一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法。其步驟為A.孢子懸浮液的制備，B.無機鹽培養(yǎng)基的優(yōu)化，C.降解玉米赤霉烯酮。使用該方法培養(yǎng)的純培養(yǎng)物可用于降解各種飼料中污染的真菌毒素玉米赤霉烯酮，其降解率達到99%，并且制備及應用方法簡單，操作方便。為動物飼料除去霉菌毒素（玉米赤霉烯酮）提供了有效方法。CCTCC AF 9329519931217
【專利說明】
一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 玉米赤霉稀酮(zearalenone)又稱為F-2毒素，是由Stob等人在1962年首次從污染 了禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)的發(fā)霉玉米中分離得到的真菌毒素(mycotoxin)。 玉米赤霉稀酮是主要由鐮刀菌屬的真菌如禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌(Fusarium roseum)、串 珠鐮刀菌（Fusarium maniliborme)、三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum)等合成、分泌的次 級代謝產(chǎn)物，是一種具有強烈致畸作用的生殖系統(tǒng)毒素，會導致家畜繁殖障礙、流產(chǎn)死胎、 免疫抑制、生長速度下降等嚴重后果，給畜牧業(yè)帶來巨大的危害。由于鐮刀菌屬的真菌生態(tài) 適應性強，既能寄生生活又能腐生生活，因此，從田間作物到飼料都存在著因鐮刀菌的侵染 而發(fā)展到污染玉米赤霉稀酮的可能性。同時，不僅玉米，小麥、燕麥、大米、大麥、蕎麥、高粱 等作物也都易受玉米赤霉烯酮的污染，使得玉米赤霉烯酮在飼料和飼料原料中的危害作用 影響特別深遠。包括美國、澳大利亞在內(nèi)的多國研究都表明受玉米赤霉烯酮污染的作物及 飼料抽檢陽性率高于60%，而在我國，受玉米赤霉烯酮污染的作物及飼料抽檢陽性率高達 80%以上，且在小麥、大麥、玉米等多種谷物樣品中檢測到，已經(jīng)成為危害糧食及畜牧業(yè)生產(chǎn) 和發(fā)展的重大污染源。解決玉米赤霉烯酮污染對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人類及牲畜健康具有重 要意義。
[0004] 鑒于玉米赤霉烯酮所帶來的嚴重危害性，目前已發(fā)展出不少針對玉米赤霉烯酮進 行脫毒的技術(shù)手段。玉米赤霉稀酮去除方法從原理上可分為脫毒(decontamination)和解 毒(detoxification)兩種，按方法可大致分為化學方法、物理方法和生物學方法。玉米赤霉 烯酮脫毒是指去除或中和被污染飼料中玉米赤霉烯酮的方法，玉米赤霉烯酮解毒是指去除 玉米赤霉烯酮毒性的方法?；瘜W去除方法是通過酸堿溶液或其他化合物對玉米赤霉烯酮進 行處理，物理去除方法包括機械分類處理、高溫失活、放射處理或提取被污染物和吸附劑 等，生物學解毒方法主要是利用微生物來降解毒素。然而，化學去除方法會改變飼料性狀， 而且成本較高，不適合應用于飼料及其原料中。物理去除方法中的機械分類處理、高溫失 活、放射處理或提取被污染物等方法也存在著成本高、操作難等缺點而難以大規(guī)模使用。因 此，目前對于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的解脫毒研究主要集中在吸附法和生物降解法上。 又因為吸附法仍無法將玉米赤霉烯酮進行解毒，使污染有可能二次發(fā)生，相比之下，生物降 解法則具有諸多優(yōu)勢，利用微生物或其代謝產(chǎn)物進行解毒，生物酶的專一性強，成本低廉， 清除率高，持續(xù)時間長，對環(huán)境和農(nóng)作物都沒有污染，利于大規(guī)模生產(chǎn)，是理想的防治玉米 赤霉烯酮的方法。
[0005] 然而目前有關(guān)玉米赤霉烯酮生物降解的研究比較少，如果直接使用菌粉則容易降 解，且因為有活的菌體，不能使用在食品中。相比較而言，降解玉米赤霉烯酮的酶制劑產(chǎn)品 安全、脫毒、效率高，易于保存，且能加入到食品中，有著更大的應用前景空間?，F(xiàn)有的能降 解玉米赤霉烯酮的純酶制劑尚未有報道，深入挖掘降解玉米赤霉烯酮的酶及其相關(guān)基因， 優(yōu)化其發(fā)酵生產(chǎn)條件，提高其降解活性及效率，是大規(guī)模生產(chǎn)和應用的基本前提。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過如下途徑實現(xiàn)的：一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方 法，其降解方法如下： A. 