重組漢遜酵母發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供重組漢遜酵母發(fā)酵工藝，該工藝包括發(fā)酵培養(yǎng)、補料發(fā)酵和外源基因的誘導(dǎo)表達階段。本發(fā)明采用特殊的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)重組漢遜酵母，發(fā)酵24小時左右濕菌重達到120g/L?150g/L；然后采用補料(葡萄糖)使?jié)h遜酵母密度進一步增加至濕菌重220g/L?230g/L；誘導(dǎo)階段，采用特殊配方混合誘導(dǎo)劑(葡萄糖和甲醇不同比例、鹽混合溶液和甲醇)進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。本發(fā)明提供的特殊基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基和特殊混合誘導(dǎo)劑及流加方法，能夠促進漢遜酵母生長，使發(fā)酵罐的菌體密度增加，提高誘導(dǎo)效率，減少死細胞比例。本發(fā)明提供的重組漢遜酵母發(fā)酵工藝，在原有基礎(chǔ)上大大提高了植酸酶的產(chǎn)量，在3L的發(fā)酵液中，植酸酶的酶活高達2368U/mL左右。在飼料酶制劑的研發(fā)及實際生產(chǎn)中，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
重組漢遜酵母發(fā)酵工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說，涉及重組漢遜酵母發(fā)酵工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 植酸(Phytate，Phytic，IP6)又稱為肌醇六磷酸脂，含有6個磷酸基團，是飼料中磷 的重要貯存形式。植酸的分子式是C 6H18O24P6，分子量是660.09。植酸酶(Phytase)能夠催化 植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽）。
[0003] 植酸主要以植酸鈣鎂鉀鹽的形式廣泛存在于植物種子內(nèi)，也存在于動物有核紅細 胞內(nèi)，在土壤、植物以及微生物分泌到胞外的酶中都發(fā)現(xiàn)有植酸酶的存在。因此，植酸酶對 于自然環(huán)境中磷的代謝循環(huán)有著重要的作用。另外，植酸對絕大多數(shù)金屬離子都有極強絡(luò) 合能力，絡(luò)合力與EDTA相似。通常情況下，植酸中的磷酸酯鍵是非常穩(wěn)定的，對于植酸的降 解一般有兩種方法，一是化學(xué)方法，但利用化學(xué)方法來降解植酸是極其困難的；另外一種方 法是酶解法，目前已知的能夠有效降解植酸的酶只有植酸酶。
[0004] 單胃動物體內(nèi)缺乏分解植酸的植酸酶，以植酸形式存在的磷很難被動物吸收利用 而帶來以下幾個問題:第一，植酸在飼料中存在具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，植酸磷本身難于被豬禽和 水產(chǎn)動物自身的消化道水解利用;植酸在動物胃腸道的消化過程中會與多種金屬離子和蛋 白質(zhì)結(jié)合，形成不溶性的復(fù)合物，使一些消化酶的作用受到抑制，使得飼料中的礦物元素和 其他營養(yǎng)物質(zhì)的消化率大大降低。第二，為了滿足動物對磷的需要，必須在飼料中添加無機 磷酸鹽。這樣不僅大大增加了飼料生產(chǎn)的成本，而且大量不被動物利用的磷直接排出體外， 造成磷源的浪費及嚴(yán)重的環(huán)境問題。因此，飼料中添加植酸酶，不僅可以提高動物對飼料中 植酸磷的利用率，減少磷對環(huán)境的污染，還可以降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。
[0005] 通過基因工程手段使植酸酶基因在重組菌株中高效表達是植酸酶得以大規(guī)模廉 價生產(chǎn)的有效途徑。目前，植酸酶的生產(chǎn)主要依靠真菌、細菌的微生物發(fā)酵。它們生產(chǎn)的組 氨酸酸性磷酸酶類(HAP)植酸酶，因其最適pH偏酸和比活高等特點，可以顯著的提高雞和豬 的生長性能。多形漢遜酵母(Hansenula Polymorpha)簡稱漢遜酵母，是當(dāng)前公認的最為理 想的外源基因表達系統(tǒng)之一。多形漢遜酵母作為單細胞真核微生物，既具備原核生物生長 快速、易于遺傳操作等特點，又有真核細胞翻譯后加工和修飾等功能。