甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑盒及制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述試劑盒包含反轉(zhuǎn)錄引物混合物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、第二鏈合成緩沖液及第二鏈合成酶。本發(fā)明根據(jù)甲型流感病毒設(shè)計通用型特異引物，采用反轉(zhuǎn)錄、RNase H消化和雙鏈cDNA合成三個步驟形成可用于高通量測序的甲型流感病毒核酸模板。該試劑盒可對所有亞型的甲型流感病毒制備模板，具有較強的廣譜性，可在3小時內(nèi)完成反應(yīng)，為甲型流感病毒高通量測序的模板制備提供了簡單快速的工具。
【專利說明】
甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑盒及制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑 盒及其制備方法和應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 近年來，甲型流感病毒的不同亞型，如甲型HlNl、冊Nl、H7N9、朋N2等不斷出現(xiàn)或爆 發(fā)，對人類健康造成了嚴重危害。甲型流感病毒有8個基因節(jié)段，根據(jù)血凝素基因化A)和神 經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的不同，發(fā)現(xiàn)甲型流感有17種不同的HA亞型、10種NA亞型，不同的亞型 可W相互重組，因而，甲型流感病毒理論上可形成170種不同的HANA亞型，識別不同病毒亞 型對于疾病的預(yù)防、治療、疫情控制、流行特征等非常重要。
[0003] 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過對甲型流感病毒基因進行擴增，擴增產(chǎn) 物進行測序，根據(jù)序列進行亞型鑒定已成為甲型流感亞型鑒定的重要手段，用傳統(tǒng)的一代 測序技術(shù)即Sanger測序也可W得到病毒的全基因序列，但該過程需要對每個片段設(shè)計特異 引物進行多次擴增，擴增產(chǎn)物進行測序，拼接得到全長序列，該方法工作量大，價格昂貴，不 適合大規(guī)模操作。最近，高通量測序技術(shù)已逐漸應(yīng)用于微生物檢測工作，該技術(shù)具有通量 高，單個樣本測序價格便宜，快速等特點，已廣泛應(yīng)用于流感病毒的測序工作。然而，高通量 測序文庫的制備首先需要得到特異的雙鏈CDNA模板，所W，亟待建立一種快速、可靠的甲型 流感病毒模板制備技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是:針對高通量測序流感病毒需要制備雙鏈DNA模板 的需求，提供一種快速，特異的制備所有亞型甲型流感病毒雙鏈DNA模板制備試劑盒及其制 備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)原理是基于甲流流感病毒的8個節(jié)段的5'端及3'端存在保守序列， 針對保守序列設(shè)計特異引物，利用特異引物進行反轉(zhuǎn)錄形成RNA和CDNA雜交體、W腳ase H 消化去除RNA，最后再W特異引物合成雙鏈CDNA。
[0006] 本發(fā)明試劑盒由反轉(zhuǎn)錄引物混合物、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、第二鏈合 成緩沖液及第二鏈合成酶構(gòu)成。本發(fā)明根據(jù)甲型流感病毒設(shè)計通用型特異引物。其中反轉(zhuǎn) 錄引物混合物含有反轉(zhuǎn)錄引物和S憐酸脫氧核糖核巧酸混合物(dNTPs)，反轉(zhuǎn)錄緩沖液包 含反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、RNA酶抑制劑。反轉(zhuǎn)錄酶為AMV反轉(zhuǎn)錄酶。R化Se H濃度為lU/ul。第二鏈 合成緩沖液含有第二鏈合成引物混合物及第二鏈合成酶反應(yīng)緩沖液。第二鏈合成酶為 Klenow Fragment(3'一5'ex〇-)。
[0007] 反轉(zhuǎn)錄引物為針對所有亞型流感病毒8個節(jié)段的特異引物，序列為5'-AGCRAAAGCAGG-3'，R代表A或G堿基。
[000引第二鏈合成引物混合物為針對所有亞型流感病毒8個節(jié)段的特異引物，序列為1: 5 '-AGTAGAAACAAGGTCGT1T-3 '
[0009] 2:5 '-AGTAGAAACAAGGCATTT-3 '
[0010] 3:5 '-AGTAGAAACAAGGTACTT-3 '
[0011] 4:5 '-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 '
[0012] 5:5 '-AGTAGAAACAAGGGTATTTTT-3 '
[0013] 6:5 '-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3 '
[0014] 7:5 '-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3 '
[0015] 8:5 '-AGTAGAAACAAGGTGCTTTTT-3 '
[0016] 9:5 '-AGTAGAAACAAGGGTCTT-3 '
[0017] 對上述引物進行任何修飾、變異體、加接頭等均屬于本發(fā)明保護范圍。
[0018] 本發(fā)明所述甲型流感病毒高通量測序的模板制備試劑盒的制備方法，包括如下步 驟：