孢子懸浮液的制備： 將黑曲霉菌株在察氏高鹽培養(yǎng)基平板上進行劃線，在30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，使用無 菌接種環(huán)接取氣生菌絲上的黑色孢子，并將孢子接入一毫升無菌水中，最后通過梯度稀釋 和血球計數(shù)板計數(shù)，最終稀釋到1 X 107 CFU/mL的濃度； B. 無機鹽培養(yǎng)基的處方： 所述培養(yǎng)基的主要成分為：1L超純水含：蔗糖20-40 g，K2HP〇4.3H20 0.5-1.5 g，NH4Cl 2-4 g,KCl 0.5-1 g,MgS〇4-7H20 0.25-0.75 g,FeS04 0.01-0.02 g,ZnS04-7H20 0.075- 0.125 g,CuS04-5H20 0.01-0.03 g, Na2Mo〇4-2H20 0.075-0.125g； 培養(yǎng)基最佳處方：1L超純水含：蔗糖30 g，K2HP〇4.3H20 1 g，NH4Cl 3 g，KCl 0.5 g， MgS〇4.7H20 0.5 g，F(xiàn)eS〇4 0.01 g，ZnS〇4.7H20 0.1 g，CuS〇4.5H20 0.03 g，Na2Mo〇4.2H2〇 0-1 g; c.降解玉米赤霉稀酮： 將黑曲霉菌株1 x 107 CFU/mL接種到含有玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基中，該菌株的 接種量為無機鹽培養(yǎng)基溶液體積的1 -2%;在30 ± 2 °C培養(yǎng)3-5天。
[0008] 本發(fā)明一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下主 要優(yōu)點： 其一，首次發(fā)現(xiàn)了能夠完全降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉菌株，若按照IX 1〇7 CFU/mL的 孢子懸液1-2%的接種量接種并培養(yǎng)后，該培養(yǎng)物能在3-5天內(nèi)降解玉米赤霉烯酮，降解率達 到99%。
[0009] 其二，該黑曲霉菌株的功能鑒定為玉米赤霉烯酮污染的生物治理提供了寶貴的菌 種資源，為今后研究生物對玉米赤霉烯酮的代謝途徑，以及從分子生物學水平揭示其降解 玉米赤霉烯酮的降解機制提供了材料，并為獲得治理玉米赤霉烯酮污染酶制劑的研發(fā)提供 了可能性。
[0010] 其三，對無機鹽培養(yǎng)基的優(yōu)化使得僅用幾種價格低廉的無機鹽就能使該菌在降解 玉米赤霉稀酮時效率提高，降解玉米赤霉稀酮的能力進一步提高。
[0011] 其四，該黑曲霉菌株的制備及應用方法簡單，成本低廉，操作方便。
【附圖說明】
[0012] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明： 圖1是含有10毫克每升的玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基在接入黑曲霉菌株孢子后1分 鐘時，上清液的高效液相色譜圖； 圖2是含有10毫克每升的玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基在接入黑曲霉菌株孢子后培養(yǎng) 3天時，上清液的高效液相色譜圖； 圖3是含有10毫克每升的玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基在接入黑曲霉菌株孢子后培養(yǎng) 5天時，上清液的高效液相色譜圖； 圖4是黑曲霉分別在蔗糖，葡萄糖，甘油和檸檬酸鈉四種不同碳源生長時降解玉米赤霉 烯酮的曲線圖； 圖5是黑曲霉分別在NaN03，NH4Cl，酵母粉和蛋白胨四種不同氮源生長時降解玉米赤霉 烯酮的曲線圖； 圖6是黑曲霉在添加了四種不同金屬離子后降解玉米赤霉烯酮速率的折線圖； 圖7是黑曲霉在優(yōu)化后的無機鹽培養(yǎng)基中加入玉米赤霉烯酮時的生長曲線和玉米赤霉 烯酮降解曲線圖。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，其降解方法如下： A. 孢子懸浮液的制備： 將黑曲霉菌株在察氏高鹽培養(yǎng)基平板上進行劃線，在30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，使用無 菌接種環(huán)接取氣生菌絲上的黑色孢子，并將孢子接入一毫升無菌水中，最后通過梯度稀釋 和血球計數(shù)板計數(shù)，最終稀釋到1 X 107 CFU/mL的濃度； B. 