此外，漢遜酵母還具 備安全性好、易于培養(yǎng)、成本低廉、表達量高及遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢，并且能夠克服諸如釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)菌株不穩(wěn)定、產(chǎn)量低及糖基化側(cè)鏈過長以及畢赤酵母 (Pichia Pastoris)外源基因整合拷貝數(shù)較低的問題。目前，應(yīng)用漢遜酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)的 藥物(如胰島素，商品名Wosul in)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市銷售。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供重組漢遜酵母發(fā)酵工藝。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的重組漢遜酵母發(fā)酵工藝，包括發(fā)酵培養(yǎng)、補料 發(fā)酵和外源基因的誘導(dǎo)表達階段。
[0008] 發(fā)酵階段使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：磷酸二氫銨12.5-14.5g/L，七水合硫酸鎂 2 · 5-3 · 5g/L，氯化鉀2 · 5-3 · 7g/L，氯化鈉0 · 25-0 · 45g/L，甘油 15 · 0-30 · Og/L，乙二胺四乙酸 二鈉50 · 0-70 · Omg/L，六水合硫酸亞鐵銨50 · 0-70 · Omg/L，五水合硫酸銅3 · 0-6 · Omg/L，七水 合硫酸鋅15 · 0-25 · Omg/L，一水合硫酸錳25 · 0-28 · Omg/L，二水合氯化鈣0 · 8-1 · 5g/L，異丙醇 30 · 0-35 · 0mg/L，D-生物素 0 · 3-0 · 5mg/L，硫胺素 120 · 0-140 · 0mg/L，六水合硫酸鎳 0· 50-0 · 80mg/L，六水合氯化鈷 0 · 55-0 · 80mg/L，硼酸 0 · 55-0 · 70mg/L，碘化鉀 0 · 6-0 · 70mg/L 和二水 鉬酸鈉0.60-0.80mg/L。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：磷酸二氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂 3 · 2g/L，氯化鉀3 · 5g/L，氯化鈉0 · 35g/L，甘油22g/L，乙二胺四乙酸二鈉70 · 0mg/L，六水合硫 酸亞鐵銨70 · 0mg/L，五水合硫酸銅6 · 0mg/L，七水合硫酸鋅22 · 0mg/L，一水合硫酸猛27 · Omg/ L，二水合氯化|丐1 · 2g/L，異丙醇34 · 0mg/L，D-生物素0 · 5mg/L，硫胺素135 · 0mg/L，六水合硫 酸鎳0.70mg/L，六水合氯化鈷0.70mg/L，硼酸0.70mg/L，碘化鉀0.70mg/L和二水鉬酸鈉 0.70mg/L。培養(yǎng)溫度控制在30°C±2°C，從發(fā)酵起始24小時內(nèi)用氨水控制發(fā)酵液的pH值在 4 · 2 ± 0 · 5，直至發(fā)酵液中濕菌重達到120g/L-l 50g/L。
[0009] 補料發(fā)酵階段流加質(zhì)量百分濃度45-75%的葡萄糖溶液，補料4-5小時，直至發(fā)酵 液中濕菌重達到220g/L-230g/L。
[0010] 誘導(dǎo)表達階段采用不同濃度梯度的混合誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，溫度控制在35°C± 2°C，用氨水控制發(fā)酵液的pH值在3.8 ± 0.5，誘導(dǎo)60-96小時結(jié)束發(fā)酵;其中，從加入混合誘 導(dǎo)劑開始，第一個12小時按15mL/h的流速流加質(zhì)量百分濃度50%的葡萄糖溶液和甲醇按8: 1體積比的混合液，第二個12小時流加質(zhì)量百分濃度50 %的葡萄糖溶液和甲醇按4:1體積比 的混合液，第三個12小時流加質(zhì)量百分濃度50%的葡萄糖溶液和甲醇按1:1體積比的混合 液，第四個12小時流加質(zhì)量百分濃度50%的葡萄糖溶液和甲醇按1:4體積比的混合液，第五 個12小時至發(fā)酵結(jié)束流加鹽溶液和甲醇按1:4體積比的混合液。其中，鹽溶液配方為:磷酸 二氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂3.2g/L，氯化鉀3.5g/L，氯化鈉0.35g/L和葡萄糖22g/L。從第 二個12小時流加開始，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量以及混合液流速，控制溶氧在20%以上，當(dāng) 溶氧升至60 %時，將混合液流速加大20 %，如不能保持溶氧在20 %以上，則停止混合液流 加，直至溶氧回升。
