一種用于四溴聯(lián)苯醚快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種2，2’，4，4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)的酶聯(lián)免疫檢測方法，改造BDE-47分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成半抗原C15H9Br3O3和C11H13Br2O3N，分別與牛血清白蛋白、卵清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原和包被原。對新西蘭大白兔進(jìn)行7次免疫后取得特異性抗血清。ELISA法測定抗體效價為1∶400000，檢出限為0.01mg/L，定量限為0.023mg/L，IC50為0.108mg/L。所建立的對BDE-47的間接競爭抑制ELISA方法，具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，在對大量環(huán)境樣品的進(jìn)行初期篩選時很有優(yōu)勢，可大幅提高監(jiān)測工作效率，降低監(jiān)測成本，為儀器檢測提供有效依據(jù)。
【專利說明】
一種用于四溴聯(lián)苯醚快速檢測的酶聯(lián)免疫吸附分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種可用于BDE-47的快速檢測的ELISA方法，屬于免疫化學(xué)和殘留分 析的檢驗技術(shù)領(lǐng)域，建立的間接競爭抑制ELISA檢測方法可以用于研制BDE-47免疫速測試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 多溴聯(lián)苯謎（polybrominateddiphenyl ethers，PBDEs)，是一類含溴原子的芳香 族化合物，屬于溴系阻燃劑，其化學(xué)通式為C12H^ 9)Bru ~ 1(])0,依據(jù)苯環(huán)上溴原子取代數(shù)目 和取代位置的不同，可分為10個不同組分，共有209種同系物。BDE-47全稱2, 2'，4,4'-四 溴聯(lián)苯醚，為多溴聯(lián)苯醚中使用和環(huán)境分布最為廣泛的同系物質(zhì)。分子式為C12H 6Br40,分子 量為485. 79,熔點-107°C，沸點98-99°C?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，親脂疏水性極強(qiáng)，具有 生物積累性。
[0003] 多溴聯(lián)苯醚多用于阻燃劑的生產(chǎn)，屬于溴代阻燃劑的一種，被廣泛應(yīng)用于電子、電 器、紡織、家居建材等多個工業(yè)領(lǐng)域中。市場上現(xiàn)行使用的PBDEs商用阻燃劑主要可分為三 種：五溴聯(lián)苯醚混合物、八溴聯(lián)苯醚混合物以及十溴聯(lián)苯醚，BDE-47主要應(yīng)用于五溴聯(lián)苯 醚，另外高溴代化合物也可脫溴成為低溴代化合物。在多溴聯(lián)苯醚的生產(chǎn)、使用和處置過 程中都會對環(huán)境造成不同程度的污染，根據(jù)目前已有的相關(guān)研究，PBDEs會對人體產(chǎn)生肝臟 毒性，甲狀腺激素毒性，神經(jīng)毒性，生殖系統(tǒng)毒性等方面的危害。多溴聯(lián)苯醚的嚴(yán)重危害問 題已經(jīng)引起人們的高度重視，美國、加拿大等國已開始限制其生產(chǎn)和使用，因此必須建立快 速、靈敏的檢測分析方法，以確保環(huán)境安全和人類健康。
[0004] BDE-47測定最常采用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。但是這些儀器方法前處理費 事、成本高、不適合現(xiàn)場檢測，而ELISA具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點，避免了經(jīng)典儀器測 試手段的不足，能夠用于現(xiàn)場快速監(jiān)測和大量樣品的快速篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于BDE-47間接競爭抑制ELISA快速檢測。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] -種用于BDE-47快速檢測的間接競爭抑制ELISA方法，具體步驟如下：
