一種長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，包括如下步驟：(1)通過培養(yǎng)CHO工程細(xì)胞獲得rhEPO?Fc融合蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)液；(2)將步驟(1)得到的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)深層過濾后采用Mabselect SuRe親和層析進(jìn)行純化；(3)將步驟(2)粗純化得到的rhEPO?Fc融合蛋白液采用Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到高純度的rhEPO?Fc融合蛋白液。本發(fā)明通過Mabselect SuRe?Capto adhere兩步純化工藝純化rhEPO?Fc融合蛋白，得到高純度的rhEPO?Fc，樣品經(jīng)臨床前藥理毒理學(xué)研究，其半衰期比EPO延長了近5倍，而且安全、有效。
【專利說明】
一種長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋 白的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)主要用于治療貧血，是全球最早的重組蛋白藥物之 一，也是迄今技術(shù)成熟、療效確切和全球銷售額最高的基因工程藥物。但由于ΕΡ0半衰期短， 需要頻繁給藥，給病患者增加了的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)也降低了用藥的依從性。
[0003] 開發(fā)長效化藥物，減少病人用藥次數(shù)，成為近年來全球制藥機(jī)構(gòu)的方向之一，國、 內(nèi)外多家公司也都致力于開發(fā)長效ΕΡ0。其中，安進(jìn)公司和羅氏公司相繼于2003年、2007年 成功開發(fā)長效EP0(Aranesp和Mircera)，并在短短幾年迅速擠占了第一代rhEPO產(chǎn)品的部分 市場，有逐步取代傳統(tǒng)ΕΡ0的趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種長效人促紅 細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，將人ΕΡ0基因與裂解活性最低的人IgG2 Fc片段偶聯(lián)，融 合基因插入到載體構(gòu)建成人EPO-Fc表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選出穩(wěn)定、高效表達(dá)重組人 紅細(xì)胞生成素(Fc)融合蛋白的工程細(xì)胞株。細(xì)胞經(jīng)大量擴(kuò)增、分泌表達(dá)EPO-Fc，上清經(jīng)本發(fā) 明的Mabselect SuRe-Capto adhere兩步純化后得到高純度的rhEP〇-Fc，樣品經(jīng)臨床前藥 理毒理學(xué)研究，rhEP〇-Fc的半衰期比ΕΡ0延長了近5倍，而且安全、有效。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:提供一種長效人促紅細(xì)胞生成素融 合蛋白的純化方法，包括如下步驟：
[0006] (1)利用基因工程手段，將裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段基因連接到人促紅細(xì) 胞生成素(hEPO)基因的3'端，利用脂質(zhì)體將含有hEPO-Fc重組基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞;該 CH0細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)rhEP〇-Fc融合蛋白；CH0細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝是:一次擴(kuò) 增培養(yǎng)，共收獲四次含rhEPO-Fc融合蛋白無血清培養(yǎng)液；
[0007] (2)將步驟（1)得到的CH0細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)深層過濾后，采用Mabselect SuRe親和層 析進(jìn)行純化，然后用0.5mol/L Na2HP〇4調(diào)整蛋白溶液的pH到中性，得到粗純化的rhEPO-Fc融 合蛋白液;重復(fù)步驟(2)四次；
[0008] (3)將四次通過步驟（2)得到的粗純化的rhEPO-Fc融合蛋白液混合后采用Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到高純度的rhEP〇-Fc融合蛋白液。
[0009] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟（1)具 體步驟參見中國專利專利號(hào)為ZL200610072229.1，專利名稱:長效人促紅細(xì)胞生成素融合 蛋白及其制備和純化方法。
[0010] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟（2) Mabselect SuRe親和層析具體包括如下步驟：
