一種微藻組成型表達啟動子及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種微藻組成型表達啟動子及其應用。本發(fā)明從三角褐指藻中克隆出啟動子PPt49202，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的啟動子PPt49202能夠啟動下游基因在微藻細胞生長的生長周期高效表達，因此可將其應用于基因工程中，在基因工程中有良好的應用前景。
【專利說明】
一種微藻組成型表達啟動子及其應用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種微藻組成型表達啟動子及其應用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 當前，世界性能源短缺和環(huán)境污染已經(jīng)成為人類社會所面臨的巨大挑戰(zhàn)，因此，尋 找一種替代化石能源的新型可再生清潔能源，已成為世界各國的共識。生物柴油 (Biodiesel)，其性能跟石化柴油基本相當，且具有良好環(huán)保性和生物降解性，已成為國際 上應用最廣、發(fā)展最快的理想可再生能源。目前，生物柴油是指來自生物體的油脂（主要為 甘油三酯)與醇類（甲醇或乙醇)經(jīng)酯交換作用而形成單烷基脂肪酸酯。
[0003] 微藻制生物柴油的原理是利用微藻光合作用，將化工生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的二氧化碳 轉(zhuǎn)化為微藻自身的生物質(zhì)，從而固定了碳元素，再通過誘導反應使微藻自身的碳物質(zhì)轉(zhuǎn)化 為油脂，然后利用物理或化學方法把微藻細胞內(nèi)的油脂轉(zhuǎn)化到細胞外，再進行提煉加工，從 而生產(chǎn)出生物柴油。微藻是光合自養(yǎng)型的低等水生植物，其種類繁多，分布極其廣泛。其具 有光合作用效率高，生長快速，生物量大等特點。而且油脂含量較客觀，已成為制備生物柴 油的優(yōu)質(zhì)天然原料，是未來生物柴油發(fā)展的研究熱點。目前，微藻生物柴油的生產(chǎn)能耗和高 昂成本是阻礙其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。
[0004] 海洋硅藻富含油脂，一般占細胞干重的40%_60%，且短鏈脂肪酸(C14與C16)占總 脂肪酸的67%_70%左右。2008年，海洋硅藻三角褐指藻基因組已測完，是硅藻生物學研究 的模式藻。其油脂含量一般在20%_30%左右，是制備生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料。通過基因工程 技術(shù)手段構(gòu)建出高油脂含量的工程微藻有望提高生物柴油的產(chǎn)率。
[0005]目前，通過基因工程手段獲得的高產(chǎn)油三角褐指藻，大多數(shù)都是過表達某個脂質(zhì) 相關(guān)的關(guān)鍵基因得到的。然而，這種方法獲得的產(chǎn)油藻的產(chǎn)油效果是有限的。當前，在三角 褐指藻產(chǎn)油的研究中，廣泛應用的啟動子只有一種，這大大阻礙了微藻基因工程的發(fā)展。
[0006] 啟動子是一段位于基因 5'端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA 準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動子一般由啟動子核心元件和上游元件組成。 位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-20~-30bp處的TATA box為啟動子核心元件，是富含有AT的保守序 列區(qū)，與DNA(脫氧核糖核酸)雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點的選擇，是絕大多數(shù)植物 啟動子正確表達所必需的。TATA box上游的保守序列稱為啟動子上游元件，包括上游-75bp 處的CAAT box和-80-llObp附近的GC box等一般上游啟動子元件及其他特殊的上游元件。 大量文獻表明啟動子元件的種類、數(shù)量以及彼此間胡順序與距離都可能影響基因的轉(zhuǎn)錄與 否或轉(zhuǎn)錄程度，不同基因其啟動子的長度各有不同，所含有胡元件也各有不同，因此，啟動 子的長度與其啟動基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。
[0007] 目前，通過基因工程獲得的高產(chǎn)油微藻一般都是使用三角褐指藻內(nèi)源型啟動子 fcp(fucoxanthin，chlorophyll a/c-binding protein，墨角藻葉綠素 a/c結(jié)合蛋白）基因 簇，此啟動子已實現(xiàn)多個報告基因與目的基因的穩(wěn)定表達。然而，若想同時表達多個脂質(zhì)關(guān) 鍵基因，只有一個啟動子是不夠的，在動物中，同時過表達多個基因的技術(shù)已經(jīng)相當成熟。 只要有不同的啟動子，就能同時過表達不同的基因。但是，在三角褐指藻中只有少數(shù)啟動子 被證實并廣泛應用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種微藻組成型表達啟動子。