[0008] 1.半抗原的合成
[0009] 半抗原C15H903Br 3的合成：稱取1201. 2mg(5mmol)的磷?；宜崛阴ビ?50ml錐 形瓶，加入lOmlTHF，另加入280mg氫化鈉，在冰浴器中攪動反應(yīng)20min ;稱取3-溴-4-氟苯 甲酸3. 24g(16mmol),再稱取2,4-二溴苯酉分4g，（16mmol)溶于20ml二甲基乙酰胺中，反應(yīng) 2h ;稱取已制得的3-溴_4_(2,4-二溴苯氧基）苯甲酸2000mg(4. 6mmol)，與上步驟冷卻過 后的混合物進(jìn)行反應(yīng)3-4h ;秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H20加入1，4_二氧六環(huán)與水 的混合液50ml (體積比1 : 1)中，將合成物質(zhì)水解24h;分離純化后得到白色晶體態(tài)半抗 原 C15H903Br3為 573mg，產(chǎn)率為 61 %。
[0010] 半抗原 CnH1303NBr2的合成：稱取 3,5_ 二溴-2-羥基吡啶 200mg(0. 79mmol)，加 入6-溴己酸乙酯352. 53mg(l. 58mmol)以及適量無水K2C03,混合溶于2mL二甲基甲酰胺 中，100°C下反應(yīng)5h ;秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H20加入1，4_二氧六環(huán)與水的混合 液50ml (體積比1 : 1)中，將合成物質(zhì)水解24h;分離純化后得到淡黃色晶體態(tài)的半抗原 CnH1303NBr2S 138mg，產(chǎn)率為 93%。
[0011] 2.全抗原的合成
[0012] 免疫原 C15H903Br3-BSA 的合成：取半抗原 C15H903Br30. 50mmol (0· 239g)置于溶于 10ml N，N-二甲基甲酰胺；取N-羥基琥拍酰亞胺0. 50mmol (0. 0584g), N，Ν' -二環(huán)己基碳 0. 55mmol0. 1035g)，溶于10ml Ν，Ν-二甲基甲酰胺中，在磁力攪拌下逐滴加到溶有半抗原 的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫攪拌反應(yīng)8h，4°C過夜；將反應(yīng)產(chǎn)物以9000r/min離心15min， 上層清液為活性酯；將適量的牛血清白蛋白溶解于pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成15mg/ mL的溶液10mL ;4°C攪拌下，取10mL活性酯緩慢地滴加入10mL的蛋白溶液中，繼續(xù)攪拌 4h ;反應(yīng)后的溶液用0. 9 %生理鹽水透析5d ;將透析完成后，將最后透析液冷凍干燥后保存 于-20。。。
[0013] 包被原CnH1303NBr 2-0VA的合成：除蛋白使用卵白蛋白外，步驟與免疫原合成相同。
[0014] 3.抗血清的合成
[0015] 選取體型均一，健康狀況良好的兩制新西蘭大白兔作為免疫對象，用生理鹽水稀 釋適量免疫原C 15H903Br3-BSA，并將免疫原溶液與弗氏完全佐劑混合，使免疫原充分乳化。取 弗氏完全佐劑乳化后的免疫原溶液對兔子進(jìn)行皮下注射，注射后輕柔免疫部位使免疫原被 充分吸收，避免皮下局部組織硬化。在第3次加強(qiáng)免疫后，通常將兔耳緣靜脈取血部位周圍 的兔毛拔凈，摩擦刺激局部，使兔耳發(fā)熱，靜脈充血，手術(shù)刀割小口后取約2~3mL血液，靜 置離心后，取上清液用（測試效價的具體方法）對現(xiàn)有抗血清進(jìn)行效價檢測。待效價達(dá)到 預(yù)期后，在頸動脈進(jìn)行大量采血。
[0016] 表1人工抗原生物免疫實施方案
[0017]
[0018] 4.間接競爭抑制ELISA檢測BDE-47方法的建立