[0011] 2.1平衡：20mmol/L PB+0.1~lmol/L NaCl，pH6~8,平衡至pH和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示 和平衡緩沖液的一致，流速2~4cm/min;
[0012] 2.2上樣:上樣前紫外吸收值調(diào)零，樣品為步驟（1)得到的rhEPO-Fc融合蛋白液經(jīng) 深層過濾后，直接上樣；
[0013] 2.3淋洗1:20111111〇1/1?8+0.1~1111〇1/1恥(：1印!16~8淋洗至口!1和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示 和淋洗1緩沖液的一致，流速2~4cm/min;
[0014] 2.4淋洗2:2〇111111〇1/11^，？!16~8淋洗至?!1和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和淋洗2緩沖液的一 致，流速2~4cm/min;
[0015] 2.5洗脫：以醋酸緩沖液為洗脫液進(jìn)行洗脫，流速2~4cm/min;
[0016] 2 · 6再生:20mmol/L 醋酸緩沖液，pH3 · 0;
[0017] 2.7調(diào)pH:洗脫下來的樣品用0.5mol/LNa2HP〇4調(diào)pH至中性，用濾器過濾后保存；
[0018] 2.8根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)上清的送樣次數(shù)，重復(fù)步驟2.1-2.7過程。
[0019] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟2.2上 樣時(shí)，Mabselect SuRe的上樣量不超過12mg/ml填料。
[0020] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟2.5洗 脫時(shí)，洗脫條件為以20mm〇l/L醋酸緩沖液為洗脫液，pH為3.6~5.0。
[0021] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟（3) Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析具體包括如下步驟：
[0022] 3 · 1平衡：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH6~8，預(yù)平衡后，再用20mmol/L PB，pH6 ~8，平衡至pH和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和平衡緩沖液的一致，流速2~4cm/min;
[0023] 3.2上樣:樣品為步驟(2)經(jīng)Mabselect SuRe洗脫樣混合稀釋后得到的rhEP〇-Fc融 合蛋白液，流速2~4cm/min上樣；
[0024] 3.3淋洗：2〇111111〇1/1?8，？!16~8，淋洗至?!1和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和淋洗緩沖液的一 致，流速2~4cm/min;
[0025] 3.4洗脫：以PB+NaCl為洗脫液，pH6~8，流速2~4cm/min，收集洗脫液，即得純化的 rhEP〇-Fc融合蛋白液；
[0026] 3 · 5再生：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH6~8，流速2~4cm/min。
[0027] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟3.2上 樣時(shí)，Capto adhere上樣量為8·2~23·35mg/ml填料。
[0028] 本發(fā)明所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其中，所述步驟3.4洗 脫中以20mmol/LPB+80~360mmol/L NaCl為洗脫液進(jìn)行洗脫。
[0029] 實(shí)施本發(fā)明的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，具有以下有益效果：
[0030] (1)通過Mabselect SuRe-Capto adhere兩步純化工藝純化rhEP〇-Fc融合蛋白，得 到高純度的EPO-Fc，樣品經(jīng)臨床前藥理毒理學(xué)研究，EPO-Fc的半衰期比ΕΡ0延長了近5倍，而 且安全、有效。
[0031] (2)本發(fā)明還分別對兩步層析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過合理篩選實(shí)驗(yàn)條件來安排實(shí)驗(yàn)， 研究了上樣量、洗脫條件對目的蛋白的純度和得率的影響，并通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，找出 總體較優(yōu)的純化條件。
[0032] (3)通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，初步確定1&^8616(^3111^的上樣量不超過1211^/1111填料，洗 脫條件為20mmol/L醋酸緩沖液，pH4.0; Capto adhere的上樣量為8.2~23.35mg/ml填料，洗 脫的NaCl濃度為300mmol/L。對此條件進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)驗(yàn)證用SuRe-adhere兩步純化工藝純 化rhEP〇-Fc項(xiàng)目的可行性。