[0011]對于3L的發(fā)酵培養(yǎng)基，在整個誘導(dǎo)表達階段，將甲醇濃度控制在5g/L以下；對于 50L的發(fā)酵培養(yǎng)基，在整個誘導(dǎo)表達階段，將甲醇濃度控制在10g/L以下。
[0012] 前述的工藝，在整個誘導(dǎo)表達階段，控制發(fā)酵液的溶氧在20%-60%。
[0013] 前述的工藝，發(fā)酵過程中如果發(fā)酵罐出現(xiàn)泡沫，添加終濃度10%的陶氏聚醚多元 醇消泡劑進行消泡。
[0014] 前述的工藝，優(yōu)選補料發(fā)酵階段流加質(zhì)量百分濃度50%的葡萄糖溶液，流速為IL/ 小時，流加5h。
[0015] 本發(fā)明的重組漢遜酵母發(fā)酵工藝適用于MOX或FMD啟動子(優(yōu)選MOX啟動子）啟動外 源基因表達的重組漢遜酵母。所述外源基因包括但不限于植酸酶基因。
[0016] 前述工藝還包括制備發(fā)酵種子液的步驟，種子液制備方法如下：從-70°C取出重組 漢遜酵母菌種，甘油的終濃度為17%，融化后按2%的體積比接種至5mL YH)培養(yǎng)基中，于30 °C200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時至OD6QQnm=S~15;然后取5mL轉(zhuǎn)接至200mL BMGY培養(yǎng)基中，于 30°C200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時至OD6QOnm= 15~25,即得發(fā)酵種子液。
[0017] 前述的工藝，將200mL種子液接種到裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵 培養(yǎng)，發(fā)酵階段控制溶氧大于20%。
[0018] 本發(fā)明還提供用于重組漢遜酵母發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的 配方如下:磷酸二氫銨12.5-14.5g/L，七水合硫酸鎂2.5-3.5g/L，氯化鉀2.5-3.7g/L，氯化 鈉0 · 25-0 · 45g/L，甘油15 · 0-30 · Og/L，乙二胺四乙酸二鈉50 · 0-70 · Omg/L，六水合硫酸亞鐵 銨50 · 0-70 · Omg/L，五水合硫酸銅3 · 0-6 · Omg/L，七水合硫酸鋅15 · 0-25 · Omg/L，一水合硫酸 錳 25 · 0-28 · 0mg/L，二水合氯化鈣 0 · 8-1 · 5g/L，異丙醇 30 · 0-35 · 0mg/L，D-生物素 0 · 3-0 · 5mg/ L，硫胺素 120 · 0-140 · 0mg/L，六水合硫酸鎳0 · 50-0 · 80mg/L，六水合氯化鈷0 · 55-0 · 80mg/L， 硼酸 〇 · 55-0 · 70mg/L，碘化鉀0 · 6-0 · 70mg/L 和二水鉬酸鈉 0 · 60-0 · 80mg/L。
[0019] 優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的配方如下:磷酸二氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂3.2g/ L，氯化鉀3.5g/L，氯化鈉0.35g/L，甘油22g/L，乙二胺四乙酸二鈉70.0mg/L，六水合硫酸亞 鐵銨70 · 0mg/L，五水合硫酸銅6 · 0mg/L，七水合硫酸鋅22 · 0mg/L，一水合硫酸錳27 · 0mg/L，二 水合氯化媽1.2g/L，異丙醇34.0mg/L，D-生物素0.5mg/L，硫胺素135.0mg/L，六水合硫酸鎳 0 · 70mg/L，六水合氯化鈷0 · 70mg/L，硼酸0 · 70mg/L，碘化鉀0 · 70mg/L和二水鉬酸鈉0 · 70mg/ L0