[0019] 核酸提?。河糜诤怂崽崛〉臉颖景ū茄适米?、疲液、糞便、環(huán)境拭子、污水、動物 組織等。使用QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN公司）或Hi曲化re RNA Isolation Kit (Roche公司）提取核酸，提取核酸放置于-80°C保存或立即使用。
[0020] 單鏈CDNA合成:取一200ul EP管，標記為A管，取8ul提取的核酸，加入化1反轉(zhuǎn)錄引 物混合物加入A管，混勻后放入PCR儀，65 °C，5min，4 °C冷卻2min，在65 °C加熱同時在另一 200ul EP管，標記為B管，加入9ul反轉(zhuǎn)錄緩沖液，Iul反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后加入冷卻的A管中，混 勻后放入PCR儀50°C，化;70°C，15min。
[0021] RNase H消化:在A管中加入RNase H lul，混勻，放入PCR儀37°C，20min。
[0022] 雙鏈cDNA合成：在C管中加入9.加1第二鏈合成緩沖液及0.5ul第二鏈合成酶，混 勻，加入A管中，混勻后放入PCR儀37 °C，化;75 °C，20min。
[0023] 雙鏈cDNA純化：使用Roche公司Hi曲 Pure PCR Product 化rification Kit,按試 劑盒操作說明純化雙鏈cDNA，純化產(chǎn)物定量后可直接用作高通量測序模板。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明所提供試劑盒為高通量測序甲型流感病毒的模板制 備提供了簡單快速的工具，該試劑盒可對所有亞型的甲型流感病毒制備模板，具有較強的 廣譜性，可在3小時內(nèi)完成反應(yīng)。另外由于本試劑盒含有的引物為甲型流感病毒特異性引 物，極大提高了測序模板的特異性。本發(fā)明所述試劑盒具有通量高，單個樣本測序價格便 宜，結(jié)果可靠，快速等特點。
【附圖說明】
[0025] 圖1:比較本試劑盒與其他模板制備方法對高通量測序流感病毒基因組覆蓋率的 影響。
[0026] 圖2:本試劑盒制備模板用于高通量測序流感病毒8個基因節(jié)段的覆蓋率。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實施例用于說明本發(fā)明而不是 限制本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 實施例1比較本試劑盒與其他模板制備方法對高通量測序流感病毒基因組的影響 [00巧]核酸提取：W-株流感病毒樣本使用QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN公司） 或Hi曲化re RNA Isolation Kit(Roche公司）提取核酸，提取核酸稀釋成IO4CopiesAil， 用于制備高通量測序模板。
[0030] 高通量測序模板制備方法:方法1: W6堿基隨機引物反轉(zhuǎn)錄生成單鏈CDNA和雙鏈 CDNA做為高通量測序模板;方法2: W特異的流感病毒反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄生成單鏈CDNA，W6 堿基隨機引物生成雙鏈CDNA做為高通量測序模板;方法3:為本試劑盒方法。主要步驟如下：
[0031] 單鏈CDNA合成:取一200ul EP管，標記為A管，取8ul提取的核酸，加入化1反轉(zhuǎn)錄引 物混合物加入A管，混勻后放入PCR儀，65 °C，5min，4 °C冷卻2min，在65 °C加熱同時在另一 200ul EP管，標記為B管，加入9ul反轉(zhuǎn)錄緩沖液，Iul反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后加入冷卻的A管中，混 勻后放入PCR儀50 °C，化;70 °C，15min。
[0032] RNase H消化:在A管中加入RNase H lul，混勻，放入PCR儀37°C，20min。
[0033] 雙鏈cDNA合成：在C管中加入9.加1第二鏈合成緩沖液及0.5ul第二鏈合成酶，混 勻，加入A管中，混勻后放入PCR儀37 °C，化，75 °C，20min。
[0034] 雙鏈cDNA純化：使用Roche公司Hi曲化re PCR Product 化rification Kit,按試 劑盒操作說明純化雙鏈cDNA，純化產(chǎn)物定量后可直接用作高通量測序模板。
[0035] 文庫構(gòu)建與測序:將雙鏈CDNA準確定量后，稀釋成0.化g/山，W扣1作為測序模板， 按照化Xtera XT DNA Sample Preparation Kit說明構(gòu)建測序文庫。主要步驟包括：DNA的 化gmentation、PCR擴增、純化、文庫標化及混合。取60化1混合樣加入MiSeq測序試劑樣品 孔，進行2 X 15化P配對末端測序。
[0036] 序列分析:MiSeq高通量測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)W參考基因組進行Mapping拼接。
[0037] 高通量測序結(jié)果顯示:本試劑盒即方法3無論是族生成數(shù)(Cluster Pass Filter, Cluster PF)、覆蓋率（Coverage)、還是單核巧酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymor地isms, SNPs)等測序指標都優(yōu)于方法I和2(表1，圖I)。雖然方法2的W上S個測序 指標均優(yōu)于方法1，其平均讀長(Median Length)286bp與方法3的28化P類似，而且在個別區(qū) 域如PBl基因的5'端覆蓋率高于方法3(圖1)，但方法2在基因節(jié)段HA及NA均無覆蓋，整體覆 蓋率低于方法3。
[0038] 表1:不同模板制備方法對高通量測序的影響
[00391
[0040] 實施例2高通量測序生物樣本流感病毒基因組