[0033] (4)Mabselect SuRe配基是一個(gè)同型的四聚體配基，其只含有ProteinA的B結(jié)構(gòu) 域，這消除了不同結(jié)構(gòu)域與Fc段親和的差異性，使得洗脫條件更加均一和溫和。而且其還去 掉了對堿敏感的氨基酸，是目前唯一耐堿的ProteinA親和介質(zhì)，堿洗可以降低產(chǎn)品被內(nèi)毒 素污染和批間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，清洗效果更好，有利于延長介質(zhì)使用壽命，同時(shí)也大大降低 了CIP/SIP的成本。所以Mabselect SuRe是一種很適合將來放大生產(chǎn)的改進(jìn)型Protein A填 料。
[0034] (5)Capto adhere用于生產(chǎn)規(guī)模下單克隆抗體的蛋白A后純化，復(fù)合模式配基提供 了不同于傳統(tǒng)離子交換劑的選擇性。Capto adhere能夠在一次純化作用中除去諸如DNA、寄 主細(xì)胞蛋白（HCP)、脫落的A蛋白、二聚物和較大聚集體以及病毒等雜質(zhì)。
【附圖說明】
[0035]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0036] 圖1是實(shí)施例1中第一次Mabselect SuRe層析圖譜；
[0037] 圖2是實(shí)施例1中第一次Mabselect SuRe的HPLC純度測定圖譜；
[0038] 圖3是實(shí)施例1中第二次Mabselect SuRe層析圖譜；
[0039] 圖4是實(shí)施例1中第二次Mabselect SuRe的HPLC純度測定圖譜；
[0040] 圖5是實(shí)施例1中第三次Mabselect SuRe層析圖譜；
[0041 ] 圖6是實(shí)施例1中第三次Mabselect SuRe的HPLC純度測定圖譜；
[0042] 圖7是實(shí)施例1中第四次Mabselect SuRe層析圖譜；
[0043] 圖8是實(shí)施例1中第四次Mabselect SuRe的HPLC純度測定圖譜；
[0044] 圖9是實(shí)施例1中Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析圖譜；
[0045] 圖10是實(shí)施例1中Capto adhere的HPLC純度測定圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下面，結(jié)合附圖以及【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0047] 實(shí)施例1 一種長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，包括如下步驟:
[0048] (1)利用基因工程手段，將裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段基因連接到人促紅細(xì) 胞生成素(hEPO)基因的3 '端，利用脂質(zhì)體將含有hEPO-Fc重組基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CH0細(xì)胞;該 CH0細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)rhEP〇-Fc融合蛋白；CH0細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝是:一次擴(kuò) 增培養(yǎng)，共收獲四次含rhEPO-Fc融合蛋白無血清培養(yǎng)液;所述步驟(1)具體步驟參見中國專 利專利號(hào)為ZL200610072229.1，專利名稱:長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白及其制備和純 化方法。
[0049] (2)將步驟（1)得到的CH0細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)深層過濾后，采用Mabselect SuRe親和層 析進(jìn)行純化，然后用0.5mol/L Na2HP〇4調(diào)整蛋白溶液的pH到中性，得到粗純化的rhEPO-Fc融 合蛋白液；
[0050] 所述步驟(2)Mabselect SuRe親和層析具體包括如下步驟：
[0051 ] 2.1 平衡：20mmol/L PB+150mol/L NaCl，pH7.3,平衡至基線，流速2.5cm/min;
[0052] 2.2上樣:上樣前紫外吸收值調(diào)零，樣品為步驟（1)得到的rhEPO-Fc融合蛋白液經(jīng) 深層過濾后，直接上樣;Mabselect SuRe的上樣量不超過12mg/ml填料。
[0053] 2 · 3淋洗 1:20mmol/L PB+150mol/L NaCl，pH7 · 3淋洗至基線，流速2 · 5cm/min;
[0054] 2.4淋洗2:20mmol/L ΡΒ，ρΗ7·3淋洗至基線，流速2.5cm/min;
[0055] 2.5洗脫：以醋酸緩沖液為洗脫液進(jìn)行洗脫，流速2cm/min;洗脫條件為以20mmol/L 醋酸緩沖液為洗脫液，pH為4.0;