[0009] 所述的微藻組成型表達啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明的微藻組成型表達啟動子是三角褐指藻一個預測蛋白的啟動子，在KEGG上 編號為PHATRDRAFT_49202,故將此啟動子命名為PPt49202啟動子。此在微藻整個繁殖周期 均可高效啟動報告基因。此啟動子位于三角褐指藻21號染色體上，全長715bp，在染色體上 位置是：209542-210256。
[0011] 通過PLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)和 PLANTCARE預測軟件對該啟動子(715bp)進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子的基本組成元件 TATA-box、TATA_1 ike motif、CAAT_box，且包含多個誘導元件，光誘導轉(zhuǎn)錄元件:GT-1 box; 熱誘導元件：CCAAT box ;硫反應核心元件：SURE ;冷誘導順式作用元件核心區(qū)域：MYC recognition sit;|丐離子反應順式元件:ABRE-related sequenc;銅反應元件核心區(qū)域： CuRE core;暗反應元件:CDA-1;增強基因表達元件:CT-rich motif。
[0012] 本發(fā)明將PPt49202啟動子與報告基因 GUS連接，構(gòu)建到帶有抗性基因（博來霉素） 的質(zhì)粒中，通過電擊等方法，把重組質(zhì)粒整合到三角褐指藻的基因組中，只需驗證GUS的表 達即能驗證啟動子的啟動效率。
[0013] 目前在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛應用的⑶S基因由大腸桿菌E.coli菌株K12中uidA(也稱 gusA)基因座編碼。該基因編碼的β-葡萄糖苷酸酶，系統(tǒng)命名為β-D-glucuronide glucuronosohydrolase(EC 3.2 · 1 · 31)。該酶是一種外切水解酶，能催化多種β-D-葡萄糖苷 酸類物質(zhì)水解為D-葡萄糖醛酸和糖苷配基。1987年Jefferson等克隆了⑶S基因并進行了測 序，由此發(fā)展出用GUS基因作為基因融合標記的系統(tǒng)。由于在絕大多數(shù)植物的細胞內(nèi)不存在 內(nèi)源的GUS活性，而且GUS基因表達產(chǎn)物具有檢測方法簡單、靈敏度高、易于定量及定位分 析、可以與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)點，使得GUS基因成為近年來在植物基因工程研究中應 用最為廣泛的報道基因之一。
[0014] 目前常用于GUS組織化學定位的酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸(5- brom〇-4-chloro_3-indolyl glucuronide,簡稱X-Gluc)。這一底物能夠在酶活性位點形成 藍色沉淀物。β-葡萄糖苷酸酶作用于X-Gluc的初始產(chǎn)物為無色的吲哚衍生物，經(jīng)過氧化二 聚化作用形成不溶解的5，5'-二溴-4，4'-二氯深色的靛藍色物質(zhì)，使得具有⑶S活性的部位 呈現(xiàn)藍色。
[0015] 本發(fā)明的PPt49202啟動子是三角褐指藻內(nèi)源啟動子，啟動Pt49202蛋白基因的表 達，因此，本發(fā)明驗證了在三角褐指藻一個生長繁殖周期啟動子效率。分別利用⑶S染色組 織染色法和實時熒光PCR(Real-time qPCR)方法來檢測該啟動子的效率。
[0016] Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。 由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定 量的依據(jù)。real-time qPCR由于其操作簡便，靈敏度高，重復性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速。設(shè) 在已經(jīng)涉及到生命科學研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的 檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。對RT-PCR產(chǎn)生的結(jié)果，分析時采用2#法，即按照 如下公式進行計算：
[0017] 1. ACt(目的基因 Ct-內(nèi)參Ct)的平均值土標準偏差；
[0018] 2. Δ ACt(待測樣品中目的基因 Act-參照樣品中目的基因 Act)的平均值土標 準偏差；
[0019] 3.相對表達量(2-AACt)的平均值土標準偏差。
[0020] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達載體，其特征在于，含有上述微藻組成型表 達啟動子。
[0021] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種宿主細胞，其特征在于，含有上述表達載體。
[0022]所述的宿主細胞優(yōu)選為三角褐指藻。