無機鹽培養(yǎng)基的處方： 所述培養(yǎng)基的主要成分為：1L超純水含：蔗糖20-40 g，K2HP〇4.3H20 0.5-1.5 g，NH4Cl 2-4 g,KCl 0.5-1 g,MgS〇4-7H20 0.25-0.75 g,FeS04 0.01-0.02 g,ZnS04-7H20 0.075- 0.125 g,CuS04-5H20 0.01-0.03 g, Na2Mo〇4-2H20 0.075-0.125g； 培養(yǎng)基最佳處方：1L超純水含：蔗糖30 g，K2HP〇4.3H20 1 g，NH4Cl 3 g，KCl 0.5 g， MgS〇4.7H20 0.5 g，F(xiàn)eS〇4 0.01 g，ZnS〇4.7H20 0.1 g，CuS〇4.5H20 0.03 g，Na2Mo〇4.2H2〇 0-1 g; c.降解玉米赤霉稀酮： 將黑曲霉菌株1 x 107 CFU/mL接種到含有玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基中，該菌株的 接種量為無機鹽培養(yǎng)基溶液體積的1 -2%;在30 ± 2 °C培養(yǎng)3-5天。
[0014] -、玉米赤霉稀酮降解能力的初步鑒定 在滅菌的無機鹽培養(yǎng)基中加入色譜級玉米赤霉烯酮，使其終濃度達到10毫克每升，將 稀釋后的孢子懸浮液接種到含有玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基中，使孢子的終濃度達到1 X 105 CFU/mL。在30°C搖床中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)每分鐘。在培養(yǎng)五天后，使用滅菌濾紙對培 養(yǎng)物進行過濾，所得濾液再進行高速離心10分鐘，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)每分鐘，離心后吸取上清 液，使用高效液相色譜鑒定上清液中玉米赤霉烯酮的含量。高效液相色譜的檢測條件為:色 譜儀為48丨16的30001?高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為(：18反相柱(250\4.6臟，5以111)，流 動相為甲醇和水，梯度洗脫，流速為1毫升每分鐘，檢測波長為200 nm到600 nm。從圖1中看 出玉米赤霉烯酮在16.41分鐘出峰，最大吸收峰在242 nm左右。對比圖2可以看出，在培養(yǎng)3 天后，該濃度的玉米赤霉烯酮已經(jīng)降解，降解率達到70%。而對比圖3可以看出，在培養(yǎng)5天 后，該濃度的玉米赤霉烯酮已經(jīng)被完全降解，降解率達到99%。
[0015] 二、無機鹽培養(yǎng)基的優(yōu)化 1.在進行碳源的篩選時，分別選取了蔗糖，葡萄糖，甘油和檸檬酸鈉四種具有代表性的 碳源，探索黑曲霉AS 3.350菌株利用雙糖、單糖、醇和有機酸時降解玉米赤霉烯酮能力的變 化。在培養(yǎng)基其他組分不變的情況下，在一升體系中分別加入總量30克的不同碳源，然后接 入等量的孢子懸浮液，并加入等量的玉米赤霉烯酮，在30度搖床培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔 24小時進行取樣，并使用上述HPLC檢測方法對體系內(nèi)的玉米赤霉烯酮含量進行檢測。檢測 的結(jié)果如圖4所示，在四種不同碳源培養(yǎng)的條件下，黑曲霉AS 3.350降解玉米赤霉烯酮的能 力有顯著不同，其中在蔗糖中有最佳降解速率，說明該菌對雙糖的適應力最好。同時可見其 在甘油和檸檬酸鈉中降解速率幾乎為零，分析原因這可能是該菌無法利用這些碳源，從而 無法生長也無法行使降解能力。
[0016] 2.在進行氮源的篩選時，選取了 NaN〇3，NH4Cl，酵母粉和蛋白胨四種具有代表性的 氮源，探索黑曲霉AS 3.350菌株利用酸性氮源、堿性氮源、有機復合氮源和氨基酸類氮源時 降解玉米赤霉烯酮能力的變化。在培養(yǎng)基其他組分不變的情況下，在一升體系中分別加入 總量1克的不同氮源，然后接入等量的孢子懸浮液，并加入等量的玉米赤霉烯酮，在30度搖 床培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔24小時進行取樣，并使用上述HPLC檢測方法對體系內(nèi)的玉米赤 霉烯酮含量進行檢測。檢測的結(jié)果如圖5所示。在四種不同氮源培養(yǎng)的條件下，黑曲霉AS 3.350降解玉米赤霉烯酮的能力也有顯著不同，其中在NH4CI中有最佳降解速率，說明該菌 對堿性的氮源的適應力最好，分析原因，有可能是利用堿性氮源時，其調(diào)整了玉米赤霉烯酮 大內(nèi)酯環(huán)的水解程度，使其被利用的幾率增大。
