一種禽流感病毒基因的pcr擴增引物組及應用該引物組進行擴增和測序的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種禽流感病毒基因的PCR擴增引物組及應用該引物組進行擴增和測序的方法，所述禽流感病毒基因的PCR擴增引物組包括SEQ ID No.1?16所示的引物對；所述PCR擴增引物組能夠擴增不同亞型禽流感病毒的基因，通用性強；所述的禽流感病毒基因的PCR擴增引物組用于禽流感病毒的基因測序，步驟中部分引物對的擴增條件相同，同一反應程序可以同時擴增多種基因片段；可快速獲得禽流感病毒的基因組全長序列，具有簡便，耗時少，節(jié)約成本等優(yōu)點。
【專利說明】
-種禽流感病毒基因的PCR擴増引物組及應用該引物組進行 擴増和測序的方法
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明設及分子生物學技術(shù)領域，具體設及一種禽流感病毒基因的PCR擴增引物 組及應用該引物組進行擴增和測序的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感是由A型流感病毒所引起，而且?guī)缀跛械囊吧凹茵B(yǎng)的禽類均可感染的 一種急性、敗血性傳染病。禽流感的幾次大規(guī)模流行，都對養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性的打擊和巨大 的經(jīng)濟損失。同時禽流感病毒還可W感染多種包括人在內(nèi)的哺乳動物，甚至有造成人死亡 的病例。禽流感病毒分為18種HA亞型、11種NA亞型，不同亞型間的基因片段經(jīng)常發(fā)生重組。 目前禽流感病毒基因的擴增引物的設計通常只針對個別亞型，難W對所有亞型及流感病毒 變異株做到通用，并且引物擴增的效率低，雜帶多，大大降低陽性克隆的轉(zhuǎn)化率。傳統(tǒng)的實 驗室進行基因克隆測序，是將DNA片段連接到載體中，再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細菌，然后篩選出陽 性克隆菌進行擴繁，擴繁后提取細菌質(zhì)粒DNA，再送往專業(yè)測序公司進行測序。此方法耗時、 成本高、效率低，不適合大批量的測序，并且運種方法難W發(fā)現(xiàn)混合病毒感染，容易得出錯 誤的全基因組序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種禽流感病毒基因的PCR擴增引 物組，該PCR擴增引物組能夠擴增不同亞型的禽流感病毒基因，通用性強。
[0004] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:一種禽流感病毒基因的PCR擴增引物 組，所述禽流感病毒基因的PCR擴增引物組包括SEQ ID No. 1-2所示的引物對、SEQ ID No.3-4所示的引物對、SEQ ID No.5-6所示的引物對、SEQ ID No.7-8所示的引物對、SEQ ID No.9-10所示的引物對、SEQ ID No. 11-12所示的引物對、SEQ ID No. 13-14所示的引物對和 SEQ ID No. 15-16所示的引物對中的至少一對。
[0005] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案：所述禽流感病毒基因的PCR擴增引物組包括SEQ ID No. 1-2所示的引物對、SEQ ID No.3-4所示的引物對、SEQ ID No.5-6所示的引物對、SEQ ID No.7-8所示的引物對、SEQ ID No.9-10所示的引物對、SEQ ID No. 11-12所示的引物對、 SEQ ID No. 13-14所示的引物對和SEQ ID No. 15-16所示的引物對，共8對引物對。
[0006] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案：
[0007] 引物對SEQ ID No. 1-2,用于擴增禽流感病毒的HA基因片段；
[000引引物對SEQ ID No.3-4,用于擴增禽流感病毒的NA基因片段；
[0009]引物對SEQ ID No.5-6,用于擴增禽流感病毒的PB2基因片段；
[0010]引物對沈Q ID No.7-8,用于擴增禽流感病毒的PBl基因片段；
[0011]引物對SEQ ID No.9-10,用于擴增禽流感病毒的PA基因片段；
[001^ 弓|物對沈Q ID No. 11-12,用于擴增禽流感病毒的NP基因片段；
[OOU]引物對沈Q ID No. 13-14,用于擴增禽流感病毒的M基因片段；
[0014] 引物對SEQ ID No. 15-16,用于擴增禽流感病毒的NS基因片段。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種應用該引物組進行擴增和測序的方法，將禽流 感病毒基因的PCR擴增引物組用于禽流感病毒的基因的擴增和測序，步驟中部分引物對的 擴增條件相同，同一反應程序可W同時擴增多種基因片段。
[0016] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:將上述的禽流感病毒基因的PCR擴增 引物組用于禽流感病毒的基因擴增和測序。