[0056] 2 · 6再生:20mmol/L 醋酸緩沖液，pH3 · 0;
[0057] 2 · 7調(diào)pH:洗脫下來的樣品用0 · 5mol/LNa2HP〇4調(diào)pH至7 · 0，用濾器過濾后保存；
[0058] 2.8根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)上清的送樣次數(shù)，重復(fù)步驟2.1-2.7過程，共重復(fù)四次。
[0059] (3)將四次通過步驟（2)得到的粗純化的rhEPO-Fc融合蛋白液混合后采用Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到高純度的rhEP〇-Fc融合蛋白液。
[0000] 所述步驟(3)Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析，具體包括如下步驟：
[0061 ] 3 · 1平衡：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH7 · 0，預(yù)平衡至基線，再用20mmol/L PB， pH7 · 0，平衡至基線，流速2 · 5cm/min;
[0062 ] 3.2上樣:樣品為步驟(2)經(jīng)1&^8616(^5111^洗脫樣混合稀釋后得到的1'1^?0-?(3融 合蛋白液，上樣;上樣量為8.2-23.35mg/ml填料。
[0063] 3.3淋洗:20mmol/L ΡΒ，ρΗ7·0,淋洗至基線，流速2.5cm/min;
[0064] 3 · 4洗脫：以20mmol/LPB+300mmol/L NaCl，pH7 · 0為洗脫液進(jìn)行洗脫，流速2 · 5cm/ min，收集洗脫液，即得純化的rhEP〇-Fc融合蛋白液；
[0065] 3 · 5再生：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH7 · 0，流速2 · 5cm/min。
[0066] 其中，Mabselect SuRe親和層析的過程及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
[0067] 1.1四次親和層析均用同一Mabselect SuRe層析柱。平衡、上樣、淋洗步驟的流速 均為2.5cm/min，洗脫流速為2cm/min。純化過程參數(shù)如表1所示：
[0068] 表1:四次Mabselect SuRe純化過程
[0069]
[0070] 1.2四次Mabselect SuRe層析圖譜和HPLC純度測定圖譜如1-8圖所示。
[0071] Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析的過程及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
[0072] 緩沖液：Buffer A :20mmol/L ΡΒ，ρΗ7·0
[0073] Buffer B：20mmol/LPB+500mmol/L NaCl,pH7.0
[0074] 2.1預(yù)平衡:層析柱用Buffer B預(yù)平衡228ml，流速2.5cm/min。
[0075] 2 · 2平衡：層析柱用Buffer A平衡447ml，流速2.5cm/min。
[0076] 2.3上樣:樣品是Mabselect SuRe四亞批混合均勾，為了使得上樣液的電導(dǎo)和pH與 平衡液的相接近，故用超純水將混合樣品稀釋后上樣。
[0077] 2 · 4淋洗：用Buffer A淋洗432ml，流速2 · 5cm/min。
[0078] 2.5洗脫：2.5cm/min，A栗是Buffer A，B栗是Buffer 13。60%13洗脫得到的吸收峰 170ml〇
[0079] 2.6 100%B 再生：2.5cm/min，收集吸收峰 42ml〇
[0080] 2.7層析圖譜和HPLC純度測定圖譜如圖9-10所示。
[0081] 實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
[0082] l.Mabselect SuRe中間品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示：
[0083] 表2:Mabselect SuRe數(shù)據(jù)匯總
[0085] 結(jié)果分析:表2顯示，每亞批的純度都在89%以上，得率都是在85%以上。
[0086] 2 .Capto adhere實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示：
[0087] 表3: Capto adhere數(shù)據(jù)匯總
[0089] 結(jié)果分析：表3顯示，通過Capto adhere進(jìn)一步純化出來的樣品純度可以達(dá)到 98.5%，得率是 70%。
[0090] 3.討論
[0091] 按照本發(fā)明確定的SuRe-adhere兩步純化工藝條件，純化CH0細(xì)胞表達(dá)的rhEP〇-Fc 蛋白，總收率可以達(dá)到70%，目的蛋白純度可以達(dá)到98.5%。證實(shí)了SuRe-adhere兩步層析 工藝純化rhEPO-Fc項(xiàng)目有效、簡便、可行。所以最后rhEPO-Fc項(xiàng)目純化工藝流程如下：