[0019] 以每孔100μ L的5μ g/mL的包被原稀釋液包被96孔酶標(biāo)板，4°C靜置過夜；將 包被液倒凈，向每孔加入350 μ L洗滌液，浸泡lmin，吸去洗滌液，此步驟重復(fù)3次；以每孔 200 μ L封閉液進(jìn)行封閉，37°C振蕩溫育30min后，將封閉液倒凈，如上洗滌3次；加入50 μ LBDE-47 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液（0,0· 025,0· 05,0· 1，0· 25,0· 5,1，5,10,20,50,100,200,500， 1000ug/L，）和50 μ L抗血清溶液，震蕩30s后，37°C振蕩溫育60min ;如上封閉后洗滌，加入 100 μ L羊抗兔IgG-HRP溶液，37°C振蕩溫育60min ;如上封閉后洗滌，加入100 μ L底物液， 37°C避光振蕩溫育15min ;加入50 μ L的2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀在450nm波 長下測定各板孔中溶液的吸光度。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：間接競爭抑制ELISA用于BDE-47的檢測方法具有較高的靈敏 度，通過實際樣品加標(biāo)回收分析，間接競爭抑制ELISA方法表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和精確度， 該方法相比傳統(tǒng)氣相色譜-質(zhì)譜檢測（GC-MS)方法相比更簡單快速。
【附圖說明】
[0021] 圖1半抗原C15H903Br 3合成路線
[0022] 圖2半抗原成路線
[0023] 圖3免疫原合成路線
[0024] 圖4包被原合成路線
【具體實施方式】
[0025] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試劑與材料，如無特殊說明，均可 從常規(guī)試劑公司購買得到。
[0026] 間接競爭抑制ELISA檢測方法的建立與評估
[0027] 一、方法的靈敏度
[0028] 表2 K1-BSA抗血清ELISA法測定BDE-47標(biāo)樣數(shù)據(jù)
[0029]
[0030] 以每孔100 μ L的5 μ g/mL的包被原稀釋液包被96孔酶標(biāo)板，4°C靜置過夜；將 包被液倒凈，向每孔加入350 μ L洗滌液，浸泡lmin，吸去洗滌液，此步驟重復(fù)3次；以每孔 200 μ L封閉液進(jìn)行封閉，37°C振蕩溫育30min后，將封閉液倒凈，如上洗滌3次；加入50 μ L 的 BDE-47 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液（0,0· 025,0· 05,0· 1，0· 25,0· 5,1，5,10,20,50,100,200,500， 1000ug/L，）和50 μ L抗血清溶液，震蕩30s后，37°C振蕩溫育60min ;如上封閉后洗滌，加入 100 μ L羊抗兔IgG-HRP溶液，37°C振蕩溫育60min ;如上封閉后洗滌，加入100 μ L底物液， 37°C避光振蕩溫育15min ;加入50 μ L的2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀在450nm波 長下測定各板孔中溶液的吸光度。計算可得間接競爭抑制ELISA檢測BDE-47的IC 5。值為 0· 108mg/L，檢出限為0· 01mg/L，定量限為0· 023mg/L，在0· 01~0· 5mg/L范圍內(nèi)檢測結(jié)果 準(zhǔn)確。
[0031] 二、實際樣品添加回收試驗
[0032] 選擇水、底泥和鱸魚肌肉三種環(huán)境樣品進(jìn)行添加回收分析，比較間接競爭抑制 ELISA檢測和傳統(tǒng)GC-MS檢測結(jié)果。樣品前處理過程如下：水樣經(jīng)過0. 7μπι的Watman GF/ F玻璃纖維濾紙過濾后，加入50% (體積比）的甲醇后在超聲清洗器上超聲lOmin，靜置 30min，離心后取上層清液即可進(jìn)行ELISA檢測。底泥（魚樣）經(jīng)過充分干燥、研磨、篩選后 與無水硫酸1 : 1.2(質(zhì)量比）充分混合；加入合適比例的正己烷與二氯甲烷混合溶劑（V/ V = 2 : 1)，超聲萃取30min，重復(fù)萃取兩次；高純氮氣吹干萃取溶劑后用正己烷作替換溶 劑，并用濃硫酸純化至無色；再用高純氮氣吹干后溶于lmL的甲醇中進(jìn)行ELISA分析。