[0017] 3.在對無機鹽和金屬離子進行篩選時，選擇了ZnS〇4 · 7H20，CuS04 · 5H20，MnS〇4 · H2O和Na2Mo〇4 · 2H2O這幾種具有代表性且可作酶輔因子的金屬離子。在篩選過程中，對每種 金屬離子均檢測了低中高三種不同的濃度，并使用L9(34)正交法對其進行檢測，正交數(shù)據(jù) 如表1所示。
[0018] 檢測結(jié)果如圖6所示，黑曲霉菌AS 3.350在培養(yǎng)基添加了低濃度的ZnS〇4 · 7H20， CuS04 · 5H2O和高濃度的Na2Mo〇4 · 2H2O時具有較好的降級玉米赤霉烯酮的速率，而添加 MnS〇4 · H20對其降解速率影響不大。
[0019] 4.檢測了在培養(yǎng)基中添加表面活性劑對酶活的影響作用。在試驗中，還檢測了表 明活性劑TWEEN-20對其降解酶活力的影響。在加入了0.1%的TWEEN-20的培養(yǎng)基中，黑曲霉 AS 3.350的生長受到一定程度的抑制，同時通過檢測其降解玉米赤霉烯酮的情況，分析得 出其相比對照組降解更慢，故表明活性劑對降解玉米赤霉烯酮沒有促進作用。
[0020] 綜上所述，我們得出優(yōu)化后的培養(yǎng)基的成分及含量，如下所示： 蔗糖 30克，Κ2ΗΡ〇4·3Η20 1 克，NH4C1 3克，KC1 0.5克，MgS〇4*7H20 0.5克，F(xiàn)eS〇4 0.01 克，ZnS〇4 · 7H20 0.1 克，CuS04 · 5H20 0.03克和Na2Mo〇4 · 2H20 0.1 克，溶于 1 升超純水，滅菌 后使用。
[0021] 三、利用優(yōu)化后的無機鹽培養(yǎng)基進行黑曲霉菌AS 3.350的生長和降解玉米赤霉烯 酮的實驗。
[0022]依照結(jié)果1中的步驟，使用優(yōu)化后的無機鹽培養(yǎng)基接種黑曲霉AS 3.350的孢子懸 浮液并加入玉米赤霉烯酮。對體系進行定時取樣，測定其細胞干重和玉米赤霉烯酮濃度的 測定，得到其生長和降解曲線，如圖7所示。
[0023]黑曲霉，收藏時間：1993-12-17，保藏地點：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏編 號：CCTCC AF 93295,屬名：Aspergillus，種名：niger。
【主權(quán)項】
1. 一種利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于:其降解方法如下： A. 孢子懸浮液的制備： 將黑曲霉菌株在察氏高鹽培養(yǎng)基平板上進行劃線，在30° C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，使用無 菌接種環(huán)接取氣生菌絲上的黑色孢子，并將孢子接入一毫升無菌水中，最后通過梯度稀釋 和血球計數(shù)板計數(shù)，最終稀釋到1 X 107 CFU/mL的濃度； B. 無機鹽培養(yǎng)基的處方： 所述培養(yǎng)基的主要成分為：1L超純水含：蔗糖20-40 g，K2HP〇4.3H20 0.5-1.5 g，NH4Cl 2-4 g,KCl 0.5-1 g,MgS〇4-7H20 0.25-0.75 g,FeS04 0.01-0.02 g,ZnS04-7H20 0.075-0.125 g,CuS04-5H20 0.01-0.03 g, Na2Mo〇4-2H20 0.075-0.125g； 培養(yǎng)基最佳處方：1L超純水含：蔗糖30 g，K2HP〇4.3H20 1 g，NH4Cl 3 g，KCl 0.5 g， MgS〇4.7H20 0.5 g，F(xiàn)eS〇4 0.01 g，ZnS〇4.7H20 0.1 g，CuS〇4.5H20 0.03 g，Na2Mo〇4.2H2〇 0-1 g; c.降解玉米赤霉稀酮： 將黑曲霉菌株1 x 107 CFU/mL接種到含有玉米赤霉烯酮的無機鹽培養(yǎng)基中，該菌株的接 種量為無機鹽培養(yǎng)基溶液體積的1 -2%;在30 ± 2 °C培養(yǎng)3-5天。
【文檔編號】C12N1/14GK105838614SQ201511013475
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年12月31日
【發(fā)明人】姜旋, 張素琴, 羅永祥, 胡智鵬, 許加娟, 黎明, 張世敏, 康匯然, 葉維民, 賈艷林, 王躍球, 魏友崗, 高遵波, 梁漢新, 周桂香, 潘沼羽, 朱瑤, 文少懷, 李林, 蔣宇, 康建南
【申請人】湖南圣雅凱生物科技有限公司