一種提取mrsa基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)菌基因組提取，具體針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)提供一種基因組DNA的提取方法，利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶和核裂解液對(duì)MRSA進(jìn)行裂解。所述方法包括如下步驟：(1)細(xì)菌培養(yǎng)：將MRSA接種液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)；(2)細(xì)菌收集：將MRSA過夜培養(yǎng)液離心去上清，加入EDTA重懸沉淀；(3)細(xì)菌裂解：向重懸液中依次加入溶菌酶和溶葡萄球菌酶進(jìn)行孵育，孵育完成后，離心去上清，進(jìn)行核裂解；(4)去除RNA與蛋白質(zhì)；(5)沉淀與洗滌。本發(fā)明方法提取的基因組DNA純度高，濃度大，能滿足特定基因的鑒定和測(cè)序等研究的要求，而且省時(shí)高效，操作簡(jiǎn)單。
【專利說明】
一種提取MRSA基因組DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)菌基因組提取，具體地說，涉及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) 基因組DNA的提取。
【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)60年代在歐美首先發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(111的1^(^11111- resistant Staphylococcus aureus，MRSA)以來(lái)，MRSA在臨床分離的葡萄球菌中的比例不 斷增加，其已成為醫(yī)院感染的重要病原菌，并常見其流行、暴發(fā)的報(bào)道。由于MRSA往往具有 多藥耐藥特征，再加上其致病性強(qiáng)，己成為臨床抗菌感染治療的難題之一，并成為各國(guó)研究 的熱點(diǎn)。在奶牛養(yǎng)殖中也發(fā)現(xiàn)了 MRSA的流行，由其引起的乳房炎導(dǎo)致患牛產(chǎn)奶量嚴(yán)重下降， 成為牛群MRSA的感染源。MRSA感染牛很難治愈，最終導(dǎo)致死亡或淘汰，這對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成 了非常重大的損失，并嚴(yán)重威脅人類健康。
[0003] 現(xiàn)在針對(duì)MRSA的檢測(cè)技術(shù)主要有:分子生物學(xué)方法，染色體DNA限制性內(nèi)切酶指紋 圖譜分析的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法(RFLP)，PCR方法等，這些方法的基礎(chǔ)都是需要高質(zhì) 量的細(xì)菌基因組。而且對(duì)MRSA的深入研究也非常需要得到濃度大，純度高的MRSA基因組，現(xiàn) 在還沒有一種專門針對(duì)MRSA的基因組提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種提取MRSA基因組DNA 的方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種提取MRSA基因組DNA的方法，利用溶菌酶、 溶葡萄球菌酶和核裂解液對(duì)MRSA進(jìn)行裂解。
[0006] 進(jìn)一步地，所述方法具體包括如下步驟：
[0007] (1)細(xì)菌培養(yǎng):將MRSA接種液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)；
[0008] (2)細(xì)菌收集:將MRSA過夜培養(yǎng)液離心去上清，加入EDTA重懸沉淀；
[0009] (3)細(xì)菌裂解：向重懸液中依次加入溶菌酶和溶葡萄球菌酶進(jìn)行孵育，孵育完成 后，離心去上清，進(jìn)行核裂解；
[0010] (4)去除RNA與蛋白質(zhì)；
[0011] (5)沉淀與洗滌。
[0012]其中，所述溶菌酶和溶葡萄球菌酶為市售可得產(chǎn)品，例如，溶菌酶可購(gòu)自生工生物 工程(上海)股份有限公司，溶葡萄球菌酶可購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0013 ]所述液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基。
[0014]進(jìn)一步地，所述細(xì)菌培養(yǎng)具體為:將MRSA菌液加入裝有胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 中，吹打混勻，放在搖床上200rpm，37 °C過夜培養(yǎng)。
[0015]進(jìn)一步地，所述細(xì)菌裂解具體為：向重懸液中依次加入10mg/mL的溶菌酶和5mg/mL 的溶葡萄球菌酶，37°C孵育60min，孵育完成后，離心去上清，加入核裂解液80°C裂解5min;
[0016] 所述溶菌酶的加入量為步驟(2)中EDTA加入量的1/8,所述溶葡萄球菌酶的加入量 為步驟(2)中EDTA加入量的1 /12，所述核裂解液的加入量為溶菌酶的加入量的10倍。
[0017] 利用上述操作裂解細(xì)菌，可以通過溶菌酶、溶葡球菌酶以及核裂解液的裂解，使細(xì) 胞壁充分破碎裂解，釋放核DNA。進(jìn)一步地，所述(4)通過加入RnaseA孵育后，再加入蛋白沉 淀液冰浴離心，實(shí)現(xiàn)去除RNA與蛋白質(zhì)。
[0018] 所述蛋白沉淀液為promegaWizard?Genomic DNA Purification kit中提供，屬 市售可得產(chǎn)品，可購(gòu)自北京照生萊博商貿(mào)有限公司。通過RnaseA和蛋白沉淀液的作用，去除 裂解后體系中的RNA與蛋白質(zhì)，提高基因組DNA的純度。