[0017] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，所述禽流感病毒的基因的擴增和測序包括如下步 驟：
[001 引 1)使用Prime Script-'K'One step RT-PCR Kit Ver2.0-步法RT-PCR試劑盒，利用 禽流感病毒基因的PCR擴增引物組中的引物對分別對病毒RNA進行目的基因片段的RT-PCR 擴增;然后將目的基因片段進行回收，測序；
[0019] 2)根據(jù)步驟1)中得到的目的基因片段的序列，在序列結(jié)果的下游400-500bp設計 中間反向測序引物，使用中間反向測序引物對目的基因片段5'端的測序信號模糊區(qū)域中的 序列進行測通；
[0020] 3)將步驟1)和步驟2)中得到的基因片段的序列利用生物軟件對各段序列重疊部 分的比對和拼接，將全部片段首尾相接，得到禽流感病毒的基因序列。
[0021] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案，所述步驟1)中：
[0022] 當引物對為SEQ ID No.l-2時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C變性30s、62°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降rC、72°C延伸2min，進行11個循環(huán)； 94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸2min，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保存；
[0023] 當引物對為SEQ ID No.3-4時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C 變性 3〇3、58°(：退火3〇3、72°(：延伸1.5111111，進行35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111后置41： 保存；
[0024] 當引物對為SEQ ID No.5-6時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C變性30s、62°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降rC、72°C延伸2.5min，進行11個循 環(huán);94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸2.5min，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存；
[0025] 當引物對為SEQ ID No.7-8時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C變性30s、68°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降rC、72°C延伸2.5min，進行15個循 環(huán);94°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸2.5min，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存；
[0026] 當引物對為SEQ ID No.9-10時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C 變性 3〇3、48°(：退火3〇3、72°(：延伸2.5111111，進行35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111后置41： 保存；
[0027] 當引物對為SEQ ID齡.11-12時，？0?擴增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇111111、94°(：預變性 3min、94°C 變性 30s、55°C 退火 30s、72°C 延伸 1.5min，進行 35 個循環(huán);72°C 延伸 IOmin 后置 4°C 保存；
[0028] 當引物對為SEQ ID齡.13-14時，？〇?擴增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄30111111、94°(：預變性 3min、94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸Imin，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存；
