一種細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長因子組合物。其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有0～1％的血清。該生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白。該細(xì)胞培養(yǎng)基成本低、能夠促進(jìn)細(xì)胞的正常生長，適用于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。此外，本發(fā)明還公開了采用該細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法。
【專利說明】
_種細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，動物細(xì)胞貼壁生長是細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求，一直以來在細(xì)胞培養(yǎng)中必須要有血清的介入才能保證細(xì)胞的正常生長。但是血清對于細(xì)胞生長也有不利的一面。成本的高昂，進(jìn)口血清的采購限制，血清對細(xì)胞的負(fù)面影響致使人們不斷地研究挖掘血清替代品。
[0003]曾經(jīng)的無血清培養(yǎng)基面市之后，引起不小的反響。但是無血清培養(yǎng)基需要對細(xì)胞進(jìn)行專門的訓(xùn)化，需要針對細(xì)胞做專門的定制，過程繁瑣，成本高居不下，不能有效解決細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的需要。血清培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)都成為細(xì)胞培養(yǎng)的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基，此細(xì)胞培養(yǎng)基不含有或含低量的血清，其成本低，培養(yǎng)效果好，能適用于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法采用含有生長因子組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，培養(yǎng)過程簡單、且培養(yǎng)成本低，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。
[0006]本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0007]—種細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長因子組合物。其中，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有O?1%的血清。該生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白。
[0008]其中，人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100IU/mL，成纖維細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500pg/mL，集落刺激因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100ng/mL，粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?200pg/mL。
[0009]—種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其包括:
[0010]添加生長因子組合物至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有O?I%的血清；
[0011 ]將待培養(yǎng)的細(xì)胞接種至該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中；
[0012]該生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白。其中，人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100IU/mL，成纖維細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500pg/mL，集落刺激因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100ng/mL，粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?200pg/mL。
[0013]本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)方法的有益效果是:相對現(xiàn)有的含血清培養(yǎng)基，本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加含有I?100IU/mL人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、10?500pg/mL的成纖維細(xì)胞生長因子、I?100ng/mL的集落刺激因子以及I?200pg/mL的粘連蛋白的生長因子組合物，來降低血清的使用量或不用添加血清，不僅確保細(xì)胞能夠正常生長，還降低細(xì)胞培養(yǎng)基的成本，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品O
[0015]下面對本發(fā)明實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行具體說明。
[0016]本發(fā)明實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長因子組合物。
[0017]該生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白。
[0018]在添加了上述生長因子組合物的情況下，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可添加O?10%的血清。也就是說，該基礎(chǔ)培養(yǎng)基可不添加血清或添加少量的血清，也可確保細(xì)胞正常生長，也能降低成本。
[0019]其中，較佳地，血清為FBS即胎牛血清。
[0020]其中，人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100IU/mL，成纖維細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500pg/mL，集落刺激因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100ng/mL，粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?200pg/mL。人角質(zhì)細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，成纖維細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，集落刺激因子促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖，粘連蛋白促進(jìn)細(xì)胞貼壁、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。
[0021]添加有上述生長因子組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基能夠適用于各種類型細(xì)胞的大規(guī)?；囵B(yǎng)。如HaCaT細(xì)胞即人永生化表皮細(xì)胞。
[0022]其中，較佳地，生長因子組合物還可以包括表皮生長因子和神經(jīng)生長因子中的一種或兩種的組合。
[0023]其中，表皮生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5?500IU/mL。
[0024]其中，神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500ng/mL。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟。
[0026]首先，添加生長因子組合物至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得到細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0027]其中，生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白。
[0028]人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100IU/mL，成纖維細(xì)胞生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為1?500pg/mL，集落刺激因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100ng/mL，粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?200pg/mL。
[0029]其中，較佳地，人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別為30?70IU/mL、150?350pg/mL、30?70ng/mL、60?140pg/mLo
[0030]其中，更佳地，人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別為50 IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL。
[0031]人角質(zhì)細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，成纖維細(xì)胞生長因子能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，集落刺激因子促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖，粘連蛋白促進(jìn)細(xì)胞貼壁、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。
[0032]添加有上述生長因子組合物的細(xì)胞培養(yǎng)基能夠適用于各種類型細(xì)胞的大規(guī)?；囵B(yǎng)。如HaCaT細(xì)胞即人永生化表皮細(xì)胞。
[0033]此外，生長因子組合物還可以包括表皮生長因子和神經(jīng)生長因子中的一種或兩種的組合。
[0034]其中，表皮生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5?500IU/mL。表皮生長因子能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂。
