用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【專利摘要】一種用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述的無血清培養(yǎng)基包含5?10g/L碳水化合物、1?5g/L氨基酸、5?10g/L無機(jī)鹽、0.01~0.05g/L維生素、5~10g/L酵母提取物以及10?20ml/L的脂質(zhì)乳化劑。與傳統(tǒng)的添加血清成分的培養(yǎng)基相比較具有成本低、易于配制，無動物源性污染、批次穩(wěn)定等特點(diǎn)，與一般的商業(yè)化培養(yǎng)基相比較，能懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，提高表達(dá)量，更適合于大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，有利于重組蛋白的穩(wěn)定獲得。
【專利說明】
用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及培養(yǎng)基領(lǐng)域，涉及到一種用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞在體外進(jìn)行繁殖和培養(yǎng)。起于20世紀(jì)初的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成 為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具，越來越多的生物藥物如單抗、疫苗和活性蛋白質(zhì) 等都是利用細(xì)胞成功表達(dá)和生產(chǎn)的。在最近20年里，以昆蟲細(xì)胞為代表的無脊椎動物細(xì)胞 培養(yǎng)在應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮的作用愈發(fā)重要。以桿狀病毒為載體，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)外源蛋白，備受人們的青睞。另外，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還被認(rèn)為是表達(dá) 病毒樣顆粒疫苗的最佳系統(tǒng)，已成功開發(fā)了多種人用和動物用疫苗。
[0003] 大規(guī)模的體外細(xì)胞培養(yǎng)需要提供適合細(xì)胞生長的有利環(huán)境，包括營養(yǎng)成分、溫度、 pH、滲透壓、氧氣和培養(yǎng)瓶或特定的培養(yǎng)界面等。良好的培養(yǎng)基可提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng) 成分、合適的PH和滲透壓，是細(xì)胞培養(yǎng)中最為關(guān)鍵的因素。
[0004]傳統(tǒng)的商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基需要添加大量的血清或血清白蛋白用于輔助細(xì)胞生長。 高價格且不易獲取的血清常成為重要的限制因素。從生產(chǎn)的角度來看，在培養(yǎng)基中大量使 用動物血清或血清白蛋白也是有問題的，由于血清中存在未被鑒定的蛋白質(zhì)，使得下游的 產(chǎn)品純化更加復(fù)雜化。另外，血清中污染的動物病毒可能造成嚴(yán)重的安全問題。血清的批間 質(zhì)量存在差異，科學(xué)家或生產(chǎn)工程師需要根據(jù)這種差異性進(jìn)行調(diào)整，從而增加工作量。 [0005]目前已經(jīng)開發(fā)出一些用于培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，但這些培養(yǎng)基普遍存在 成本過高或不能適用于懸浮培養(yǎng)。如2010年5月13日提交的CN101988047A不適用于懸浮培 養(yǎng)，且培養(yǎng)的細(xì)胞密度低。再比如，JP20060185008所述的培養(yǎng)基含有多找小分子添加物和 重組蛋白，具有很高的成本。公開號為CN1498267A所述培養(yǎng)基含有大量進(jìn)口的水解乳白蛋 白和酵母提取物，顯著的提高了成本。目前已開發(fā)的培養(yǎng)基的另外一個缺點(diǎn)是不能直接用 于柱上純化，需要經(jīng)過濃縮等其它處理步驟后才可用于純化，不利于表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)處理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，以克服現(xiàn)有 培養(yǎng)基制備復(fù)雜、配制復(fù)雜，生產(chǎn)成本高的問題。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述的無血清培養(yǎng)基包含 5-10g/L碳水化合物、l-5g/L氨基酸、5-10g/L無機(jī)鹽、0.01~0.05g/L維生素、5~10g/L酵母提 取物以及10_20ml/L的脂質(zhì)乳化劑。
[0008] 進(jìn)一步，所用的氨基酸可包括150-250mg/L天冬氨酸、20-50mg/L蘇氨酸、40-80mg/ L絲氨酸、200_300mg谷氨酸、40_80mg/L甘氨酸、50-100mg/L繳氨酸、100_200mg/L蛋氨酸、 100_200mg/L 異亮氨酸、30_50mg/L 亮氨酸、100_200mg 苯丙氨酸、80_140mg/L 賴氨酸、20- 5011^/1^組氨酸、100-15011^/1^精氨酸、50-10011^/1^脯氨酸、180-30011^/1^天冬酰胺、1000-1200mg/L谷氨酰胺、10-30mg/L半胱氨酸及30-80mg/L酪氨酸。
