一種檢測(cè)人類C-Kit基因9號(hào)外顯子突變的診斷試劑盒和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)人類c?kit基因突變類型的試劑盒，它包括SEQ ID NO.1～3所示的引物對(duì)和SEQ ID NO.4所示的探針。本發(fā)明還公開(kāi)了一種檢測(cè)人類c?kit基因9號(hào)外顯子突變的方法。本發(fā)明試劑盒和方法可以準(zhǔn)確檢測(cè)人類c?kit基因9號(hào)外顯子的Y503_F504insAH、A501_Y502dup或A502_Y503dup突變，為GIST患者的用藥提供指導(dǎo)，臨床應(yīng)用前景良好。
【專利說(shuō)明】
-種檢測(cè)人類C-K i t基因9號(hào)外顯子突變的診斷試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測(cè)人類C-Kit基因9號(hào)外顯子突變的診 斷試劑盒和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors ,GIST)是一類起源于胃腸道間 葉組織的腫瘤，是胃腸道最常見(jiàn)的間葉源性腫瘤，多發(fā)于中老年患者，男女發(fā)病率無(wú)明顯差 異。Mazur等在1983年提出，GIST是一類區(qū)別于平滑肌瘤和神經(jīng)源性腫瘤的獨(dú)立腫瘤類型， 其直接病因是癌基因獲得性功能突變。
[0003] 早期治療GIST主要依賴手術(shù)切除，但是即使腫瘤完全切除，也有很多患者死于腫 瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而傳統(tǒng)的放療和化療也沒(méi)有明顯的療效。祀向藥物特別是酪氨酸激酶抑 制劑伊馬替尼的出現(xiàn)使得GIST治療發(fā)生了根本性的改變，現(xiàn)在對(duì)于GIST的治療已發(fā)展為針 對(duì)不同病情，采取包括手術(shù)、輔助治療和新輔助治療的個(gè)性化綜合治療。目前臨床上治療 GIST的一線祀向藥物是格列衛(wèi)（伊馬替尼，諾華制藥），二線藥物索坦(舒尼替尼，輝瑞制 藥），每個(gè)患者年消費(fèi)均為十余萬(wàn)人民幣。
[0004] 但祀向藥物的療效與有GIST患者有無(wú)基因突變及突變位點(diǎn)密切相關(guān)，不同的基因 突變類型患者，輔助治療的獲益存在差異，因此祀向治療之前需進(jìn)行基因檢測(cè)，W預(yù)測(cè)祀向 治療的療效并指導(dǎo)祀向藥物種類和劑量的選用。其規(guī)范的用藥方案已經(jīng)進(jìn)入《中國(guó)胃腸間 質(zhì)瘤診斷治療共識(shí)》(2013年版）。
[0005] GIST患者根據(jù)其基因突變類型，可從分子水平分為3類:C-Kit突變型（80~85%)， PDGFRa突變型（5~10%)和野生型GIST(10%)。其中，C-Kit基因位于人染色體4ql2-13,全 長(zhǎng)5230bp，含21個(gè)外顯子。C-Kit基因的突變形式多樣，包括缺失突變、點(diǎn)突變和插入突變， 突變位點(diǎn)主要發(fā)生在第9號(hào)（10%)、11號(hào)(70%)、13號(hào)（1%)、17號(hào)外顯子(1%)。
[0006] 研究表明，C-Kit基因突變不僅可協(xié)助明確診斷GIST,而且其突變位點(diǎn)與GIST祀向 藥物的治療反應(yīng)、用藥劑量和預(yù)后有關(guān)。其中，從伊馬替尼治療反應(yīng)上看，C-Kit基因有突變 的GIST病例比C-Kit野生型病例治療反應(yīng)效果好，患者腫瘤無(wú)明顯進(jìn)展的生存期長(zhǎng);C-Kit 有突變的GIST病例中，伊馬替尼的療效由高到低依次為：11號(hào)外顯子突變者、9號(hào)外顯子突 變者、13號(hào)外顯子突變者、17號(hào)外顯子突變者;另外，在伊馬替尼起始用藥劑量選擇上，也會(huì) 因突變位點(diǎn)不同而異。從酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼治療反應(yīng)上看，舒尼替尼二線治療原 發(fā)C-Kit 9號(hào)外顯子突變和野生型GIST病例的療效優(yōu)于11號(hào)外顯子突變患者；治療繼發(fā)性 C-Kit的13號(hào)外顯子突變患者的療效優(yōu)于繼發(fā)17號(hào)突變外顯子。因此，檢測(cè)C-Kit基因的突 變位點(diǎn)，對(duì)于指導(dǎo)GIST患者的合理用藥，W進(jìn)行GIST個(gè)體化診療，具有重要參考價(jià)值。
[0007] 但是，目前檢測(cè)人類C-Kit基因 9號(hào)外顯子突變，主要是通過(guò)傳統(tǒng)的測(cè)序方式，測(cè)序 的耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且成本高，不利用普通的臨床檢測(cè)。即使有少數(shù)使用巧光定量PCR法的報(bào)道， 也是僅對(duì)9號(hào)外顯子的其中某一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)位點(diǎn)單一，無(wú)法對(duì)9號(hào)外顯子進(jìn)行多 個(gè)突變位點(diǎn)的評(píng)估，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的定量PCR檢測(cè)人類C-Kit基因突變的試劑盒和方 法。
[0009] C-Kit基因 9號(hào)外顯子的主要突變信息如下：
[0010]
