yù)處理:將縊蟶除殼剝?nèi)夂?，用清水把蛤肉洗凈，?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后，用異丙醇浸泡縊蟶肉4h，縊蟶與異丙醇的質(zhì)量比為1:4，過(guò)濾后濾渣用純化水泡洗至無(wú)異丙醇異味，脫水得縊蟶肉渣，備用。
[0031](2)酶解:將步驟(I)中的縊蟶肉渣加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:3.5，加酶量1800U/g，pH值7，酶解溫度55°C，酶解時(shí)間10 h，酶解期間不斷攪拌，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷至5°C后以轉(zhuǎn)速8000rpm/min離心20min，得上清液。
[0032](3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μπι濾膜抽濾后，用截留分子量為3 ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得到超濾液。
[0033](4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到二個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該二個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A，快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用DEAE-SepharoseFF離子交換層析柱(填料粒徑10 μπι, 10 X 300 mm)，將凝膠裝柱，Tri s-Hc I平衡后(pH為7.4)，將超濾液配制成200mg/ml的溶液，每次上樣量為3mL，分別用Tris-Hcl(pH為7.4)、0.lmol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為2.2ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;收集各峰。
[0034](5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到三個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該三個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測(cè)后，即得氨基酸序列為:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用葡聚糖凝膠G-25層析柱(尺寸:2.6 X 80cm;柱料:Sephadex G_25)，將組分B配制成200mg/ml的溶液，上樣量:2.0mL;流動(dòng)相:超純水;洗脫液流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm；自動(dòng)收集速度:4.0min/管;收集各峰;組分B純度檢測(cè)方法為:采用ZORBAXSB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μπι，4.6 X 150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脫方式:80%A，20%B；流速:1.0 mL/min ；柱溫:25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:20yL;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。
[0035]本發(fā)明提取分離工藝合理，可操作性強(qiáng)，以縊蟶為原料，通過(guò)中性蛋白酶酶解后利用超濾技術(shù)、快速蛋白純化系統(tǒng)和高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(ACE抑制肽，純度達(dá)99%以上)，其經(jīng)氨基酸測(cè)序儀進(jìn)行N端降解測(cè)序，得到五肽，其氨基酸序列為:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)，其相對(duì)分子質(zhì)量為636.78 Da，TPMGP的IC5Q為0.15 mg/ml，具有較高的ACE抑制活性(ACE抑制率為96.1%以上)，為從縊蟶中制備高活性的ACE抑制肽提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0036]以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)縊蟶預(yù)處理:將縊蟶除殼剝?nèi)夂?，用清水把蛤肉洗凈，?jīng)高速組織攪碎機(jī)勻漿后，用異丙醇浸泡縊蟶肉3?5h，過(guò)濾后濾渣用純化水泡洗至無(wú)異丙醇異味，脫水得縊蟶肉渣，備用； (2)酶解:將步驟(1)中的縊蟶肉渣加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為:料液比1:3?4，加酶量1500~2000U/g，pH值6.5-7.5,酶解溫度50?60°C，酶解時(shí)間9?12 h，酶解完成后用沸水浴滅活，預(yù)冷后離心，得上清液； (3)超濾分離:將上清液經(jīng)0.45μm濾膜抽濾后，用截留分子量為3 ku的超濾膜進(jìn)行超濾，得到超濾液； (4)快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化:將步驟(3)中的超濾液經(jīng)快速蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，得到二個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該二個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分A; (5)高效液相色譜系統(tǒng)分離純化:將組分A經(jīng)高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)分離純化，得到三個(gè)活性組分，分別取樣測(cè)定該三個(gè)活性組分的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性，取血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性最高的組分記為組分B，組分B經(jīng)純度檢測(cè)后，即得氨基酸序列為:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(I)中，縊蟶與異丙醇的質(zhì)量比為1:3?5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，酶解期間不斷攪拌。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，預(yù)冷至4?6°C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(2)中，離心工藝條件為:轉(zhuǎn)速5000~10000rpm/min，離心時(shí)間10~30min。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(4)中，快速蛋白純化系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用DEAE-SepharoseFF離子交換層析柱(填料粒徑10 μm，1 × 300 mm)，將凝膠裝柱，Tris_Hc I平衡后(pH為7.4 )，將超濾液配制成200mg/ml的溶液，每次上樣量為3ml，分別用Tris-Hcl(pH為7.4)、0.1mol/L、0.3mol/L、.0.5mol/L、0.8mol/L和lmol/L的NaCl溶液進(jìn)行階段洗脫，洗脫速度為2.2ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng).280nm;收集各峰。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(5)中，高效液相色譜系統(tǒng)分離純化的具體方法為:采用葡聚糖凝膠G-25層析柱(尺寸:.2.6 × 80cm ；柱料:Sephadex G-25)，將組分B配制成200mg/ml的溶液，上樣量:2.0mL ；流動(dòng)相:超純水;洗脫液流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;自動(dòng)收集速度:4.0min/管;收集各峰。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種縊蟶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽制備方法，其特征在于，步驟(5)中，組分B純度檢測(cè)方法為:采用ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑:5μm，4.6 ×.150 mm);流動(dòng)相A為超純水(含0.05%TFA)，流動(dòng)相B為乙腈(含0.05%TFA)，采用等度洗脫方式:80%A，20%B ；流速:1.0 mL/min ；柱溫:25°C ；自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量:20yL ；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK105821102SQ201511011196
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日
【發(fā)明人】余方苗, 羅李玉, 楊最素, 黃芳芳, 丁國(guó)芳
【申請(qǐng)人】浙江海洋學(xué)院