[0023]本發(fā)明的第四個目的是提供上述微藻組成型表達啟動子在啟動下游基因在三角 褐指藻的細胞生長周期高效表達的應用。
[0024]所述的微藻優(yōu)選為三角褐指藻。
[0025]所述的下游基因優(yōu)選為三角褐指藻Pt49202蛋白基因。
[0026]本研究發(fā)現(xiàn)的啟動子序列沒有任何文獻報道過，在GenBank等公開數(shù)據(jù)庫也沒有 任何注釋是啟動子及何種特征的啟動子。本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)并鑒定該啟動子的功能、啟動 效率。本發(fā)明從三角褐指藻Pt49202蛋白基因的啟動子:三角褐指藻Pt49202蛋白基因啟動 子，該啟動子能夠啟動下游基因在三角褐指藻的細胞生長周期均能高效表達，因此可將其 應用于基因工程中在基因工程中有良好的應用前景。
【附圖說明】：
[0027]圖1是重組載體圖譜；
[0028]圖2是PCR驗證結(jié)果，其中，TC是轉(zhuǎn)化藻，WT是野生藻；
[0029] 圖3是轉(zhuǎn)化藻⑶S染色圖，其中，1是對照藻，2是轉(zhuǎn)化藻；
[0030] 圖4是三角褐指藻染色后細胞形態(tài)圖，其中，A、B是野生藻，C、D是轉(zhuǎn)化藻；
[0031]圖5是第一、四、八天野生藻和轉(zhuǎn)化藻在正常條件⑶S染色效果，其中，第1、3、5為第 一、四、八天野生藻，第2、4、6為第一、四、八天正常條件轉(zhuǎn)化藻；
[0032]圖6是第一天正常條件后RT-PCR分析結(jié)果，WT是野生藻，202是轉(zhuǎn)化藻；
[0033]圖7是第四天正常條件后RT-PCR分析結(jié)果，WT是野生藻，202是轉(zhuǎn)化藻；
[0034]圖8是第八天正常條件后RT-PCR分析結(jié)果，WT是野生藻，202是轉(zhuǎn)化藻。
【具體實施方式】：
[0035]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0036] 實施例1:
[0037] 一、啟動子和⑶S基因的克隆
[0038]首先，提取三角褐指藻的基因組DNA，采用Magene公司的植物DNA提取試劑盒進行。 引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE方法純化，使用時稀釋到100μΜ。啟動子 PPtHsp20在三角褐指藻DNA中克隆，GUS基因于通用載體pCAMBIA1301(于上海捷蘭生物技術(shù) 有限公司購買）中克隆。其中克隆條件均采用PCR方法，使用KOD-plus-Neo酶（Τ0Υ0Β0， JAPAN)PCR獲得，啟動子PPt49202及GUS基因的PCR引物如表1所示，PCR反應體系分別如表2 和表3所示，三角褐指藻Pt49202蛋白基因的啟動子沒有確認，本發(fā)明通過多個預測軟件預 測到PPt49202啟動子的核心元件，并取其中715bp為啟動子區(qū)域，在此區(qū)域設(shè)計引物。
[0039] 表1.PCR 引物
[0040]
[0041] 表2.PCR 反應體系（20μ1)
[0042]
[0043] 表3 XUS基因 PCR反應體系（20μ1)
[0044]
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[0047] 通過PLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)和 PLANTCARE預測軟件對上述克隆的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子的基本組成元件 TATA-box、CAAT_box，且包含多個誘導元件，光誘導順式作用元件:-10 promoter element; 光誘導轉(zhuǎn)錄元件:T-box、GT_l box;熱誘導元件:CCAAT box;硫反應核心元件:SURE;質(zhì)體 PatpB基因啟動子核心元件:Box II。該序列被命名為啟動子PPt49202。
[0048] 二、構(gòu)建重組載體
[0049] 把上述克隆出來的啟動子PPt49202、GUS基因以及fcpA終止子(277bp，由上海生工 生物有限公司合成）通過采用ClonExpress MultiS One Step Cloning試劑盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd，nanjing)同源重組的方法連接到含有博來霉素抗性表達盒的載體，含有 博來霉素抗性表達盒的載體是由pPt-ApCAT載體(pPt-ApCAT載體的構(gòu)建步驟參考Niu等， 2011)把氯霉素抗性基因通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)基因工程手段替換成博來霉素基 因獲得，得到含有啟動子PPt49202和GUS基因的重組表達載體(如圖1所示）。
[0050]三、三角褐指藻轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化藻的篩選
[0051 ]參考Niu等(2012)的電擊方法把重組載體整合到三角褐指藻基因組中。通過4-5次 博來霉素的篩選獲得具有抗性的轉(zhuǎn)化藻。