[0009] 進(jìn)一步，所用維生素包括0.1-0.31^/1生物素、5-101^/1泛酸、10-15 11^/1煙酸、 0 · 1-0 · 5mg/L 對氨基苯甲酸、0 · 5-0 · 8mg/L維生素 BI、l-3mg/L維生素 B6、0 · 2-0 · 5mg/L維生素 BI2、I_3mg/L核黃素、0 · I-0 · 4mg/L葉酸、15_20mg/L氯化膽堿。
[0010] 進(jìn)一步，所用無機(jī)鹽可包括200-800mg/L氯化鈣、800-1200mg/L硫酸鎂、500-80011^/1氯化鉀、400-100011^/1碳酸氫鈉、1500-300011^/1氯化鈉、800-120011^/1磷酸二氫 鈉；含于1000X濃縮液的〇. 005-0.0 lSmg/!六水合氯化鈷、0.01-0.05mg/L二水合氯化銅、 0 · 001-0 · 01mg/L四水合氯化錳、0 · 05-0 · 20mg/L氯化鋅、0 · 1-0 · 2mg/L七水合硫酸亞鐵、 0 · 001-0 · 01mg/L七水合鉬酸銨。
[0011] 本發(fā)明的目的還在于提供一種用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基在懸浮培 養(yǎng)昆蟲細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0012] 用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的主要成分為碳水化合物、氨基酸、無機(jī) 鹽、維生素、酵母提取物和脂質(zhì)乳化劑。
[0013] 碳水化合物如葡萄糖、果糖和麥芽糖是大部分昆蟲細(xì)胞的主要碳源和能源。在多 數(shù)培養(yǎng)基中，葡萄糖作為碳源能被迅速利用，雖然在桿狀病毒感染后昆蟲細(xì)胞的生長也會 消耗部分蔗糖，但它在培養(yǎng)基中所起主要作用是調(diào)節(jié)滲透壓。本發(fā)明的培養(yǎng)基中所含碳水 化合物含量在5-8g/L，且不含蔗糖和麥芽糖，有利于發(fā)酵過程中對滲透壓的控制。
[0014] 不同種類的昆蟲細(xì)胞對氨基酸有不同的要求，其中有14種是必需氨基酸，細(xì)胞本 身不能合成，必須由培養(yǎng)基提供。
[0015] 可用于本發(fā)明的氨基酸包括，150-250mg/L天冬氨酸、20-50mg/L蘇氨酸、40-80mg/ L絲氨酸、200_300mg谷氨酸、40_80mg/L甘氨酸、50-100mg/L繳氨酸、100_200mg/L蛋氨酸、 100_200mg/L 異亮氨酸、30_50mg/L 亮氨酸、100_200mg 苯丙氨酸、80_140mg/L 賴氨酸、20-5011^/1^組氨酸、100-15011^/1^精氨酸、50-10011^/1^脯氨酸、180-30011^/1^天冬酰胺、1000-1200mg/L谷氨酰胺、10-30mg/L半胱氨酸及30-80mg/L酪氨酸。
[0016] 可用于本發(fā)明的維生素包括，0 · 1-0.3mg/L生物素、5-10mg/L泛酸、l〇-15mg/L煙 酸、0 · 1-0 · 5mg/L對氨基苯甲酸、0 · 5-0 · 8mg/L維生素 BI、l-3mg/L維生素 B6、0 · 2-0 · 5mg/L維 生素 BI2、I_3mg/L核黃素、0 · I-0 · 4mg/L葉酸、15_20mg/L氯化膽堿。
[0017]本培養(yǎng)基含有5-lOg/l無機(jī)鹽?？捎糜诒景l(fā)明的無機(jī)鹽包括，200-800mg/L氯化鈣、 800-1200mg/L 硫酸鎂、500-800mg/L 氯化鉀、400-1000mg/L 碳酸氫鈉、1500-3000mg/L 氯化 鈉、800-1200mg/L磷酸二氫鈉;含于1000X濃縮液的0 · 005-0 · OlSmg/!六水合氯化鈷、0 · 0 ΙΟ · 05mg/L 二 水合氯化銅、0 · 001-0 · 01mg/L四 水合氯化錳、0 · 05-0 · 20mg/L 氯化鋅、0 · 1-0.2mg/L七水合硫酸亞鐵、0.001-0.01mg/L七水合鉬酸銨。
[0018]酵母提取物(Yeastolate，YL)是昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分，它是維生素和嘌呤 的主要來源，本發(fā)明中可包含，例如，5-10g/L的酵母提取物。
[0019] 本發(fā)明的無血清完全培養(yǎng)基還包含其它成分，例如，5-15ml/L的脂質(zhì)乳化劑和Ig/ L的防起泡劑Kolliphor K188。
[0020] 培養(yǎng)基的配制相對而言較為簡單，配制方法并不唯一。例如，培養(yǎng)基可通過下面所 述的方法制備，將所有成分及附加物先以各自合適濃度溶解于水，調(diào)節(jié)pH至合適值，然后加 壓使溶液通過一個薄膜濾器而獲得無菌無支原體的培養(yǎng)基。
[0021] 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基， 所述的無血清培養(yǎng)基包含5-10g/L碳水化合物、l-5g/L氨基酸、5-10g/L無機(jī)鹽、0.01~ 0.05g/L維生素、5~10g/L酵母提取物以及10-20ml/L的脂質(zhì)乳化劑。