[0019] 進(jìn)一步地，所述沉淀與洗滌具體為:將去除了 RNA和蛋白質(zhì)的上清液加入到異丙醇 中，上下顛倒，見絮狀沉淀即為DNA，離心后用70%乙醇洗滌沉淀。
[0020] 更進(jìn)一步地，前述步驟中涉及離心的離心條件為13000rpm，2min-5min。
[0021]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供一個(gè)完整的最佳實(shí)施方案，具體包括如下步驟：
[0022] 1)取50yL MRSA菌液，打入裝有5mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的離心管中，吹打混 勻，放在搖床上200rpm，37 °C過夜培養(yǎng)；
[0023] 2)吸取lmL過夜培養(yǎng)物，加入滅菌離心管中，13000rpm離心2min_5min，棄上清；
[0024] 3)加入480yL pH8.0EDTA重懸沉淀，吹打混勻，再加入60yL10mg/mL的溶菌酶，最后 加入5mg/mL的溶葡萄球菌酶40yL，手彈混勾；
[0025] 4)將離心管放入金屬浴中，37°C孵育60min;
[0026] 5)孵育結(jié)束后，13000rpm離心2-5min，棄上清；
[0027] 6)加入600yL核裂解液(試劑盒中）吹打混勻，80 °C裂解5min，恢復(fù)至室溫；
[0028] 7)加入3yLRNaseA溶液，顛倒混勻2-5次，37°C，孵育60min;
[0029] 8)孵育結(jié)束后，加入200yL蛋白沉淀液，渦旋混勻，冰浴5min，13000rpm離心2- 5min；
[0030] 9)將離心后的上清液倒入已加入600yL異丙醇的離心管中，上下顛倒，可見絮狀沉 淀即為DNA，然后13000rpm離心2min，棄上清；
[0031 ] 10)加入600yL 70% (體積分?jǐn)?shù)）的乙醇，指彈清洗沉淀，13000rpm離心2min，棄上 清，即得MRSA基因組DNA。
[0032] 之后，還可接以下步驟：
[0033] 11)室溫風(fēng)干 10_15min，加入 100yL DNA-Rehydration solution，然后金屬浴65°C 孵育lh至沉淀完全溶解；
[0034] 12)根據(jù)操作說明，用Nanodrop對(duì)提取的DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。
[0035]其中，核裂解液、DNA-Rehydration solution均為promegaWizarf⑩Genomic DNA Purification kit中提供，購(gòu)自北京照生萊博商貿(mào)有限公司。Nanodrop 2000為實(shí)驗(yàn)室紫外 分光光度計(jì)，購(gòu)自基因有限公司。
[0036]需要說明的是，上述各步驟中涉及的體積可等比例擴(kuò)大或縮小，均在本發(fā)明保護(hù) 的范圍之內(nèi)。
[0037]本發(fā)明的有益效果在于：
[0038]本發(fā)明針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)提供一種基因組DNA的提取方法。 該方法提取的基因組DNA純度高，濃度大，能滿足特定基因的鑒定和測(cè)序等研究的要求，而 且省時(shí)高效，操作簡(jiǎn)單。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中提取的4株MRSA菌基因組DNA圖譜。
[0040] 圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例1中提取的4株MRSA菌MecA基因的電泳鑒定結(jié)果。
[0041 ]圖3為本發(fā)明對(duì)比例1中提取的4株MRSA菌基因組DNA圖譜。
[0042]圖4為本發(fā)明對(duì)比例1中提取的4株MRSA菌Me cA基因的電泳鑒定結(jié)果。
[0043] 圖 1 ~圖 4 中，1:王 13;2:193-2;3:141-1;4 :156-1，5:陰性，M:DNA marker II。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí) 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。
[0045] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0046] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0047] 實(shí)驗(yàn)例1 4株MRSA菌株的基因組DNA提?。?br>[0048] 1、利用前述方法提取經(jīng)金葡菌特異性培養(yǎng)基鑒定的4株MRSA菌基因組DNA電泳圖 譜，如圖1所示。
[0049]提取的基因組DNA樣品的濃度及純度如表1所示。0D260/280代表核酸吸收峰值與 蛋白質(zhì)吸收光值的比值，以1.8-2.00為佳;0D260/230代表核酸吸收峰值與碳源物質(zhì)吸收光 值的比值，等于或大于2較好。
[0050] 表1基因組DNA樣品濃度及純度信息表
[0051]
[0052]由表1可看出，所提取的基因組DNA濃度較高，從260/280和260/230兩個(gè)比值看出 蛋白質(zhì)和鹽類污染也較少，DNA純度較高。
[0053] 2、以前述方法提取的4株MRSA基因組DNA為模版，進(jìn)行MRSA菌株的特異性基因 MecA 的鑒定，具體操作步驟如下：
[0054]設(shè)計(jì)引物序列為：
[0055] 正向引物F: 5 ' -GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA-3 '，
[0056] 反向引物尺：5'-〇^厶11'〇^〇厶11^1'1'111^1'0^厶-3'，
[0057]以所提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25yL體系，具體為正向引物F lyL，反向引物R lyL，Premix Taq? 12.5yL，ddH20 8yL，模板DNA 2.5yL〇