[0029] 當引物對為SEQ ID齡.15-16時，？0?擴增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇111111、94°(：預變性 3min、94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸Imin,進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0031] 1、本發(fā)明所述的禽流感病毒基因的PCR擴增引物組能夠擴增不同亞型禽流感病毒 的基因，通用性強。
[0032] 2、本發(fā)明將禽流感病毒基因的PCR擴增引物組用于禽流感病毒的基因擴增和測 序，步驟中部分引物對的擴增條件相同，可W采用同一反應程序同時擴增多種基因片段。
[0033] 3、本發(fā)明的禽流感病毒的基因測序過程采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的 克隆測序，并在已知基因片段序列結(jié)果的下游400-5(K)bp設計中間反向測序引物，對基因片 段5'端的測序信號模糊區(qū)域中的序列進行測通，該方法無需PCR產(chǎn)物連接、克隆、轉(zhuǎn)化W及 陽性克隆菌的篩選，省時、成本低、效率高，適合大批量的測序;并且運種方法可W通過觀察 信號峰是否出現(xiàn)套峰等異常情況判定擴增模版是否存在混合，從而排除混合病毒感染，得 出正確的基因序列。
[0034] 4、本發(fā)明將測得的基因序列相應拼接，可快速獲得禽流感病毒的基因全長序列， 具有簡便，耗時少，節(jié)約成本等優(yōu)點。
[0035] 5、本發(fā)明針對HA、PB2、PB1基因設計的Touch down PCR反應程序提高了擴增效率， 克服了流感病毒基因片段上下游保守區(qū)的長度不一，導致上下游引物長度差異較大，引物 對化值差異大，常規(guī)一步法RT-PCR難W有效擴增的技術(shù)缺陷。
【附圖說明】
[0036] 圖1為實施例1HA基因的測序峰圖；
[0037] 圖2為實施例2HA基因的測序峰圖；
[003引圖3為實施例3的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0039 ]下面，結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進一步描述：
[0040] 1) W接種禽流感病毒培養(yǎng)72小時后的SPF雞胚中收獲的雞胚尿囊液中提取的禽流 感病毒的RNA為模板，使用PrimeScript-@^e St邱RT-PCR Kit Ver2.0-步法RT-PCR試劑 盒，利用禽流感病毒基因的PCR擴增引物組中的引物對分別對病毒RNA進行目的基因片段的 RT-PCR擴增;擴增引物組的序列如表1所示;然后將目的基因片段進行回收，測序；
[0041] 表1禽流感病毒基因的PCR擴增引物組序列
[0042]
[0043]
[0044] 禽流感病毒基因的PCR擴增引物組在大量流感病毒全基因序列比對的基礎上總結(jié) 了兩端高度保守區(qū)及相對保守區(qū)的堿基序列，該引物能夠擴增不同亞型的禽流感病毒的全 基因組，通用性強；
[0045] 當引物對為SEQ ID No.l-2時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C變性30s，62°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降rC、72°C延伸2min，進行11個循環(huán)； 94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸2min，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保存；
[0046] 當引物對為SEQ ID No.3-4時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C 變性 3〇3、58°(：退火3〇3、72°(：延伸1.5111111，進行35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111后置41： 保存；
[0047] 引物對為沈Q ID齡.5-6時，？0?擴增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇111111、94°(：預變性3111111、 94°C變性30s、62°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降rC、72°C延伸2.5min，進行11個循環(huán);94 。(:變性30s、52°C退火30s、72°C延伸2.5min，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保存； [004引當引物對為SEQ ID No.7-8時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C變性30s、68°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降rC、72°C延伸2.5min，進行15個循 環(huán);94°C變性30s、54°C退火30s、72°C延伸2.5min，進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存；