[0020] 本發(fā)明采用的漢遜酵母表達系統(tǒng)常用于蛋白藥物及疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)中，其表達 載體為整合型質(zhì)粒，即含有外源基因的質(zhì)?？烧现两湍富蚪M中，在甲醇誘導(dǎo)啟動子 (MOX)的作用下，外源基因得以表達。在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，使用的分泌型表達 載體含有分泌信號序列，其表達的信號肽是釀酒酵母α交配因子前導(dǎo)肽(α-MF)，可將胞內(nèi)表 達的植酸酶分泌到胞外。漢遜酵母一般先在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng) 至較高濃度時，添加純甲醇繼續(xù)誘導(dǎo)生長，在后續(xù)誘導(dǎo)表達過程中，甲醇既作為碳源也作為 誘導(dǎo)劑，促進目的蛋白的表達。該方法可大大提高外源蛋白的表達產(chǎn)量，其表達量可達到克 級。然而，在傳統(tǒng)誘導(dǎo)工藝中，只是單純的加入甲醇進行后期的培養(yǎng)和誘導(dǎo)，重組漢遜酵母 長期(培養(yǎng)周期約為7天)高密度培養(yǎng)，容易導(dǎo)致后期營養(yǎng)成分降低，營養(yǎng)成分缺乏制約了重 組漢遜酵母的生長，導(dǎo)致收獲菌體密度低，降低了目的蛋白的產(chǎn)量。本發(fā)明提供一種特殊的 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基和特殊混合誘導(dǎo)劑和流加方法，能夠促進漢遜酵母生長，使發(fā)酵罐的菌體密 度增加，提高誘導(dǎo)效率，減少死細胞比例。本發(fā)明提供的重組漢遜酵母發(fā)酵工藝，在原有基 礎(chǔ)上大大提高了植酸酶的產(chǎn)量，在3L的發(fā)酵液中，植酸酶的酶活高達2368U/mL左右。在飼料 酶制劑的研發(fā)及實際生產(chǎn)中，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為本發(fā)明實施例1中質(zhì)粒pMOXH-PHY的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明實施例3中重組植酸酶的最適pH測定結(jié)果。
[0023] 圖3為本發(fā)明實施例3中植酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0025] 實施例1重組植酸酶表達系統(tǒng)一重組漢遜酵母的構(gòu)建
[0026]本實施例中使用分泌型表達載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建過程如下：
[0027] (1)構(gòu)建攜帶Kan抗性基因表達盒及ColEl復(fù)制子區(qū)的骨架載體pKO
[0028]以pPIC3.5k質(zhì)粒（Invitrogen公司）為模板，以兩條引物擴增獲得大小為890bp的 CoIEI復(fù)制子區(qū)，同時在上游引入BgIII酶切位點，下游引入KpnI酶切位點；以pPIC3.5k質(zhì)粒 (Invitrogen公司）為模板，以引物擴增獲得大小1220bp的Kan抗性基因表達盒，同時在上游 弓丨入BglII酶切位點，下游引入KpnI酶切位點，該Kan抗性基因在大腸桿菌中表現(xiàn)抗卡那霉 素抗性，在酵母中表現(xiàn)抗G418抗性，通過Bg11 +Kpn I雙酶切將Kan抗性基因表達盒及Co IEI復(fù) 制子區(qū)進行連接，構(gòu)建骨架載體pKO。
[0029] (2)Zeocin抗性表達盒的PCR擴增及重組載體pKO-Zeo構(gòu)建
[0030]以PPICZaA質(zhì)粒（Invitrogen公司）為模板，以引物擴增獲得大小為1220bp的 Zeocin抗性基因。引入Bglll+BamHI酶切位點，與BglII單酶切并去磷酸化后的pKO載體進行 連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pKO-Zeo。
[0031 ] (3)HARS1片段的PCR擴增及重組載體pMOXl .0的構(gòu)建
[0032]以漢遜酵母菌株的混合基因組DNA為模板，以引物擴增獲得大小為550bp的HARSl 的片段，同時引入EcoRI+PstI雙酶切位點，將HARSl片段克隆加入pKO-Zeo載體中，構(gòu)建重組 載體 pMOXHl.O。
[0033] (4)18S rDNA序列的PCR擴增及重組載體pM0XH2.0構(gòu)建
[0034]以漢遜酵母菌株的混合基因組DNA為模板，以引物擴增獲得大小2.5kb的18S rDNA 序列，同時引入Ndel+EcoRI酶切位點，通過Ndel+EcoRI酶切，將18S rDNA片段克隆入 pMOXHl. 0，構(gòu)建重組載體pM0XH2.0。
[0035] (5)M0X啟動子及MOX終止子的PCR擴增
[0036]以漢遜酵母菌株的混合基因組DNA為模板，以引物擴增獲得大小為1520bp的MOX啟 動子，同時在上游引入Not頂每切位點；以漢遜酵母菌株的混合基因組DNA為模板，以引物擴 增獲得大小為320bp的MOX終止子，在下游引入Bgl Π 酶切位點。
[0037] (6)產(chǎn)生攜帶植酸酶基因核苷酸序列的表達載體構(gòu)建