[0052]四、轉(zhuǎn)化藻的驗證
[0053] 第一步，在分子水平上驗證，把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g離心 5min收集，用PBS溶液清洗3次后用Magene公司的植物DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用 GUS-F 引物（F: 5 ' ATGTTACGTCCTGTAGAAA 3 '）和⑶S-R 引物（；R: 5 ' TGTTTGCCTCCCTGCTGCGGT 3'）進行PCR，結(jié)果如圖2所示，第3列是轉(zhuǎn)化藻，第4列是野生型藻，轉(zhuǎn)化藻在大概1.8kb處有 條帶，而野生型藻沒有，可知轉(zhuǎn)化藻中已含有⑶S基因。
[0054] 第二步，在表觀上驗證，把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g離心5min 收集，藻沉淀用GUS染色試劑盒37 °C染色過夜，然后5000g離心棄上清，加入lml固定液（乙 醇：乙酸= 3:1)洗脫30min，結(jié)果如圖3所示，1為對照藻，染色后無顏色變化，2為轉(zhuǎn)化藻，染 色后形成藍色沉淀物，由此可知，轉(zhuǎn)化藻均能表達GUS基因。
[0055]第三步，從細胞形態(tài)上觀察。轉(zhuǎn)化藻通過GUS染色后，取10μ1的藻液置于倒置顯微 鏡觀察細胞形態(tài)，如圖4所示。Α、Β為野生型的藻細胞沒有染上藍色，C、D為轉(zhuǎn)化藻細胞整個 細胞均染成藍色。
[0056] 五、GUS染色驗證啟動子效率
[0057]對轉(zhuǎn)化藻的報告基因 GUS進行表觀驗證。將野生型藻和轉(zhuǎn)化藻分別放置在新的培 養(yǎng)基中且藻密度控制在lxlO6個/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控 制在2.2x10s個。藻沉淀用GUS染色試劑盒37 °C染色過夜，然后5000g離心棄上清，加入lml固 定液（乙醇：乙酸=3:1)洗脫30min后拍照。結(jié)果如圖6所示，由圖5可知，第一天轉(zhuǎn)化藻⑶S染 色顯示最接近藍色，第四，第八天⑶S染色為藍綠色，推測原因是，在三角褐指藻生長周期初 期啟動表達的GUS基因效率最高，對數(shù)期和穩(wěn)定期啟動效率降低。
[0058] 六、RT-PCR檢測啟動子效率
[0059]本發(fā)明對轉(zhuǎn)化藻的報告基因 GUS進行熒光實時定量分析。野生型藻和轉(zhuǎn)化藻放置 新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在lxlO6個/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的 數(shù)量控制在3xl08個。3000g離心5min，于-80°保存。采用Omega公司的植物RNA提取試劑盒獲 得三角褐指藻的RNA，TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對GUS基因的特異 引物F: 5 'GCCAAAAGCCAGACAGAGTG3 ' ；R: 5 ' TGACGACCAAAGCCAGTAAAG3'，用于實時定量擴增。 所用熒光探針SYBR qPCR Mix購自TAKARA公司，實驗所用的檢測設(shè)備為美國Bio-Rad公司的 CFX96Touch?熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。結(jié)果如圖6-8所示。由此可見，該啟動子在三角褐指藻 生長繁殖周期都能高效啟動目的基因表達，并且均能顯著性提高目的基因表達。第一天GUS 基因相對表達量最高；第四天轉(zhuǎn)化藻；第八天轉(zhuǎn)化藻。因此。實時定量PCR結(jié)果可知， PPt49202啟動子在三角褐指藻生長周期均能高效啟動基因的表達。
【主權(quán)項】
1. 一種微藻組成型表達啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -種表達載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的微藻組成型表達啟動子。3. -種宿主細胞，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的表達載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為三角褐指藻。5. 權(quán)利要求1所述的微藻組成型表達啟動子在啟動下游基因在微藻的細胞生長周期高 效表達的應用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述的微藻為三角褐指藻。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述的下游基因為三角褐指藻Pt49202蛋 白基因。
【文檔編號】C12R1/89GK105838715SQ201610269811
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】李宏業(yè), 劉婉君, 陳嘉雯, 楊維東, 劉潔生
【申請人】暨南大學