[0049] 當引物對為SEQ ID No.9-10時，PCR擴增條件為：5(rC反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性 3min、94°C 變性 3〇3、48°(：退火3〇3、72°(：延伸2.5111111，進行35個循環(huán);72°(：延伸1〇111111后置41： 保存；
[00加]當引物對為SEQ ID齡.11-12時，？0?擴增條件為：50。(：反轉(zhuǎn)錄3〇111111、94。(：預變性 3min、94°C 變性 30s、55°C 退火 30s、72°C 延伸 1.5min，進行 35 個循環(huán);72°C 延伸 IOmin 后置 4°C 保存；
[0051] 當引物對為SEQ ID齡.13-14時，？0?擴增條件為：50。(：反轉(zhuǎn)錄3〇111111、94。(：預變性 3min、94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸Imin,進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存；
[0052] 當引物對為SEQ ID齡.15-16時，？0?擴增條件為：50。(：反轉(zhuǎn)錄3〇111111、94。(：預變性 3min、94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸Imin,進行35個循環(huán);72°C延伸IOmin后置4°C保 存。
[0053] 由于部分流感病毒基因片段上下游保守區(qū)的長度不一，導致個別上下游引物長度 差異較大，引物對Tm值差異大，常規(guī)一步法RT-PCR難W有效擴增;本發(fā)明針對HA、PB2、PB1基 因設計的Touch down PCR反應程序提高了擴增效率。其中，基因片段M和NS可在同一反應程 序中同時擴增；
[0054] 2)根據(jù)步驟1)中得到的基因片段的序列，在序列結(jié)果的下游400-5(K)bp設計中間 反向測序引物，使用中間反向測序引物對目的基因片段5'端的測序信號模糊區(qū)域中的序列 進行測通；
[0055] 3)將步驟1)和步驟2)中得到的基因片段的序列利用生物軟件對各段序列重疊部 分的比對和拼接，將全部片段首尾相接，得到禽流感病毒的基因序列。
[0056] 先使用擴增引物組進行目的基因的序列的擴增，然后在已經(jīng)測出的具有清晰信號 峰的序列下游400-500bp設計反向互補序列的中間反向測序引物，可W完成PCR產(chǎn)物直接測 序特有的60bp左右的5'端測序信號模糊區(qū)域中序列的測通，中間反向測序引物的設計原則 與正向設計相同；該方法無需PCR產(chǎn)物連接、克隆、轉(zhuǎn)化W及陽性克隆菌的篩選，省時、成本 低、效率高，適合大批量的測序，直接測通基因片段兩端的末端序列，有利于快速獲得禽流 感病毒的基因全長序列，具有簡便，耗時少，節(jié)約成本等優(yōu)點。
[0057] 運種方法還可W通過觀察信號峰是否出現(xiàn)套峰等異常情況判定擴增模版是否存 在混合，從而排除混合病毒感染，得出正確的全基因序列。
[005引具體實施例：
[0化9]實施例1
[0060]本實施例公開了朋N2亞型禽流感病毒疫苗株(SS株)的全基因擴增和測序過程，包 括：
[0061 ] 1) W接種朋N2亞型禽流感病毒疫苗株(SS株)培養(yǎng)72小時后的SPF雞胚中收獲的禽 流感病毒的RNA為模板，使用Prime Script-?i〇ne Step RT-PCR Kit Ver2.0-步法RT-PCR 試劑盒，利用禽流感病毒基因的PCR擴增引物組SEQ ID No. 1-16對病毒疫苗株(SS株)RNA進 行目的基因片段的RT-PCR擴增;然后將目的基因片段利用TIANGEN?超薄DNA產(chǎn)物純化 試劑盒進行純化后，通過瓊脂糖凝膠電泳回收;將回收產(chǎn)物用自動序列測序儀進行測序;其 中，HA基因的測序峰圖如圖1所示，信號峰沒有出現(xiàn)套峰雜峰，背景干凈，測序結(jié)果準確；
[0062] 2)根據(jù)步驟1)中得到的基因片段的序列，在序列結(jié)果的下游400-5(K)bp設計中間 反向測序引物，中間反向測序引物的序列如表2所示;使用中間反向測序引物對基因片段5' 端的測序信號模糊區(qū)域中的序列進行測通；
[0063] 表2 H9N2亞型禽流感病毒全基因組中間反向測序引物序列
[0064]
[0065] 3)將步驟I)和步驟2)中得到的基因片段的序列利用生物軟件對各段序列重疊部 分的比對和拼接，將全部片段首尾相接，得到禽流感病毒的基因序列。
[0066] H9N2亞型禽流感病毒的全基因測序結(jié)果如SEQ ID No. 17-24所示：
[0067] 目的片段HA的基因序列為沈Q ID No. 17;
[006引 目的片段NA的基因序列為沈Q ID No. 18;
[0069] 目的片段PB2的基因序列為沈Q ID No. 19;
[0070] 目的片段PBl的基因序列為沈Q ID No.20;
[0071] 目的片段PA的基因序列為沈Q ID No.21;