[0038]以攜帶植酸酶基因重組質(zhì)粒為模板，以引物擴增獲得大小為1233的植酸酶基因， 以PPICZaA質(zhì)粒（Invitrogen公司）為模板，以引物擴增獲得大小為266bp的α-MF，同時在上 游引入MOX啟動子區(qū)，在下游引入MOX終止子區(qū)。
[0039]構(gòu)建成功的含植酸酶基因的質(zhì)粒pMOXH-PHY(圖1.)利用電轉(zhuǎn)化方式，整合到漢遜 酵母基因組里，構(gòu)建得到的表達植酸酶的重組漢遜酵母，在甲醇誘導(dǎo)啟動子MOX的作用下， 外源基因得以表達。該載體含有分泌信號序列，其表達的信號肽是釀酒酵母a交配因子前導(dǎo) 肽(a-MF)，可將胞內(nèi)表達的植酸酶分泌到胞外。
[0040] 實施例2重組漢遜酵母發(fā)酵工藝
[0041 ] 1、制備種子液
[0042]從_70°C冰箱的工作種子庫中取出一支2mL實施例1制備的生產(chǎn)菌種，甘油的終濃 度是17%。融化后按2%體積比接種至5mL YH)培養(yǎng)基中，于30°C200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時 至0D6QQnm = 8~15,檢定合格后接種到200mL BMGY培養(yǎng)基中，每瓶接種量為5mL，于30°C 200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時至OD??= 15~25,檢定合格后作為發(fā)酵種子液待用。
[0043] 2、發(fā)酵罐發(fā)酵
[0044]將種子液進行如下發(fā)酵：
[0045] (1)配制3L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，在7.5L自動控制發(fā)酵罐中滅菌，冷卻至30°C?；A(chǔ)鹽培 養(yǎng)基的配方如下:磷酸二氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂3.2g/L，氯化鉀3.5g/L，氯化鈉0.35g/ L，甘油22g/L，乙二胺四乙酸二鈉70 · Omg/L，六水合硫酸亞鐵銨70 · Omg/L，五水合硫酸銅 6 · Omg/L，七水合硫酸鋅22 · Omg/L，一水合硫酸猛27 · Omg/L，二水合氯化媽1 · 2g/L，異丙醇 34.0mg/L，D-生物素0 · 5mg/L，硫胺素135 · 0mg/L，六水合硫酸鎳0 · 70mg/L，六水合氯化鈷 0 · 70mg/L，硼酸 0 · 70mg/L，碘化鉀 0 · 70mg/L，二水鉬酸鈉 0 · 70mg/L。
[0046] (2)用氨水或磷酸（用純化水稀釋磷酸到300g/L)調(diào)發(fā)酵液pH值到4.2,將200mL二 級種子液接種到裝有3L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，進行階段培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣 流量控制溶氧大于20%。
[0047] (3)在前24小時內(nèi)，用氨水控制發(fā)酵液的pH值在4.2左右，基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中甘油消 耗完全(溶氧標(biāo)記為100%)后(接入種子液后約24h)，進入流加葡萄糖階段(流加質(zhì)量百分 濃度50%的葡萄糖水溶液），流速為IL/h，流加5h。
[0048] (4)發(fā)酵過程中如發(fā)酵罐有泡沫，添加終濃度10 %的陶氏聚醚多元醇消泡劑進行 消泡。
[0049] (5)待葡萄糖消耗完全(溶氧為100%)，濕菌重達到220g/L-230g/L時，進入葡萄糖 與甲醇混合誘導(dǎo)劑流加階段，誘導(dǎo)階段控制PH為3.8。
[0050] (6)從加入混合誘導(dǎo)劑開始，第一個12小時按15mL/h的流速流加質(zhì)量百分濃度 50 %的葡萄糖溶液和甲醇按8:1體積比的混合液，第二個12小時流加質(zhì)量百分濃度50 %的 葡萄糖溶液和甲醇按4:1體積比的混合液，第三個12小時流加質(zhì)量百分濃度50 %的葡萄糖 溶液和甲醇按1:1體積比的混合液，第四個12小時流加質(zhì)量百分濃度50%的葡萄糖溶液和 甲醇按1:4體積比的混合液，第五個12小時至發(fā)酵結(jié)束流加鹽溶液和甲醇按1:4體積比的混 合液。其中，鹽溶液配方為:磷酸二氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂3.2g/L，氯化鉀3.5g/L，氯化 鈉0 · 35g/L和葡萄糖22g/L。