[0033] 表3 ELISA方法檢測各加標(biāo)環(huán)境樣品中BDE-47
[0034]
[0035] 對水樣、底泥及鱸魚肌肉樣品進(jìn)行平行樣品提取（η > 4)、純化和分析，數(shù)據(jù)處 理結(jié)果見表3。水樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4. 8~11. 8%，底泥相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果為4. 04~ 15. 57 %，魚樣為3. 74~8. 24 %。該檢測方法中各樣品加標(biāo)回收率處分別在66. 20~ 88. 57%，78. 32~84. 15%，75. 23~80. 20%，基本滿足針對于復(fù)雜基質(zhì)中微量或是痕量目 標(biāo)物的回收率要求，證明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，可以滿足對富集后環(huán)境樣品 中PBDEs的檢測要求。
【主權(quán)項】
1. 一種2,2'，4,4' -四溴聯(lián)苯醚（BDE-47)半抗原及其合成方法，其特征在于：選擇 C15H9O3Br3S半抗原，其合成步驟為： (1) 稱取1201. 2mg(5mmol)的磷?；宜崛阴ビ?50ml錐形瓶，加入IOmlTHF,另加 入280mg氫化鈉，在冰浴器中攪動反應(yīng)20min ; (2) 稱取3-溴-4-氟苯甲酸3. 24g(16mmol)，再稱取2,4-二溴苯酉分4g，（16mmol)溶于 20ml二甲基乙酰胺中，反應(yīng)2h ; (3) 稱取已制得的3-溴-4-(2,4-二溴苯氧基）苯甲酸200〇11^(4.61111]1〇1)，與上步驟冷 卻過后的混合物進(jìn)行反應(yīng)3-4h ; (4) 秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H20加入1，4-二氧六環(huán)與水的混合液50ml (體 積比I : 1)中，將合成物質(zhì)水解24h;分離純化后得到白色晶體態(tài)半抗原C15H903Br 3。2. -種2,2'，4,4' -四溴聯(lián)苯醚（BDE-47)半抗原及其合成方法，其特征在于：選擇 C11H13O3NBr2S半抗原，其合成步驟為： ⑴稱取3,5-二溴-2-羥基批陡200mg(0. 79mmol)，加入6-溴己酸乙酯 52. 53mg(l. 58mmol)以及適量無水K2CO3,混合溶于2mL二甲基甲酰胺中，KKTC下反應(yīng)5h ; (2) 秤取1570mg(37. 5mmol)的LiOH · H2O加入1，4-二氧六環(huán)與水的混合液50ml (體 積比I : 1)中，將合成物質(zhì)水解24h; (3) 分離純化后得到淡黃色晶體態(tài)的半抗原CnH1303NBr2。3. -種2, 2'，4,4'-四溴聯(lián)苯醚（BDE-47)的全抗原及其合成方法，其特征在于：以 C15H9O3Br3與BSA偶聯(lián)，C nH1303NBr# OVA偶聯(lián)得到兩種抗原，其合成步驟為： (1) C15H9O3Br3-BSA 的合成：取半抗原 C15H9O3Br3 0· 50mmol (0· 239g)溶于 IOml N， N-二甲基甲酰胺；取N-羥基琥拍酰亞胺0. 50mmol (0. 0584g), N，Ν' -二環(huán)己基碳 0. 55mmol (0. 1035g)，溶于IOml Ν，N-二甲基甲酰胺中，在磁力攪拌下逐滴加到溶有半抗原 的N，N-二甲基甲酰胺中，室溫攪拌反應(yīng)8h，4°C過夜； (2) 將反應(yīng)產(chǎn)物以9000r/min離心15min，上層清液為活性酯； (3) 將適量的牛血清白蛋白溶解于pH為9. 