[0072] 目的片段NP的基因序列為沈Q ID No.22;
[0073] 目的片段M的基因序列為沈Q ID No.23;
[0074] 目的片段NS的基因序列為沈Q ID No.24。
[00巧]實施例2
[0076] 本實施例公開了冊Nl亞型禽流感病毒疫苗株(Re-6株)的全基因測序過程，包括：
[0077] 1) W接種冊Nl亞型禽流感病毒疫苗株(Re-6株)培養(yǎng)72小時后的SPF雞胚中收獲的 禽流感病毒的RNA為模板，使用Prime Script-KOne Step RT-PCR Kit Ver2.0-步法RT-PCR試劑盒，利用禽流感病毒基因的PCR擴增引物組SEQ ID No. 1-16對病毒疫苗株(Re-6株） RNA進行目的基因片段的RT-PCR擴增;然后將目的基因片段利用TIANG巨N?.超薄DNA產(chǎn)物 純化試劑盒進行純化后，通過瓊脂糖凝膠電泳回收;將回收產(chǎn)物用自動序列測序儀進行測 序;其中，HA基因的測序峰圖如圖2所示，信號峰沒有出現(xiàn)套峰雜峰，背景干凈，測序結(jié)果準 確；
[0078] 2)根據(jù)步驟1)中得到的基因片段的序列，在序列結(jié)果的下游400-5(K)bp設計中間 反向測序引物，中間反向測序引物的序列如表3所示;使用中間反向測序引物對基因片段5' 端的測序信號模糊區(qū)域中的序列進行測通；
[0079] 表3冊Nl亞型禽流感病毒全基因組中間反向測序引物序列
[0080]
[0081] 3)將步驟1)和步驟2)中得到的基因片段的序列利用生物軟件對各段序列重疊部 分的比對和拼接，將全部片段首尾相接，得到禽流感病毒的基因序列。
[0082] 冊Nl亞型禽流感病毒的全基因測序結(jié)果如SEQ ID No.25-32所示：
[0083] 目的片段HA的基因序列為沈Q ID No.25;
[0084] 目的片段NA的基因序列為沈Q ID No.26;
[00化]目的片段PB2的基因序列為沈Q ID No.27;
[0086] 目的片段PBl的基因序列為沈Q ID No.28;
[0087] 目的片段PA的基因序列為沈Q ID No.29;
[008引目的片段NP的基因序列為沈Q ID No.30;
[0089] 目的片段M的基因序列為沈Q ID No.31;
[0090] 目的片段NS的基因序列為沈Q ID No.32。
[0091] 實施例3
[0092] 本實施例用于說明通過觀察測序峰圖信號峰是否出現(xiàn)套峰等異常情況快速判斷 擴增模板是否存在混合病毒感染的情況，測序峰圖如圖3所示：當測序峰圖出現(xiàn)套峰情況 時，可判斷擴增模板出現(xiàn)有混合病毒感染，認為檢測的基因序列有誤，則不會采用其數(shù)據(jù)。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，大大縮短了對測序數(shù)據(jù)的準確性進行驗證的時間，提高檢測效率和精確 度。
[0093] 對于本領域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)W上描述的技術(shù)方案W及構(gòu)思，做出其它各 種相應的改變W及變形，而所有的運些改變W及變形都應該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種禽流感病毒基因的PCR擴增引物組，其特征在于:所述禽流感病毒基因的PCR擴 增引物組包括SEQ ID No. 1-2所示的引物對、SEQ ID No.3-4所示的引物對、SEQ ID No.5-6 所示的引物對、SEQ ID No. 7-8所示的引物對、SEQ ID No. 9-10所示的引物對、SEQ ID No. 11-12所示的引物對、SEQ ID No. 13-14所示的引物對和SEQ ID No. 15-16所示的引物對 中的至少一對。2. 如權(quán)利要求1所述禽流感病毒基因的PCR擴增引物組，其特征在于:所述禽流感病毒 基因的PCR擴增引物組包括SEQ ID No. 1-2所示的引物對、SEQ ID No.3-4所示的引物對、 SEQ ID No.5-6所示的引物對、SEQ ID No.7-8所示的引物對、SEQ ID No.9-10所示的引物 對、SEQ ID No. 11-12所示的引物對、SEQ ID No. 13-14所示的引物對和SEQ ID No. 15-16所 示的引物對，共8對引物對。3. 如權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒基因的PCR擴增引物組，其特征在于： 引物對SEQ ID No. 1-2,用于擴增禽流感病毒的HA基因片段； 引物對SEQ ID No.3-4,用于擴增禽流感病毒的NA基因片段； 引物對SEQ ID No.5-6,用于擴增禽流感病毒的PB2基因片段； 引物對SEQ ID No.7-8,用于擴增禽流感病毒的PB1基因片段； 引物對SEQ ID No.9-10,用于擴增禽流感病毒的PA基因片段； 引物對SEQ ID No. 11-12,用于擴增禽流感病毒的NP基因片段； 引物對SEQ ID No. 13-14,用于擴增禽流感病毒的Μ基因片段； 引物對SEQ ID No. 15-16,用于擴增禽流感病毒的NS基因片段。