[0058] 反應(yīng)條件為：94。(：1〇111丨11;941€4〇86(3,58 1€4〇86(3,721€5〇86(3,35個(gè)循環(huán)；721€711^11 ;4°C保存;反應(yīng)完成后，進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可見長(zhǎng)度為 31 Obp的清晰明亮單一的條帶，鑒定為MRSA菌株的特異性基因 MecA。
[0059] 對(duì)比例1
[0060] 本對(duì)比例應(yīng)用傳統(tǒng)的煮沸提取法，即將菌液加入到生理鹽水中混勻，金屬浴10 0 °C，30min，離心，取上清液進(jìn)行DNA提取。提取的金葡菌基因組DNA濃度及純度如表2所示。 [0061 ] 表2煮沸法提取金葡菌基因組DNA濃度及純度信息表
[0062]
[0063]所提取的基因組DNA的電泳圖譜及按照實(shí)驗(yàn)例1進(jìn)行MRSA菌株的特異性基因 MecA 的鑒定的電泳圖譜如圖3和圖4所示。
[0064] 由表2和圖3、圖4可知，煮沸法沒有對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行充分破碎，使得提取效果并不理 想。
[0065] 通過對(duì)比可知，本發(fā)明提供的方法，通過溶菌酶、溶葡球菌酶以及核裂解液的作 用，使得細(xì)胞壁得到充分裂解，釋放純度濃度均很好的基因組DNA。
[0066] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提取MRSA基因組DNA的方法，其特征在于，利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶和核裂解 液對(duì)MRSA進(jìn)行裂解。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 細(xì)菌培養(yǎng):將MRSA接種液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)； (2) 細(xì)菌收集:將MRSA過夜培養(yǎng)液離心去上清，加入EDTA重懸沉淀； (3) 細(xì)菌裂解：向重懸液中依次加入溶菌酶和溶葡萄球菌酶進(jìn)行孵育，孵育完成后，離 心去上清，進(jìn)行核裂解； (4) 去除RNA與蛋白質(zhì)； (5) 沉淀與洗滌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌裂解具體為：向重懸液中依次加 入10mg/mL的溶菌酶和5mg/mL的溶葡萄球菌酶，37°C孵育60min，孵育完成后，離心去上清， 加入核裂解液80°C裂解5min; 所述溶菌酶的加入量為步驟(2)中EDTA加入量的1/8,所述溶葡萄球菌酶的加入量為步 驟(2)中EDTA加入量的1/12，所述核裂解液的加入量為溶菌酶的加入量的10倍。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述(4)通過加入RnaseA孵育后，再加入蛋 白沉淀液冰浴離心，實(shí)現(xiàn)去除RNA與蛋白質(zhì)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述沉淀與洗滌具體為:將去除了 RNA和蛋 白質(zhì)的上清液加入到異丙醇中，上下顛倒，見絮狀沉淀即為DNA，離心后用70%乙醇洗滌沉 淀。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌培養(yǎng)具體為:將MRSA菌液加入裝 有胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，吹打混勻，放在搖床上200rpm，37 °C過夜培養(yǎng)。7. 根據(jù)權(quán)利要求2~5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述離心條件為13000rpm， 2min-5min〇8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟： 1) 取50yL MRSA菌液，打入裝有5mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的離心管中，吹打混勻，放 在搖床上200rpm，37 °C過夜培養(yǎng)； 2) 吸取lmL過夜培養(yǎng)物，加入滅菌離心管中，13000rpm離心2min-5min，棄上清； 3) 加入480yLpH8.0EDTA重懸沉淀，吹打混勻，再加入60yL10mg/mL的溶菌酶，最后加入 5mg/mL的溶葡萄球菌酶40yL，手彈混勻； 4) 將離心管放入金屬浴中，37°C孵育60min; 5) 孵育結(jié)束后，13000rpm離心2-5min，棄上清； 6) 加入600yL核裂解液(試劑盒中）吹打混勻，80 °C裂解5min，恢復(fù)至室溫； 7) 加入3yLRNaseA溶液，顛倒混勻2-5次，37°C，孵育60min; 8) 孵育結(jié)束后，加入200yL蛋白沉淀液，渦旋混勻，冰浴5min，13000rpm離心2-5min; 9) 將離心后的上清液倒入已加入600yL異丙醇的離心管中，上下顛倒，可見絮狀沉淀即 為DNA，然后13000rpm離心2min，棄上清； 10) 加入600yL 70 %的乙醇，指彈清洗沉淀，13000rpm離心2min，棄上清，即得MRSA基因 組 DNA; 上述各步驟中涉及的體積可等比例擴(kuò)大或縮小。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105838710SQ201610382596
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】俞英, 張志超, 錢夢(mèng)櫻, 王迪
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)