[0051 ]從第二個12小時流加開始，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量以及混合液流速，控制溶氧在 20%以上，當(dāng)溶氧升至60%時，將混合液流速加大20 %，如不能保持溶氧在20%以上，則停 止混合液流加，直至溶氧回升。此外，代謝產(chǎn)生有機酸，使發(fā)酵液pH降低，用氨水調(diào)節(jié)pH值， 菌體生長階段使pH維持在4.2左右，誘導(dǎo)階段控制pH在3.8左右。
[0052]只有當(dāng)維持葡萄糖在低水平時，甲醇才能使MOX或FMD啟動子加快重組基因的表 達。當(dāng)細胞密度達到理想濃度時，PH調(diào)到4.0以下，可以增加目的蛋白的產(chǎn)量。在誘導(dǎo)階段， 發(fā)酵液pH(pH值3.8左右)要低于生長階段的pH(pH值4.2左右）。溶氧電極的值(20%~60%) 控制著甲醇限速流加，自動流加的氨水控制pH值3.8左右。誘導(dǎo)時間可以超過50小時。
[0053] 3、根據(jù)溶氧控制甲醇的流加
[0054]利用漢遜酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶，可以利用溶氧反應(yīng)來判斷酵母對碳源的消耗情 況，當(dāng)碳源消耗完時，酵母生長受到抑制，耗氧速率降低，溶氧會上升，如果再加入碳源，由 于酵母利用碳源生長代謝會消耗大量氧，使溶氧下降，所以可以根據(jù)溶氧的變化控制漢遜 酵母發(fā)酵過程中碳源的流加。以葡萄糖為碳源時，由于高的葡萄糖濃度，不會對細胞產(chǎn)生毒 害，利用溶氧可以反應(yīng)發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗情況，第40h葡萄糖耗盡，溶氧迅速升到 90%，當(dāng)細胞濃度達到250mg/ml時，開始流加葡萄糖與甲醇混合誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)，剛開始流 加少量的甲醇，因為在最初誘導(dǎo)的12h內(nèi)，酵母還沒有完全適應(yīng)甲醇，這時的溶氧不穩(wěn)定，不 能反映甲醇的消耗情況，稍后漢遜酵母完全適應(yīng)甲醇，開始快速利用甲醇，把蠕動栗的栗速 調(diào)到15ml/h，根據(jù)溶氧的變化控制甲醇的流加，當(dāng)溶氧上升到45%時，將甲醇的流加速率增 大20%，使溶氧緩慢下降至30%左右，若溶氧低于20%，則適當(dāng)減小甲醇流速。
[0055]但利用溶氧控制甲醇流加不能有效控制發(fā)酵液中的甲醇濃度。在誘導(dǎo)發(fā)酵后期， 溶氧會高于60%，而甲醇濃度高于5g/L(3L的培養(yǎng)基），抑制酵母的生長，并對酵母生長產(chǎn)生 毒害，由于細胞生長受到抑制，目的蛋白增長速率也顯著下降，這時高的溶氧水平并不是因 為碳源的缺乏，反而卻是由于甲醇濃度過高造成的。所以，在甲醇流加過程中，如果某時刻 甲醇流加過量導(dǎo)致細胞生長受到抑制，則菌體耗氧速率下降，表面上溶氧會上升反倒會使 人以為是甲醇濃度較低造成的，從而增大甲醇流加速率，結(jié)果會使甲醇濃度越來越高。因 此，利用溶氧控制發(fā)酵過程中甲醇流加不是一種最有效的方法。因為利用溶氧控制甲醇流 加，不能保證甲醇濃度一直處于較低穩(wěn)定水平，高的甲醇濃度也能造成溶氧升高。在流加過 程中，甲醇濃度波動較大，影響目的蛋白的表達。也會造成每批發(fā)酵植酸酶產(chǎn)率差別較大， 不利于整個發(fā)酵工藝條件的穩(wěn)定操作。因此，在發(fā)酵過程中將甲醇濃度控制在穩(wěn)定范圍內(nèi)， 有利于植酸酶含量進一步提尚。
[0056]在整個誘導(dǎo)階段，甲醇濃度最好不要超過5g/L?？梢岳米兩岱止夤舛确y定 重組漢遜酵母發(fā)酵液中的甲醇含量。參考余波2006年寫的《變色酸分光光度法測定畢赤酵 母發(fā)酵液中的甲醇含量》。也可以利用在線實時檢測甲醇濃度的探頭。
[0057] 4、放罐和植酸酶的活性檢測
[0058] 發(fā)酵過程中，每隔24h取發(fā)酵液測定0D6QQnm以及菌體濕重，取上清液進行植酸酶活 性檢測。放罐離心及酶活檢測：誘導(dǎo)96小時后放罐，4°C條件下以5000rpm離心30min收集上 清液。
[0059] 按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 18634-2009》進行。植酸酶活性定義是指在 37"^!1值5.50的條件下，每分鐘從濃度為5.〇1]11]1〇1/14直酸鈉溶液中釋放]^1]1〇1無機磷，即為 一個植酸酶活性單位，以U表示。計算公式如下：
[0060]