[0041] 核酸提取:8例流感病毒生物樣本使用QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN公司） 或化曲Pure RNA Isolation Kit(Roche公司）提取核酸，提取核酸放置于-80°C保存或立 即使用。
[0042] 單鏈CDNA合成:取一200ul EP管，標記為A管，取8ul提取的核酸，加入化1反轉(zhuǎn)錄引 物混合物加入A管，混勻后放入PCR儀，65 °C，5min，4 °C冷卻2min，在65 °C加熱同時在另一 200ul EP管，標記為B管，加入9ul反轉(zhuǎn)錄緩沖液，Iul反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后加入冷卻的A管中，混 勻后放入PCR儀50°C，化;70°C，15min。
[0043] RNase H消化:在A管中加入RNase H lul，混勻，放入PCR儀37°C，20min。
[0044] 雙鏈DNA合成:在C管中加入9.加 1第二鏈合成緩沖液及0.加 1第二鏈合成酶，混勻， 加入A管中，混勻后放入PCR儀37°C ah;75°C，20min。
[0045] 雙鏈DNA純化：使用Roche公司Hi曲 Pure PCR Product Purification Kit,按試 劑盒操作說明純化雙鏈DM,純化產(chǎn)物定量后可直接用作高通量測序模板。
[0046] 文庫構(gòu)建與測序及序列分析同上。
[0047] 高通量測序結(jié)果顯示:8個樣本的8個基因節(jié)段均可成功檢測(表2)，基因組覆蓋率 從246.1到8251.6不等，其中一個代表性樣本的基因組覆蓋率如圖2所示。
[004引表2高通量測序8株流感病毒基因組 [0049]
[00
[0051]除上述實施例外，本發(fā)明還可W有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑盒，其特征是由反轉(zhuǎn)錄引物混合物、反 轉(zhuǎn)錄緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、第二鏈合成緩沖液及第二鏈合成酶構(gòu)成;其中反轉(zhuǎn)錄引物 混合物為含有反轉(zhuǎn)錄引物和三磷酸脫氧核糖核苷酸的混合物，反轉(zhuǎn)錄緩沖液為包含反轉(zhuǎn)錄 酶緩沖液、RNA酶抑制劑，反轉(zhuǎn)錄酶為AMV反轉(zhuǎn)錄酶，RNase Η濃度為lU/ul，第二鏈合成緩沖 液為含有第二鏈合成引物混合物及第二鏈合成酶反應(yīng)緩沖液，第二鏈合成酶為K1 enow Fragment(37 ex〇-)； 反轉(zhuǎn)錄引物為針對所有亞型流感病毒8個節(jié)段的特異引物，序列為5 ' -AGCRAAAGCAGG-3'，R代表A或G堿基； 第二鏈合成引物混合物為針對所有亞型流感病毒8個節(jié)段的特異引物，序列為 1:5，-AGTAGAAACAAGGTCGTTT-3， 2:5，-AGTAGAAACAAGGCATTT-3， 3:5，-AGTAGAAACAAGGTACTT-3， 4:5 '-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3， 5:5 '-AGTAGAAACAAGGGTATTTTT-3 ' 6:5 '-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3 ' 7:5 '-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3 ' 8:5 '-AGTAGAAACAAGGTGCTTTTT-3 ' 9:5 '-AGTAGAAACAAGGGTCTT-3， 對上述引物進行任何修飾、變異體、加接頭均屬于本發(fā)明保護范圍。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑盒的制備方法，其 特征是由以下步驟構(gòu)成： (1) 核酸提?。河糜诤怂崽崛〉臉颖緸楸茄适米踊蛱狄夯蚣S便或環(huán)境拭子或污水或動 物組織，使用QIAamp Viral RNA mini kit或High Pure RNA Isolation Kit提取核酸，提 取核酸放置于_80°C保存或立即使用； (2) 單鏈cDNA合成：取一200ul EP管，標記為A管，取8ul提取的核酸，加入2ul反轉(zhuǎn)錄引 物混合物加入A管，混勻后放入PCR儀，65°C，5min，4°C冷卻2min，在65°C加熱，同時在另一 200ul EP管，標記為B管，加入9ul反轉(zhuǎn)錄緩沖液，lul反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后加入冷卻的A管中，混 勻后放入PCR儀50°C，lh; 70°C，15min。 (3) RNase H消化：在A管中加入RNase H lul，混勻，放入PCR儀37°C，20min; (4) 雙鏈cDNA合成:在C管中加入9.5ul第二鏈合成緩沖液及0.5ul第二鏈合成酶，混勻， 加入A管中，混勻后放入PCR儀37°C，lh;75°C，20min; (5) 雙鏈cDNA純化：使用Roche公司High Pure PCR Product Purification Kit，按試 劑盒操作說明純化雙鏈cDNA，純化產(chǎn)物定量后可直接用作高通量測序模板。3. 權(quán)利要求1所述甲型流感病毒高通量測序模板制備試劑盒在高通量測序流感病毒基 因組中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK105861749SQ201610305639
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】崔侖標, 葛以躍, 祁賢, 趙康辰, 郭喜玲, 戚宇華, 焦永軍, 史智揚, 周明浩
【申請人】江蘇省疾病預(yù)防控制中心