4. 一種應用引物組進行擴增和測序的方法，其特征在于:將如權(quán)利要求1所述的禽流感 病毒基因的PCR擴增引物組用于禽流感病毒的基因的擴增和測序。5. 如權(quán)利要求4所述的應用引物組進行擴增和測序的方法，其特征在于:所述禽流感病 毒的基因的擴增和測序包括如下步驟： 1) 使用PrimeScrip丨-"OneStep RT-PCR Kit Ver2.0-步法R T-PCR試劑盒，利用禽流 感病毒基因的PCR擴增引物組中的引物對分別對病毒RNA進行目的基因片段的RT-PCR擴增； 然后將目的基因片段進行回收，測序； 2) 根據(jù)步驟1)中得到的目的基因片段的序列，在序列結(jié)果的下游400-500bp設計中間 反向測序引物，使用中間反向測序引物對目的基因片段5'端的測序信號模糊區(qū)域中的序列 進行測通； 3) 將步驟1)和步驟2)中得到的基因片段的序列利用生物軟件對各段序列重疊部分的 比對和拼接，將全部片段首尾相接，得到禽流感病毒的基因序列。6. 如權(quán)利要求5所述的應用引物組進行擴增和測序的方法，其特征在于：所述步驟1) 中： 當引物對為SEQ ID如.1-2時，？0財廣增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇1^11、94°(：預變性31^11、94 。(:變性30s，62 °C退火30s，退火過程每個循環(huán)降1°C、72 °C延伸2min，進行11個循環(huán);94 °C變 性30s、52°C退火30s、72°C延伸2min，進行35個循環(huán);72°C延伸10min后置4°C保存； 當引物對為SEQ ID No. 3-4時，PCR擴增條件為：50°C反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性3min、94 。(:變性3〇8、58°(：退火3〇8、72°(：延伸1.51^11，進行35個循環(huán);72°(：延伸1〇1^11后置4°(：保存 ； 當引物對為SEQ ID如.5-6時，？0財廣增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇1^11、94°(：預變性31^11、94 。(:變性30s、62 °C退火30s，退火過程每個循環(huán)降1°C、72 °C延伸2.5min，進行11個循環(huán);94°C 變性30s、52°C退火30s、72°C延伸2.5min，進行35個循環(huán);72°C延伸lOmin后置4°C保存； 當引物對為SEQ ID如.7-8時，？0財廣增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇1^11、94°(：預變性31^11、94 。(:變性30s、68°C退火30s，退火過程每個循環(huán)降1°C、72°C延伸2.5min，進行15個循環(huán);94°C 變性30s、54°C退火30s、72°C延伸2.5min，進行35個循環(huán);72°C延伸lOmin后置4°C保存； 當引物對為SEQ ID No. 9-10時，PCR擴增條件為：50°C反轉(zhuǎn)錄30min、94°C預變性3min、 94°C變性30s、48°C退火 30s、72°c延伸2.5min，進行35個循環(huán)；72°C延伸lOmin后置4°C保存； 當引物對為SEQ ID如.11-12時，？0財廣增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇1^11、94°(：預變性31^11、 94°(：變性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸1.51^11，進行35個循環(huán) ；72°(：延伸1〇1^11后置4°(：保存； 當引物對為SEQ ID如.13-14時，？0財廣增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇1^11、94°(：預變性31^11、 94°(：變性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸11^11，進行35個循環(huán) ；72°(：延伸1〇1^11后置4°(：保存； 當引物對為SEQ ID如.15-16時，？0財廣增條件為：50°(：反轉(zhuǎn)錄3〇1^11、94°(：預變性31^11、 94°(：變性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸11^11，進行35個循環(huán) ；72°(：延伸1〇1^11后置4°(：保存。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861665SQ201610237108
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】劉郁夫, 陳瑞愛, 賴漢漳, 劉玉鵬, 羅琴芳
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司