[0061] X-試樣中植酸酶的活性，單位為酶活性單位每克(U/g)或酶活性單位單位每毫升 (U/mL);y-根據(jù)實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的無機磷的量，單位為微摩爾； t 一酶解反應(yīng)時間，單位為分鐘;η-試樣的稀釋倍數(shù);m-試樣的量，單位為克或毫升。
[0062] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作見表1:
[0063]表 1
L0005」取50yL稀釋酶液加底物4mmol/L植酸鈉950yL(用0· lmol/L ρΗ5·5的醋酸緩沖液配 制），37°C反應(yīng)30min，加 ImL 10 %TCA終止反應(yīng)，加2mL顯色液（IOg四水合鉬酸銨+32mL硫酸+ 73.2g硫酸亞鐵，加水定容至1L)，對反應(yīng)液進行顯色。對照則加酶液后先加 TCA混勻，再加底 物。顯色IOmin后，在700nm下測其OD值，計算酶活。發(fā)酵結(jié)束最終平均發(fā)酵植酸酶的酶活達 至lj2368U/mL。
[0066] 實施例3重組植酸酶的性質(zhì)測定
[0067] 1、重組植酸酶的最適pH測定方法如下：
[0068]將發(fā)酵液在不同pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。底物植酸鈉用不同pH的緩沖 液37 °C下進行植酸酶活力測定。結(jié)果表明，植酸酶的最適pH為6.0，在pH4.0~7.5條件下，該 酶具有較好的催化活性。（圖2)
[0069] 2、植酸酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下：
[0070] 植酸酶的最適溫度的測定為PH5.5緩沖液體系及不同溫度下進行酶促反應(yīng)。在不 同溫度的水浴鍋中加熱處理5分鐘后迅速放入冰水降溫。另設(shè)一個未加熱對照組。按常規(guī)方 法進行酶活測定，以未加熱處理樣品結(jié)果為100%，檢測各溫度熱處理5分鐘后剩余酶活，再 在37°C下進行酶活性測定。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果表明，其最適溫度為45°C。（圖3)
[0071] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 重組漢遜酵母發(fā)酵工藝，其特征在于，包括發(fā)酵培養(yǎng)、補料發(fā)酵和外源基因的誘導(dǎo)表 達階段； 發(fā)酵階段使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:磷酸二氫銨12.5-14.5g/L，七水合硫酸鎂2.5-3 · 5g/L，氯化鉀2 · 5-3 · 7g/L，氯化鈉0 · 25-0 · 45g/L，甘油 15 · 0-30 · Og/L，乙二胺四乙酸二鈉 50 · 0-70 · Omg/L，六水合硫酸亞鐵銨50 · 0-70 · Omg/L，五水合硫酸銅3 · 0-6 · Omg/L，七水合硫 酸鋅15.0-25 . Omg/L，一水合硫酸錳25.0-28 . Omg/L，二水合氯化鈣0.8-1.5g/L，異丙醇 30 · 0-35 · 0mg/L，D-生物素 0 · 3-0 · 5mg/L，硫胺素 120 · 0-140 · 0mg/L，六水合硫酸鎳 0· 50-0 · 80mg/L，六水合氯化鈷 0 · 55-0 · 80mg/L，硼酸 0 · 55-0 · 70mg/L，碘化鉀 0 · 6-0 · 70mg/L 和二水 鉬酸鈉0.60-0.80mg/L;培養(yǎng)溫度控制在30 °C ± 2°C，從發(fā)酵起始24小時內(nèi)用氨水控制發(fā)酵 液的pH值在4.2 ± 0.5，直至發(fā)酵液中濕菌重達到120g/L-l 50g/L; 補料發(fā)酵階段流加質(zhì)量百分濃度45-75%的葡萄糖溶液，補料4-5小時，直至發(fā)酵液中 濕菌重達到220g/L-230g/L; 誘導(dǎo)表達階段采用不同濃度梯度的混合誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，溫度控制在35°C±2°C， 用氨水控制發(fā)酵液的pH值在3.8 ± 0.5，誘導(dǎo)60-96小時結(jié)束發(fā)酵;其中，從加入混合誘導(dǎo)劑 開始，第一個12小時按15mL/h的流速流加質(zhì)量百分濃度50 %的葡萄糖溶液和甲醇按8:1體 積比的混合液，第二個12小時流加質(zhì)量百分濃度50 %的葡萄糖溶液和甲醇按4:1體積比的 混合液，第三個12小時流加質(zhì)量百分濃度50 %的葡萄糖溶液和甲醇按1:1體積比的混合液， 