Lrrk2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，涉及基因多態(tài)性檢測(cè)。包括引物、熒光探針和試劑；所述引物用于特異性擴(kuò)增包含LRRK2基因2385位點(diǎn)的DNA片段，其堿基序列如SEQ IDNO：1和SEQ IDNO：2；熒光探針用于識(shí)別LRRK2基因2385多態(tài)性，熒光探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。采用兩條標(biāo)記兩種不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸探針在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)指示兩種多態(tài)性的情況，其堿基序列如SEQ IDNO：3和SEQ IDNO：4；試劑包括MgCl2、熱啟動(dòng)Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP和PCR反應(yīng)緩沖液。
【專利說(shuō)明】
LRRK2基因 2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因多態(tài)性檢測(cè)，尤其是設(shè)及一種LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森病(PD)是除了阿爾茨海默病(AD) W外的第二常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病。在我 國(guó)65歲W上人群中的PD患病率為1.17%，與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家相似，運(yùn)一比例在75歲W上的人 群中上升到3%，因此帕金森病已成為我國(guó)現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一。
[0003] 帕金森病確診的平均年齡為70歲，但是其癥狀卻比臨床確診更早出現(xiàn)，因此尋找 早期帕金森病生物學(xué)標(biāo)志W(wǎng)及進(jìn)行基因診斷，對(duì)于其風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)W及后期預(yù)防極為重要。帕 金森病從確診到死亡一般會(huì)持續(xù)15年，有些可W活到20年甚至更久。目前關(guān)于它的發(fā)病原 因和確切的發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，但普遍認(rèn)為此病是由遺傳、環(huán)境和老化相互作用導(dǎo) 致的復(fù)雜性疾病。帕金森病的發(fā)病與遺傳基因的突變密切相關(guān)，研究通過(guò)對(duì)家族性帕金森 病病例的分析，在染色體上已發(fā)現(xiàn)至少有13個(gè)位點(diǎn)與家族性帕金森病相關(guān)。其中在中國(guó)人 群中LRRK2基因突變最為常見(jiàn)。
[0004] 到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將近50個(gè)不同的LRRK2基因突變，其中大多數(shù)是錯(cuò)義突變。 LR服2基因變異具有種族的特異性，例如在歐洲人群中研究最為普遍的G2019R突變，在1% ~4%的帕金森病病人中發(fā)現(xiàn)該基因突變，在葡萄牙人、猶太人和北非阿拉伯帕金森病病人 中，G2019R的突變概率分別占 6%、15%和40%(TanEK，ShenH，TanLC，etal.l'he G2019S LRRK2 mutation is uncommon in an Asian cohort of Parkinson^ s disease patients .Neurosci Let ,2005，384(3): 327-329)。但在中國(guó)人群中并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的突 變，而是發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)東亞人群的特異位點(diǎn)R1628P(rs33949390)、G2385R(rs34778348)會(huì)增 加患病風(fēng)險(xiǎn)，運(yùn)兩個(gè)突變?cè)趤喼夼两鹕∪巳褐姓嫉?~9% (相對(duì)于正常人的3%)，并且運(yùn) 兩個(gè)突變都增加了兩倍的風(fēng)險(xiǎn)(Wang X,Zhang X,Xue L,et al.The association between the LRRK2 R1628P variant and the risk of Parkinson's disease in Asian:a meta-analysis.Neurosci Lett.2016;623:22-27.)。有文獻(xiàn)報(bào)道（Di Fonzo A，Wu-Chou YH,Lu CS,et al.,A common missense variant in the LRRK2 gene,Gly2385Arg,associated with Parkinson's disease risk in Taiwan .Neurogenetics. 2006; 7(3): 133-8.)，中國(guó) 漢族人群G2385R攜帶者帕金森病患病風(fēng)險(xiǎn)增加3.9倍。
[000引 G2385R多態(tài)性與LR服2的WD40功能域有關(guān)，其機(jī)制可能是誘導(dǎo)WD40功能域上的N末 端豆違酷化從而促使神經(jīng)毒性的產(chǎn)生，觸發(fā)細(xì)胞調(diào)亡；同時(shí)，G2385R多態(tài)性使該結(jié)構(gòu)域的正 電荷大量增加，進(jìn)而影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)，加速了 LRRK2蛋白自身的聚集，促使 各種神經(jīng)纖維聚集體和包涵體的產(chǎn)生，從而干擾LR服2與其他蛋白質(zhì)間的相互作用。也有學(xué) 者認(rèn)為該位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致線粒體功能素亂從而導(dǎo)致帕金森病發(fā)病。