[001 U 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類c-kit基因突變類型的試劑盒，它包括SEQ ID NO. 1~ 3所示的引物對(duì)和SEQ ID NO.4所示的探針。
[001^ 其中，它還包括質(zhì)控引物與質(zhì)控探針:沈Q ID NO.5~7所示引物對(duì)與SEQ ID NO.8 所示的探針。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述試劑盒在制備檢測(cè)人類c-kit基因 9號(hào)外顯子突變的試劑中 的用途。
[0014] 其中，所述9號(hào)外顯子突變?yōu)閅503_F504insAH、A501_Y502d叫或A502_Y503d叫突 變。
[001引本發(fā)明還提供了沈Q ID NO. 1~3所示引物對(duì)。
[0016] 本發(fā)明還提供了SEQ ID NO.4所示的探針。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人類c-kit基因 9號(hào)外顯子突變的方法，它包括如下步 驟：
[001引（1)提取樣本DNA:取待檢組織，提取其中的DNA;
[0019] (2)基因擴(kuò)增:用上述試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0020] (3)結(jié)果檢測(cè):對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。
[0021] 其中，所述9號(hào)外顯子突變?yōu)閅503_F504insAH、A501_Y502dup或A502_Y503dup突 變。
[0022] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的特定引物，可W用于檢出9號(hào)外顯子的主要突變類型包括Y503_ F504insAH、A501_Y502dup和A502_Y503dup突變。只要本發(fā)明檢測(cè)試劑盒和方法測(cè)出有突 變，就可W確認(rèn)C-Kit基因的9號(hào)外顯子存在Y503_F504insAH、A501_Y502d叩和A502_ Y503dupS種突變類型的至少一種突變。從而可W預(yù)測(cè)GIST患者對(duì)祀向藥物的治療反應(yīng)、用 藥劑量和預(yù)后。
[0023] 本發(fā)明提供的試劑盒可W同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)待檢人群是否出現(xiàn)C-Kit基因的9號(hào)外顯 子上的3個(gè)突變位點(diǎn)，更能準(zhǔn)確判斷待檢GIST患者的藥物反應(yīng)，為GIST患者的用藥提供指 導(dǎo)，且靈敏度高，特異性好，而且檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，成本低廉，可W大量推廣使用，臨床應(yīng)用前 景良好。
[0024] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0025] W下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為突變型樣本測(cè)序結(jié)果圖
[0027] 圖2為特異性檢測(cè)結(jié)果圖
[00%]圖3為靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖：編號(hào)1-4分別為濃度為8ng/ul、4ng/ul、化g/ul、lng/ul 的DNA擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面W實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于運(yùn)些實(shí)施例。
[0030] 本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)試劑與儀器如下：
[0031] FastS^dhq DNA Polymerase:購(gòu)自Roche公司，Cat No. 12 032 937 001;
[0032] Uracil DNA Glycosylase(UNG) ,heat labile 200U 2u/l:購(gòu)自大連!"akara公司， No.2820;
[003；3]加 plus dNTP Mixture(12.5X)(dATP 2.5mM，dGTP 2.5mM，dCTP 2.5mM，dUTP 7.5mM，）：購(gòu)自大連hkara公司，Cat No. 4035。
[0034] 實(shí)施例1本發(fā)明檢巧Uc-Kit基因9號(hào)外顯子突變的試劑盒和檢巧巧法
[0035] 一、本發(fā)明試劑盒的組成
[0036] PCR擴(kuò)增試劑（1人份）： 「00371
[0040] c-kit基因9號(hào)外顯子突變的擴(kuò)增引物W及檢測(cè)探針如下：
[0041]
[i
[i
[0044] 二、采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)C-Kit基因9號(hào)外顯子突變
[0045] 1、樣本DNA提?。嚎蒞使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取試劑盒 提取。
[0046] W石蠟組織樣本，用Qiagen公司試劑盒為例，提取DNA。
[0047] 1)利用手術(shù)刀取出組織邊界無(wú)用的石蠟；
[004引2)將石蠟包埋組織切成4WI1厚的薄片；