[0035]較佳地，表皮生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為200IU/mL。
[0036]神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500ng/mL。神經(jīng)生長因子能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長、增殖。
[0037]較佳地，神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為300ng/mL。
[0038]在添加了上述生長因子組合物的情況下，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可不用再添加血清，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的細(xì)胞的無血清培養(yǎng);當(dāng)然，針對不同類型的細(xì)胞，可再往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加少量的血清，所添加血清的用量與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積比優(yōu)選為0.5?1%，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的低血清培養(yǎng)。
[0039]通過添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的無血清培養(yǎng)或低血培養(yǎng)，將大大地降低血清的使用量，節(jié)約培養(yǎng)成本，操作過程簡單，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，其中，較佳地，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基或Ml99培養(yǎng)基。
[0040]接著，將待培養(yǎng)的細(xì)胞按細(xì)胞濃度為4?5X 14個(gè)/mL接種至上述細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0041]再接著，將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)基置于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)48?72小時(shí)，得到大量貼壁生長的細(xì)胞。
[0042]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0043]實(shí)施例1
[0044]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白。
[0045]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別100 IU/mL、200pg/mL、7 Ong/ mL、I pg/mL。
[0046]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0047 ]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37 °C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0048]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0049]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0050]實(shí)施例2
[0051 ]首先，在培養(yǎng)瓶中加入M199培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子粘連蛋白以及表皮生長因子。
[0052]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白以及表皮生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別lIU/mL、500pg/mL、50ng/mL、60pg/mL、50IU/mL。
[0053]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0054]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0055]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0056]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0057]實(shí)施例3
[0058]首先，在培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子粘連蛋白以及神經(jīng)生長因子。
[0059]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子粘連蛋白以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別30IU/mL、350pg/mL、lng/mL、100pg/mL、500ng/mL。
[0060]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0061 ]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37 °C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0062]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0063]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0064]實(shí)施例4
[0065]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子。
[0066]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別71IU/mL、10pg/mL、100ng/mL、200pg/mL、500IU/mL、10ng/mL。
[0067]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0068]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0069]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0070]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0071]實(shí)施例5
[0072]首先，在培養(yǎng)瓶中加入M199培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子。
[0073]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別50IU/mL、150pg/mL、30ng/mL、140pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
[0074]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0075]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0076]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0077]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0078]實(shí)施例6
[0079]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子。
[0080]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別100IU/mL、200pg/mL、70ng/mL、lpg/mL、350IU/mL、120ng/mLo
[0081 ]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5 X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0082 ]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37 °C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0083]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0084]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0085]實(shí)施例7
[0086]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子。
[0087]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別lIU/mL、500pg/mL、50ng/mL、60pg/mL、50IU/mL、380ng/mL。
[0088]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0089 ]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37 °C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0090]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0091]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0092]實(shí)施例8
[0093]首先，在培養(yǎng)瓶中加入M199培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子。
[0094]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別30IU/mL、350pg/mL、lng/mL、100pg/mL、5IU/mL、500ng/mLo
[0095]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0096]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0097]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0098]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0099]實(shí)施例9