[0006]因此，臨床上對(duì)PD風(fēng)險(xiǎn)基因 LR服2的2385多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)受測(cè)者是否攜帶相 關(guān)基因型，可W協(xié)助醫(yī)生診斷帕金森病，W便更及時(shí)地指導(dǎo)用藥，大大減輕病人和家屬的負(fù) 擔(dān)。對(duì)帕金森風(fēng)險(xiǎn)基因進(jìn)行檢測(cè)有助于風(fēng)險(xiǎn)基因攜帶的受測(cè)者提早對(duì)帕金森病進(jìn)行預(yù)防和 治療，起到早檢測(cè)早預(yù)防的作用。
[0007] 目前應(yīng)用于帕金森相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因檢測(cè)的技術(shù)主要是聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片 段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法。該方法是根據(jù)LR服2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)的不同選擇了一種 限制性內(nèi)切酶，該種內(nèi)切酶只對(duì)其中的一種多態(tài)性具有切割的作用，而對(duì)另一種多態(tài)性不 會(huì)產(chǎn)生切割。運(yùn)種方法首先通過(guò)引物對(duì)LRRK2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后對(duì)PCR 產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，再把酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，根據(jù)所得到的片斷大 小來(lái)對(duì)LRRK2基因 G2385R多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析。該方法存在諸多的不足。首先，該方法依靠 限制性內(nèi)切酶的活性，在酶切過(guò)程中容易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果;其次，電泳的方法容 易造成致命的PCR產(chǎn)物污染，導(dǎo)致結(jié)果的誤判;再次，該方法費(fèi)時(shí)(約5~化），耗工，至少包括 PCR擴(kuò)增、酶切、電泳、凝膠成像分析四個(gè)步驟，需要大量人工操作，自動(dòng)化程度低，人為誤差 大。
[0008] 實(shí)時(shí)巧光PCR具有快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染的特點(diǎn)，已成為分子診斷實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器 平臺(tái)。目前，尚未見(jiàn)利用實(shí)時(shí)巧光PCR的方法來(lái)對(duì)LRRK2基因2385多態(tài)性進(jìn)行研究的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供能快速、準(zhǔn)確、高通量地對(duì)LRRK2基因 2385多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè) 的一種LRRK2基因 2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。
[0010]本發(fā)明包括引物、巧光探針和試劑；
[0011]所述引物用于特異性擴(kuò)增包含LR服2基因2385位點(diǎn)的DNA片段，其堿基序列如SEQ IDNO: 1和SEQ IDNO: 2所述，引物序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換；
[0012] 所述巧光探針用于識(shí)別LR服2基因 2385多態(tài)性，所述巧光探針5'端標(biāo)記巧光基團(tuán)， 3'端標(biāo)記澤滅基團(tuán)。采用兩條標(biāo)記兩種不同巧光基團(tuán)標(biāo)記的核酸探針在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí) 指示兩種多態(tài)性的情況，其堿基序列如SEQ IDN0:3和SEQ IDN0:4所述，探針序列可由其堿 基互補(bǔ)序列替換。
[0013] 兩種不同巧光基團(tuán)包括任意發(fā)射波長(zhǎng)不同的兩種巧光基團(tuán)（巧光基團(tuán)和澤滅基 團(tuán)）的組合。常用的巧光基團(tuán)包括但不局限于目前各種巧光標(biāo)記物，如ALEX-350、FAM、皿X、 VIC、TET、J0E、R0X、TEXAS 360、〔￥3、〔￥5、〔￥5.5等。常用的澤滅基團(tuán)包括但不局限于目前各 種澤滅劑、如DABCYL、B冊(cè)1、B冊(cè)2、B冊(cè)3、TAMRA、E化I陽(yáng)等。
[0014] 所述巧光探針包括但不局限于化qMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標(biāo)、改良分子 信標(biāo)、雙鏈巧光置換探針、LightCycler探針、雙環(huán)探針等中的至少一種。
[0015] 所述試劑包括:MgCb、熱啟動(dòng)hq 酶、UNG 酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、加 TP 和 PCR 反 應(yīng)緩沖液。
[0016] 所述MgCb的摩爾濃度可為1~5mmol/L，所述(141?、(1巧1\(161?、(1刊?的摩爾濃度均 可為50~400皿ol/L，加 TP的摩爾濃度可為10~1000皿ol/L。
[0017] 所述熱啟動(dòng)化q酶的單位可為1~抓/反應(yīng)，所述UNG酶的用量可為0.1~IU/反應(yīng)。