[0049] 3)迅速用滅菌小綴子取2-6枚裝入面ase/RNase Free EP管中（每張攤開(kāi)面積500 (最大)mm2,即邊長(zhǎng)1.6cm的正方形大?。?br>[0化日]4)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離屯、3分鐘；
[0化1] 5)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離屯、3分鐘；
[0052] 6)棄二甲苯，加入80化1無(wú)水乙醇，最大轉(zhuǎn)數(shù)離屯、3分鐘；
[0053] 7)棄無(wú)水乙醇，揮干樣品；
[0054] 8)加入 18化1 ALT buffer及20]il proteinase K，56°C -小時(shí)^上，直至清亮；
[0化5] 9)90°C -小時(shí)；
[0化6] 10)離屯、6000g Imin,取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0化7] 11)加入20化1 混勻，加入20化1乙醇，再混勻；
[0化引12)簡(jiǎn)單離屯、清潔管壁；
[0059] 13)將全部混合液加入到DNA分離柱，關(guān)蓋，離屯、6000g Imin,換新的收集管；
[0060] 14)加入 50化1 AWl，6000g 離屯、Imin;換收集管；
[0061 ] 15)加入 50化1 AW2,6000g 離屯、Imin,換收集管；
[0062] 16)全速離屯、3min，干燥柱子；
[0063] 17)換一只干凈的1.5ml收集管，準(zhǔn)備收集DNA;加入20-3化1 ATE，在室溫保持Imin W溶解DNA。全速離屯、Imin收集DNA。
[0064] 2、定量PCR擴(kuò)增
[0065] c-kit基因突變的擴(kuò)增引物W及檢測(cè)探針：
[0066] C9引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR體系中加入 Iul即可。
[0067]
c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR體系中加 入Iul即可。 「DDARl LUU/'U 孩脫觀h巧巧觀巧八個(gè)HJK昔：
[0072]
[0073] 2)BI0-RAD CFX96機(jī)器PCR熱循環(huán)程序設(shè)置：
[0074]
[00對(duì) 3、結(jié)果判讀：
[0076] W外控信號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)，其信號(hào)Ct值在15-25,表明上樣DNA的量在允許范圍W內(nèi)。所有 實(shí)驗(yàn)樣本的外控曲線均應(yīng)該升起，否則重新提取DNA檢測(cè)。讀取待檢孔(孔號(hào)l)Ct值，Ct值為 〇(或者無(wú)擴(kuò)增曲線）或者大于29判讀陰性，判定為無(wú) C9突變;Ct值小于28判讀該信號(hào)孔陽(yáng) 性。28~29重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍然在28~29判讀C9弱陽(yáng)性突變。
[0077] 其中，陽(yáng)性、弱陽(yáng)性:代表樣品有突變，突變類型為Y503_F504insAH、A501_Y502dup 或 A502_Y503dup 突變
[0078] W下用實(shí)驗(yàn)例的方式說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：
[0079] 實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明試劑盒W及方法的準(zhǔn)確性和特異性檢測(cè)
[0080] 1、待檢樣本
[0081 ] 選取已知突變類型為c-kit基因9號(hào)外顯子突變(分別為Y503_F504insAH、A501_ Y502dup、A502_Y503dup突變）的臨床GIST石蠟組織樣本各1例（其中，Y503_F504insAH突變 的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1)和已知野生型臨床GIST石蠟組織樣本1例，檢測(cè)人類c-kit基因突變類 型。
[0082] 2、檢測(cè)方法
[0083] 本發(fā)明方法:采用實(shí)施例1的試劑盒，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0084] 樣本DNA提取方法:用Qiagen公司試劑盒提?。?br>[0085] 1)利用手術(shù)刀取出組織邊界無(wú)用的石蠟；
[0086] 2)將石蠟包埋組織切成4WI1厚的薄片；
[0087] 3)迅速用滅菌小綴子取2-6枚裝入面ase/RNase Free EP管中（每張攤開(kāi)面積500 (最大)mm2,即邊長(zhǎng)1.6cm的正方形大??；
[0088] 4)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離屯、3分鐘；
[0089] 5)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉(zhuǎn)數(shù)離屯、3分鐘；
[0090] 6)棄二甲苯，加入80化1無(wú)水乙醇，最大轉(zhuǎn)數(shù)離屯、3分鐘；
[0091] 7)棄無(wú)水乙醇，揮干樣品；
[0092] 8)加入 18化1 ALT buffer及20iU proteinase K，56°C-小時(shí)W上，直至清亮；
[0093] 9)90°C -小時(shí)；
[0094] 10)離屯、6000g Imin,取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[00巧]11)加入20化1 混勻，加入20化1乙醇，再混勻；