[0100]首先，在培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子神經(jīng)生長因子以及I %的FBS0
[0101]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、500IU/mL、300ng/mL。
[0102]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0103]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0104]以上述添加了生長因子組合物和I%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0105]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0106]實(shí)施例10
[0107]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子。
[0108]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
[0109]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0110]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0111]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0112]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0113]實(shí)施例11
[0114]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子以及
0.5%FBSo
[0115]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
[0116]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0117]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0118]以上述添加了生長因子組合物和0.5%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的肽牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照組，觀察HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。
[0119]結(jié)果顯示，培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異。
[0120]實(shí)施例12
[0121 ]第一次傳代培養(yǎng)
[0122]首先，在培養(yǎng)瓶中加入RPMI1640培養(yǎng)基，并往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子。
[0123]控制人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子、粘連蛋白、表皮生長因子以及神經(jīng)生長因子在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度分別50IU/mL、200pg/mL、50ng/mL、100pg/mL、200IU/mL、300ng/mL。
[0124]接著，將HaCaT細(xì)胞接按細(xì)胞濃度5X 14個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶中。
[0125]然后，將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時(shí)后，進(jìn)行第二次傳代培養(yǎng)。
[0126]第二次傳代培養(yǎng)
[0127]取第一次傳代培養(yǎng)后的HaCaT細(xì)胞，經(jīng)消化、離心后，按1:3的比例接種至含有新鮮的無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。
[0128]將接種后的培養(yǎng)瓶置于37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0129]以上述添加了生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0%的FBS)作為實(shí)驗(yàn)組，以含10%的FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未添加生長因子組合物)作為對照組，觀察經(jīng)過第一次傳代培養(yǎng)后的HaCaT細(xì)胞在兩組培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果顯示，第二次傳代培養(yǎng)72h后，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度在90?95%，實(shí)驗(yàn)組的HaCaT細(xì)胞能夠正常貼壁生長，與對照組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞的匯合度無明顯差異，表明該細(xì)胞培養(yǎng)方法能夠使HaCaT細(xì)胞進(jìn)行正常的傳代培養(yǎng)。
[0130]綜上所述，本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)方法采用含有生長因子組合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)或低血清培養(yǎng)，不僅能夠確保正常貼壁生長，在正常的培養(yǎng)時(shí)間里達(dá)到90?95%的匯合度，而且降低了血清使用量，其成本低、節(jié)約了培養(yǎng)成本，適合大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)操作。
[0131]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長因子組合物，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有O?1%的血清，所述生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白，其中，所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100IU/mL，所述成纖維細(xì)胞生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500pg/mL，所述集落刺激因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?I OOng/ mL，所述粘連蛋白在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?200pg/mL。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述生長因子組合物還包括表皮生長因子，所述表皮生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5?500IU/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述生長因子組合物還包括神經(jīng)生長因子，所述神經(jīng)生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500ng/mL。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為30?70IU/mL，所述成纖維細(xì)胞生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為150?350pg/mL，所述集落刺激因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為30?70ng/mL，所述粘連蛋白在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為60?140pg/mL。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基或Ml 99培養(yǎng)基。6.一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，其包括: 添加生長因子組合物至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，得到細(xì)胞培養(yǎng)基，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有O?I %的血清； 將待培養(yǎng)的細(xì)胞接種至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中； 其中，所述生長因子組合物包括人角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、集落刺激因子以及粘連蛋白，所述人角質(zhì)細(xì)胞生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100IU/mL，所述成纖維細(xì)胞生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500pg/mL，所述集落刺激因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?100ng/mL，所述粘連蛋白在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為I?200pg/mL。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述生長因子組合物還包括表皮生長因子，所述表皮生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為5?500IU/mL。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述生長因子組合物還包括神經(jīng)生長因子，所述神經(jīng)生長因子在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10?500ng/mL。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞為HaCaT細(xì)胞。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基或RPMI 1640培養(yǎng)基或Ml 99培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12N5/071GK105838666SQ201610364492
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】賈芳苗, 楊詩明, 鄧飛
【申請人】成都遠(yuǎn)睿生物技術(shù)有限公司