[0018] 與現(xiàn)有檢測(cè)方法及相關(guān)技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下突出優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)應(yīng)用實(shí)時(shí)巧光PCR技術(shù)結(jié)合巧光探針，可W實(shí)時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)檢測(cè)更加 快速(90min)，操作更加簡(jiǎn)便，易于自動(dòng)化，且沒(méi)有PCR產(chǎn)物污染的顧慮，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確 性。
[0020] (2)在一個(gè)反應(yīng)管中就可W對(duì)LRRK2基因2385多態(tài)性進(jìn)行分析，節(jié)省成本的同時(shí)又 提高了通量。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為L(zhǎng)RRK2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)(rs34778348)c.7153堿基為G/G的DNA樣本。
[0022] 圖2為L(zhǎng)RRK2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)(rs34778348)c.7153堿基為G/A的DNA樣本。
[0023] 圖3為L(zhǎng)RRK2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)(rs34778348)c.7153堿基為A/A的DNA樣本。
[0024] 圖4為反應(yīng)檢測(cè)純水樣本作為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0025] W下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，下列實(shí)施例只是說(shuō)明而不表示 本發(fā)明所有的可能性，本發(fā)明并不局限于運(yùn)些實(shí)施例中提到的材料、反應(yīng)條件或者參數(shù)，任 何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員，都可W按照本發(fā)明的原理，利用其它類似材料或反應(yīng) 條件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所描述的LRRK2基因 G2385R多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。
[00%] 實(shí)施例1實(shí)時(shí)巧光PCR檢測(cè)巧巾類型的LRRK22385多態(tài)性位點(diǎn)(rs34778348)。
[0027] 一.材料
[002引1.儀器:實(shí)時(shí)巧光PCR儀、移液器、離屯、機(jī)。
[0029] 2.引物、探針設(shè)計(jì):本發(fā)明設(shè)計(jì)了可W特異擴(kuò)增包含LRRK2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)的 DNA片段的引物，W及特異識(shí)別LRRK2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)的探針。LRRK2基因2385多態(tài)性位 點(diǎn)（rs34778348)c.7153堿基為G的探針標(biāo)記為FAM，LRRK2基因 2385多態(tài)性位點(diǎn) (rs34778348)c. 7153堿基為A的探針標(biāo)記為皿X。所Wc. 7153堿基為G/G的樣本作為模板的 反應(yīng)管內(nèi)，F(xiàn)AM頻道應(yīng)有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生，皿X頻道應(yīng)沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生；Wc.7153堿基為A/A 的樣本作為模板的反應(yīng)管內(nèi)，皿X頻道應(yīng)有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生，F(xiàn)AM頻道應(yīng)沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生；W C.7153堿基為G/A的樣本作為模板的反應(yīng)管內(nèi)，F(xiàn)AM和肥X頻道應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生。
[0030] 用到的引物和探針信息如表1所示。
[0031] 表1引物與探針信息列表
[0032]
[0033] 3.試劑：I X PCR buffer;MgCl2;熱啟動(dòng)酶;UNG酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP、加 TP。
[0034] 二方法
[0035] 1.樣本的選擇
[0036] LR服2基因2385多態(tài)性位點(diǎn)（rs34778348)c.7153堿基為G/G堿基的樣本，LR服2基 因2385多態(tài)性位點(diǎn)（丘334778：348)(3.7153堿基為6/4的樣本，1^?版2基因2385多態(tài)性位點(diǎn) (rs34778348)c.7153堿基為A/A的樣本。所有的樣本均已通過(guò)DNA測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。
[0037] 2.基因組DNA的提取
[0038] 用常規(guī)分子生物學(xué)方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA。
[0039] 3.實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增與檢測(cè)
[0040] 實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系包括IXPCR buffer，3mmol/L Mg2+，200皿ol/L dATP、dCTP、 (161口、(1刊？，400皿〇1/1^117^，400皿〇1/1的上、下游引物，400加1〇1/1各巧光探針，11]熱啟動(dòng) 酶，0.3U UNG酶，25ng人基因組DM。