第四個12小時流加質(zhì)量百分濃度50%的葡萄糖溶液和甲醇按1:4體積比的混合液，第五個 12小時至發(fā)酵結(jié)束流加鹽溶液和甲醇按1:4體積比的混合液;其中鹽溶液的配方為:磷酸二 氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂3.2g/L，氯化鉀3.5g/L，氯化鈉0.35g/L和葡萄糖22g/L; 從第二個12小時流加開始，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、空氣流量以及混合液流速，控制溶氧在20% 以上，當(dāng)溶氧升至60%時，將混合液流速加大20%，如不能保持溶氧在20%以上，則停止混 合液流加，直至溶氧回升。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，發(fā)酵階段使用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：磷 酸二氫銨14.3g/L，七水合硫酸鎂3.2g/L，氯化鉀3.5g/L，氯化鈉0.35g/L，甘油22g/L，乙二 胺四乙酸二鈉70.0mg/L，六水合硫酸亞鐵銨70.0mg/L，五水合硫酸銅6.0mg/L，七水合硫酸 鋅22 · 0mg/L，一水合硫酸錳27 · 0mg/L，二水合氯化鈣1 · 2g/L，異丙醇34 · 0mg/L，D-生物素 0 · 5mg/L，硫胺素135 · 0mg/L，六水合硫酸鎳0 · 70mg/L，六水合氯化鈷0 · 70mg/L，硼酸0 · 70mg/ L，碘化鉀0 · 70mg/L和二水鉬酸鈉0 · 70mg/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工藝，其特征在于，對于3L的發(fā)酵培養(yǎng)基，在整個誘導(dǎo)表達 階段，將甲醇濃度控制在5g/L以下;對于50L的發(fā)酵培養(yǎng)基，在整個誘導(dǎo)表達階段，將甲醇濃 度控制在l〇g/L以下。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的工藝，其特征在于，在整個誘導(dǎo)表達階段，控制發(fā)酵 液的溶氧在20 %-60 %。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的工藝，其特征在于，補料發(fā)酵階段流加質(zhì)量百分濃度 50 %的葡萄糖溶液，流速為200mL/小時，流加3h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的工藝，其特征在于，所述工藝適用于M0X或FMD啟動子 啟動外源基因表達的重組漢遜酵母，優(yōu)選M0X啟動子。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的工藝，其特征在于，所述外源基因包括植酸酶基因。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的工藝，其特征在于，還包括制備發(fā)酵種子液的步驟， 種子液制備方法如下： 從-70°C取出重組漢遜酵母菌種，甘油的終濃度為17%，融化后按2%的體積比接種至 5mL YPD培養(yǎng)基中，于30°C200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時至0D_nm = 8~15;然后取5mL轉(zhuǎn)接至 200mL BMGY培養(yǎng)基中，于30°C200rpm搖床培養(yǎng)20-24小時至OD6QQnm=15~25,即得發(fā)酵種子 液。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其特征在于，將200mL種子液接種到裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基 的10L發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵階段控制溶氧大于20 %。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的工藝，其特征在于，還包括發(fā)酵過程中如果出現(xiàn)泡 沫，添加終濃度10%的陶氏聚醚多元醇消泡劑進行消泡的步驟。
【文檔編號】C12N9/16GK105861464SQ201610350057
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】謝飛, 李忠超, 黃承飛, 李亞奎, 劉嶺, 趙金標(biāo), 楊雯涵, 郭曉晶
【申請人】謝飛