6的碳酸鹽緩沖液配制成15mg/mL的溶液 IOmL ;4°C攪拌下，取IOmL活性酯緩慢地滴加入IOmL的蛋白溶液中，繼續(xù)攪拌4h ; (4) 反應(yīng)后的溶液用0. 9%生理鹽水透析5d ;將透析完成后，將最后透析液冷凍干燥后 保存于_2〇°C。 (5) C11H13O3NBr2-OVA的合成：除蛋白使用卵白蛋白外，步驟與免疫原合成相同。4. 一種2,2'，4,4' -四溴聯(lián)苯醚（BDE-47)的抗血清及其制備，其特征在于：以 C15H9O3Br3-BSA作為免疫原，新西蘭大白兔作為免疫對象，進(jìn)行多次免疫，免疫方法為： (1) 選取體型均一，健康狀況良好的兩制新西蘭大白兔作為免疫對象，用生理鹽水稀釋 適量免疫原C15H9O 3Br3-BSA,并將免疫原溶液與弗氏完全佐劑混合，使免疫原充分乳化。 (2) 取弗氏完全佐劑乳化后的免疫原溶液對兔子進(jìn)行皮下注射，注射后輕柔免疫部位 使免疫原被充分吸收，避免皮下局部組織硬化。 (3) 在第3次加強(qiáng)免疫后，通常將兔耳緣靜脈取血部位周圍的兔毛拔凈，摩擦刺激局 部，使兔耳發(fā)熱，靜脈充血，手術(shù)刀割小口后取約2~3mL血液，靜置離心后，取上清液對現(xiàn) 有抗血清進(jìn)行效價檢測。待效價達(dá)到預(yù)期后，在頸動脈進(jìn)行大量采血。 表1人工抗原生物免疫實施方案5. -種間接競爭抑制ELISA檢測BDE-47方法的建立，其特征在于：將權(quán)利要求1、2、3、 4中所述的BDE-47的半抗原、抗原及抗體應(yīng)用于免疫分析，具體方法為： (1) 以C11H13O3NBr2-OVA作為包被原，以每孔100 μ L的5 μ g/mL的包被原稀釋液包被96 孔酶標(biāo)板，4°C靜置過夜； (2) 將包被液倒凈，向每孔加入350 μ L洗滌液，浸泡lmin，吸去洗滌液，此步驟重復(fù)3 次； (3) 以每孔200 μ L封閉液進(jìn)行封閉，37°C振蕩溫育30min后，將封閉液倒凈，如上洗滌 3次； (4) 加入 50μ LBDE-47 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液（0,0· 025,0· 05,0· 1，0· 25,0· 5,1，5,10,20， 50,100, 200, 500,1000ug/L，）和 50 μ L 抗血清溶液，震蕩 30s 后，37°C振蕩溫育 60min ; (5) 如上封閉后洗滌，加入100 μ L羊抗兔IgG-HRP溶液，37°C振蕩溫育60min ; (6) 如上封閉后洗滌，加入100 μ L底物液，37°C避光振蕩溫育15min ; (7) 加入50 μ L的2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)； (8) 酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各板孔中溶液的吸光度。6. -種使用權(quán)利要求5中建立的檢測方法進(jìn)行實際樣品添加回收實驗的方法，其特征 在于：選擇水、底泥和鱸魚肌肉三種環(huán)境樣品進(jìn)行添加回收分析，比較間接競爭抑制ELISA 檢測和傳統(tǒng)GC-MS檢測的結(jié)果，具體方法如下： (1) 水樣經(jīng)過〇· 7 μ m的Watman GF/F玻璃纖維濾紙過濾后，加入50% (體積比）的甲 醇后在超聲清洗器上超聲l〇min，靜置30min，離心后取上層清液，進(jìn)行ELISA檢測； (2) 底泥（魚樣）經(jīng)過充分干燥、研磨、篩選后與無水硫酸1 : 1.2 (質(zhì)量比）充分混 合；加入合適比例的正己烷與二氯甲烷混合溶劑（V/V = 2 : 1)，超聲萃取30min，重復(fù)萃取 兩次；高純氮氣吹干萃取溶劑后用正己烷作替換溶劑，并用濃硫酸純化至無色；再用高純 氮氣吹干后溶于ImL的甲醇中進(jìn)行ELISA檢測。
【文檔編號】G01N33/53GK105884609SQ201410630814
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月6日
【發(fā)明人】孫紅文, 劉婧婷, 張彥峰
【申請人】南開大學(xué)