[0041 ] 實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)在Roche Light切cler 48〇n儀器上進(jìn)行，按W下條件進(jìn)行擴(kuò)增 檢測(cè)：
[0042] 第一階段:50°C2min;
[0043] 第二階段:95°C5min;
[0044] 第 S 階段:95°C20sec，62°C20sec(巧光采集），72°C30sec，40 個(gè)循環(huán)；
[0045] 兩個(gè)巧光檢測(cè)頻道分別為FAM和肥X。
[0046] 4.結(jié)果分析
[0047] LR服2基因2385多態(tài)性判定：只在FAM頻道中有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生的樣本C. 7153堿基為 G/G;只在肥X頻道中有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生的樣本C.7153堿基為A/A;在FAM和肥X頻道中都有擴(kuò)增 信號(hào)產(chǎn)生的樣本C. 7153堿基為G/A。
[0048] 從圖1可W看出，只有在FAM頻道中有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生，所W該樣本C. 7153堿基為G/ G。
[0049] 從圖2可W看出，在FAM和皿X頻道中都有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生，所W該樣本C.7153堿基為 G/A。
[0050] 從圖3可W看出，只有在皿X頻道中有擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生，所W該樣本C. 7153堿基為A/ A。
[0051] 從圖4可W看出，F(xiàn)AM和皿X頻道均沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)信號(hào)產(chǎn)生，為采用純水作為陰性對(duì) 照的結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括引物、熒光探針和試劑； 所述引物用于特異性擴(kuò)增包含LRRK2基因2385位點(diǎn)的DNA片段，其堿基序列如SEQ IDNO: 1和SEQ IDNO: 2所述，引物序列可由其堿基互補(bǔ)序列替換； 所述熒光探針用于識(shí)別LRRK2基因2385多態(tài)性，所述熒光探針5 '端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3 '端 標(biāo)記淬滅基團(tuán)；采用兩條標(biāo)記兩種不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的核酸探針在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)指示 兩種多態(tài)性的情況，其堿基序列如SEQ IDNO: 3和SEQ IDNO: 4所述，探針序列可由其堿基互 補(bǔ)序列替換； 所述試劑包括MgCl 2、熱啟動(dòng)Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP和PCR反應(yīng)緩沖 液。2. 如權(quán)利要求1所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述兩種不同熒光 基團(tuán)包括任意發(fā)射波長(zhǎng)不同的兩種熒光基團(tuán)的組合;常用的熒光基團(tuán)包括但不局限于目前 各種熒光標(biāo)記物，常用的淬滅基團(tuán)包括但不局限于目前各種淬滅劑。3. 如權(quán)利要求2所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述各種熒光標(biāo)記 物選自 ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、R0X、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5 · 5 中的一種。4. 如權(quán)利要求2所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述各種淬滅劑選 自 DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE 中的一種。5. 如權(quán)利要求1所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光探針包括 但不局限于TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標(biāo)、改良分子信標(biāo)、雙鏈熒光置換探針、 LightCy c 1 er探針、雙環(huán)探針中的至少一種。6. 如權(quán)利要求1所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述MgCl2的摩爾濃 度為1~5mmo 1/L，所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的摩爾濃度均為50~400ymol/L，dUTP的摩爾 濃度為 10~1000wn〇l/L。7. 如權(quán)利要求1所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熱啟動(dòng)Taq酶 的單位為1~3U/反應(yīng)。8. 如權(quán)利要求1所述LRRK2基因2385多態(tài)性檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述UNG酶的用量 為0.1~1U/反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861708SQ201610332772
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】郭奇?zhèn)? 謝勇壯, 鐘力, 許華曦, 卜國(guó)軍, 曹甜甜
【申請(qǐng)人】廈門(mén)人瑞生物醫(yī)藥科技有限公司