[0096] 12)簡(jiǎn)單離屯、清潔管壁；
[0097] 13)將全部混合液加入到DNA分離柱，關(guān)蓋，離屯、6000g Imin，換新的收集管；
[0098] 14)加入 50化1 AWl，6000g 離屯、Imin;換收集管；
[0099] 15)加入 50化1 AW2,6000g 離屯、Imin,換收集管；
[0100] 16)全速離屯、3min，干燥柱子；
[0101] 17)換一只干凈的1.5ml收集管，準(zhǔn)備收集DNA;加入20-3化1 ATE，在室溫保持Imin W溶解DNA。全速離屯、Imin收集DNA。
[0102] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0103] 如果突變型樣本信號(hào)Ct值在28W內(nèi)，則表示樣本出現(xiàn)了c-kit基因9號(hào)外顯子檢測(cè) 突變類型(Y503_F504insAH、A501_Y502dup 和 A502_Y503dup)中至少一種突變。
[0104] 本發(fā)明的3例突變型樣本信號(hào)Ct值均在28W內(nèi)，其中Y503_F504insAH突變型樣本 的測(cè)序結(jié)果如圖2所示。圖2中，曲線1是突變型樣本信號(hào)；曲線2是外控信號(hào)，曲線3是陰性對(duì) 照(野生型對(duì)照)信號(hào)，樣本信號(hào)Ct值在28 W內(nèi)，表示該樣本出現(xiàn)了c-kit基因9號(hào)外顯子的 Y503_F504insAH、突變。
[0105] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明方法和試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與已知檢測(cè)結(jié)果比較:結(jié)果一致， 說(shuō)明本發(fā)明方法和試劑盒可W準(zhǔn)確c-kit基因9號(hào)外顯子突變，準(zhǔn)確性強(qiáng);另外，陰性對(duì)照樣 本Ct值大于30,為陰性，說(shuō)明了本發(fā)明方法和試劑盒的特異性好。
[0106] 實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明試劑盒W及方法的靈敏度分析
[0107] 1、試驗(yàn)方法
[010引取含有人類c-kit基因9號(hào)外顯子突變的DNA，定量至濃度為SngAil，進(jìn)行等比稀 釋，稀釋后的濃度分別為8ng/u 1、4ng/u 1、化g/u 1、1 ng/u 1、0.5ng/u 1
[0109] 用實(shí)施例1的試劑盒，按照實(shí)施例1的定量PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。
[0110] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0111] 如圖3所示，本發(fā)明試劑盒可W檢測(cè)到濃度為Ing/ul的低濃度樣本，靈敏度高。
[0112] 綜上，本發(fā)明提供的試劑盒可W準(zhǔn)確檢測(cè)人類C-Kit基因9號(hào)外顯子突變，特異性 和靈敏度高，檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便，成本低廉，可W大量推廣使用，臨床應(yīng)用前景良好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)人類c-kit基因突變類型的試劑盒，其特征在于:它包括SEQ ID N0.1~3所 示的引物對(duì)和SEQ ID NO.4所示的探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：它還包括質(zhì)控引物與質(zhì)控探針：SEQ ID NO.5~7所示引物對(duì)與SEQ ID NO.8所示的探針。3. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測(cè)人類c-kit基因9號(hào)外顯子突變的試劑中的 用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于：所述9號(hào)外顯子突變?yōu)閅503_F504insAH、 A501_Y502dup 或 A502_Y503dup 突變。 5.SEQ ID NO. 1~3所示引物對(duì)。 6.SEQ ID NO.4所示的探針。7. -種檢測(cè)人類c-kit基因9號(hào)外顯子突變的方法，其特征在于:它包括如下步驟： (1) 提取樣本DNA:取待檢組織，提取其中的DNA; (2) 基因擴(kuò)增:用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒對(duì)待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增； (3) 結(jié)果檢測(cè):對(duì)DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述9號(hào)外顯子突變?yōu)閅503_F504insAH、 A501_Y502dup 或 A502_Y503dup 突變。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861737SQ201610446425
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】葉豐, 陳卉嬌, 步宏
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院