[0022] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的碳水化合物不包含蔗糖和麥芽糖等多糖。
[0023] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基不含胱氨酸、丙氨酸和羥脯氨酸。
[0024]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基含有1.0-1.2g/L的谷氨酰胺。
[0025] 本發(fā)明所涉及的培養(yǎng)基所含成分種類少，含量低，配制簡單，且能夠達(dá)到和商業(yè)化 培養(yǎng)基相同的效果。所有成分均為簡單易得試劑，購買方便，成本低廉。與組成類似的另一 種動物細(xì)胞培養(yǎng)基（公開號為CN101988047)相比較，本發(fā)明所述培養(yǎng)基所含氨基酸成分顯 著減少，價格較高的酵母提取物顯著減少，脂質(zhì)體為自制，僅維生素的成分有所增加，因此 培養(yǎng)基的生產(chǎn)和配制更加方便。以所有成分均采用Sigma、BD和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品 為例，本發(fā)明所述培養(yǎng)基成本相比較進(jìn)口同類產(chǎn)品大約降低70%以上，具有良好的商業(yè)化前 景。與國外經(jīng)典產(chǎn)品相比，本培養(yǎng)基可直接用于柱上純化，無需濃縮等其它處理步驟，非常 方便表達(dá)產(chǎn)物后續(xù)處理。
[0026] 與傳統(tǒng)的添加血清成分的培養(yǎng)基相比較具有成本低、易于配制，無動物源性污染、 批次穩(wěn)定等特點(diǎn)，與一般的商業(yè)化培養(yǎng)基相比較，能懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，提高表達(dá)量，更適合于 大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，有利于重組蛋白的穩(wěn)定獲得。
【附圖說明】
[0027]圖1:自制的NB-SFM培養(yǎng)基與SF900 III培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)SF9細(xì)胞，對比培養(yǎng)效果圖 圖2:自制的NB-SFM培養(yǎng)基與商業(yè)化培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)High Five細(xì)胞，對比培養(yǎng)效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下為結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對 本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明的技術(shù)方案的 細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，本發(fā) 明實(shí)施例所用試劑，如未特殊說明，均購自生化試劑供應(yīng)商，所用實(shí)驗技術(shù)，如未特別說明， 均為常規(guī)技術(shù)。
[0029]本發(fā)明培養(yǎng)基命名為NB-SFM。下列實(shí)施例用于闡明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案， 不應(yīng)解釋為限制了它的范圍。實(shí)施例中氨基酸購自TCI，無機(jī)鹽和維生素購自國藥公司和 Sigma，其它成分購自Sigma和BD。其中所用商業(yè)化培養(yǎng)基為SF900III和Express Five，購自 Life Technologies公司。細(xì)胞株SF9和High Five購自ATCCt3HISF細(xì)胞由本實(shí)驗室構(gòu)建。在 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗中，細(xì)胞密度通過血球計數(shù)板計數(shù)，細(xì)胞活性通過臺盼藍(lán)染色法確定。
[0030]實(shí)施例1:本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基的配制 (1)稱量 按照表1、表2、表3準(zhǔn)確稱取原料： 表1氨基酸
表3無機(jī)鹽
表4所列成分稱取完畢后，用ImL乙醇將上述成分溶解，然后再加熱(45-50Γ)的條件下 緩慢滴加9mL水，使之緩慢形成乳化物，使用前加入培養(yǎng)基。
[0031]表5其它成分
(2)溶解 將原料(表1，表2，表3，表5)放到一個大的燒杯中，取800mL超純水放到燒杯里，攪拌直 至溶解完全，將表4配制出的溶液加入燒杯中，用IOM的氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.3，添加 超純水使總體積達(dá)到l〇〇〇mL。
[0032]實(shí)施例2:本發(fā)明培養(yǎng)基與進(jìn)口同類產(chǎn)品培養(yǎng)效果比較 按照常規(guī)方法，用自制的NB-SFM培養(yǎng)基與SF900 III培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)SF9細(xì)胞，對比培 養(yǎng)效果(附圖1)。從圖1可看出，在同樣的培養(yǎng)時間內(nèi)，兩種培養(yǎng)基SF9活細(xì)胞密度一致，沒有 明顯差異。
[0033]同樣按照常規(guī)方法，用自制的NB-SFM培養(yǎng)基與商業(yè)化培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)High Five 細(xì)胞，對比培養(yǎng)效果(附圖2)。從圖2可看出，在同樣的培養(yǎng)時間內(nèi)，兩種培養(yǎng)基High Five活 細(xì)胞密度一致，沒有明顯差異。
[0034] 實(shí)施例3:自制培養(yǎng)基和商業(yè)化培養(yǎng)基培養(yǎng)感染后的昆蟲細(xì)胞 按照常規(guī)方法，利用自制培養(yǎng)基和商業(yè)化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)桿狀病毒感染后的 胞96h后，測定病毒滴度，比較兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果(表6)。由表6可知，自制無血清培養(yǎng)基 病毒滴度明顯高于商業(yè)化培養(yǎng)基。
[0035] 表6桿狀病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)96h后病毒滴度的比較
實(shí)施例4:自制培養(yǎng)基和商業(yè)化培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)流感血凝素蛋白比較 按照常規(guī)方法，利用自制培養(yǎng)基和商業(yè)化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)流感血凝素表達(dá)蛋白 細(xì)胞，收集蛋白后測定并比較血凝滴度。根據(jù)血凝滴度確定兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)效果(表7)。由 表7可知，自制無血清培養(yǎng)基血凝滴度明顯高于商業(yè)化培養(yǎng)基。
[0036] 表7流感病毒血凝素蛋白表達(dá)的比較
雖然上面的舉例了一些特定實(shí)施例來說明和描述本發(fā)明，但并不意味著本發(fā)明僅局限 于其中的各種細(xì)節(jié)。相反地，在等價于權(quán)利要求書的范疇和范圍內(nèi)可以不偏離本發(fā)明精神 地在各種細(xì)節(jié)上做出各種修改。
【主權(quán)項】
1. 一種用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述的無血清培養(yǎng)基包含 5-10g/L碳水化合物、l-5g/L氨基酸、5-10g/L無機(jī)鹽、0.01~0.05g/L維生素、5~10g/L酵母提 取物以及10_20ml/L的脂質(zhì)乳化劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所用的 氨基酸可包括150_250mg/L天冬氨酸、20_50mg/L蘇氨酸、40_80mg/L絲氨酸、200_300mg谷氨 酸、40_80mg/L 甘氨酸、50-100mg/L 繳氨酸、100_200mg/L 蛋氨酸、100_200mg/L 異亮氨酸、30-50mg/L 亮氨酸、100-200mg 苯丙氨酸、80_140mg/L 賴氨酸、20_50mg/L 組氨酸、100-150mg/L 精 氨酸、50-100mg/L 脯氨酸、180-300mg/L 天冬酰胺、1000-1200mg/L 谷氨酰胺、10-30mg/L 半胱 氨酸及30-80mg/L酪氨酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所用維 生素包括〇· 1_〇 · 3mg/L生物素、5-10mg/L泛酸、10_15mg/L煙酸、0 · 1-0 · 5mg/L對氨基苯甲酸、 0 · 5-0 · 8mg/L維生素 Bl、l-3mg/L維生素 B6、0 · 2-0 · 5mg/L維生素 B12、Umg/l核黃素、0 · ΙΟ · 4mg/L葉酸、 15-20mg/L 氯化膽堿。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所用無 機(jī)鹽可包括 200-800π^/1 氯化鈣、800-1200mg/L 硫酸鎂、500-800mg/L 氯化鉀、400-1000mg/L 碳酸氫鈉、1500-3000mg/L氯化鈉、800-1200π^/1磷酸二氫鈉;含于1000X濃縮液的0.005-0 · 015mg/L六水合氯化鈷、0 · 01-0 · 05mg/L二水合氯化銅、0 · 001-0 · 0 lmg/1四水合氯化錳、 0 · 05-0.20mg/L氯化鋅、0· 1-0.2mg/L七水合硫酸亞鐵、0· 001-0.01mg/L七水合鉬酸銨。5. 如權(quán)利要求1-4所述的用于昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基在懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞 中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/07GK105861415SQ201610225157
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】楊春江, 趙榮茂, 馬孝斌, 秦堃, 莫勛, 吳迪
【申請人】北京瑞鷹生物技術(shù)有限公司