[0093]對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 利用基因工程手段，將裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段基因連接到人促紅細(xì)胞生 成素(hEPO)基因的3'端，利用脂質(zhì)體將含有hEPO-Fc重組基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞;該CHO細(xì) 胞經(jīng)培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分泌表達(dá)rhEPO-Fc融合蛋白；CHO細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝是:一次擴(kuò)增培 養(yǎng)，共收獲四次含rhEPO-Fc融合蛋白無血清培養(yǎng)液； (2) 將步驟（1)得到的CHO細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)深層過濾后，采用Mabselect SuRe親和層析進(jìn) 行純化，然后用0.5mo 1/L Na2HPO4調(diào)整蛋白溶液的pH到中性，得到粗純化的rhEPO-Fc融合蛋 白液;重復(fù)步驟(2)四次； (3) 將四次通過步驟(2)得到的粗純化rhEP〇-Fc融合蛋白液混合后采用Capto adhere 復(fù)合型陰離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到高純度的rhEPO-Fc融合蛋白液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟（1)具體步驟參見中國專利專利號(hào)為ZL200610072229.1，專利名稱:長效人促紅細(xì)胞 生成素融合蛋白及其制備和純化方法。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟(2)Mabselect SuRe親和層析具體包括如下步驟： 2.1平衡：20mmol/L PB+0.1~lmol/L NaCl，pH6~8,平衡至pH和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和平 衡緩沖液的一致，流速2~4cm/min; 2.2上樣：上樣前紫外吸收值調(diào)零，樣品為步驟（1)得到的rhEPO-Fc融合蛋白液經(jīng)深層 過濾后，直接上樣； 2.3淋洗1:2〇111111〇1/1?8+0.1~1111〇1/1恥(：14!16~8淋洗至口!1和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和淋 洗1緩沖液的一致，流速2~4cm/min; 2.4淋洗2:20mmol/L PB，pH6~8淋洗至pH和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和淋洗2緩沖液的一致，流 速2~4cm/min; 2.5洗脫：以醋酸緩沖液為洗脫液進(jìn)行洗脫，流速2~4cm/min; 2.6再生:20mmol/L醋酸緩沖液，pH3.0; 2.7調(diào)pH:洗脫下來的樣品用0.5mo I /LNa2HPO4調(diào)pH至中性，用濾器過濾后保存； 2.8根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)上清的送樣次數(shù)，重復(fù)步驟2.1-2.7過程。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟2.2上樣時(shí)，Mabselect SuRe的上樣量不超過12mg/ml填料。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟2.5洗脫時(shí)，洗脫條件為以20mmol/L醋酸緩沖液為洗脫液，pH為3.6~5.0。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟(3)Capto adhere復(fù)合型陰離子交換層析具體包括如下步驟： 3 · 1平衡：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH6~8，預(yù)平衡后，再用20mmol/L PB，pH6~8， 平衡至pH和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和平衡緩沖液的一致，流速2~4cm/min; 3.2上樣:樣品為步驟(2)經(jīng)Mabselect SuRe洗脫樣混合稀釋后得到的rhEP〇-Fc融合蛋 白液，流速2~4cm/min上樣； 3.3淋洗：20mmol/L PB，pH6~8，淋洗至pH和電導(dǎo)率監(jiān)控顯示和淋洗緩沖液的一致，流 速2~4cm/min; 3.4洗脫：以PB+NaCl為洗脫液，pH6~8，流速2~4cm/min，收集洗脫液，即得純化的 rhEPO-Fc融合蛋白液； 3 · 5再生：20mmol/LPB+500mmol/LNaCl，pH6~8,流速2~4cm/min。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟3.2上樣時(shí)，Capto adhere上樣量為8.2~23.35mg/ml填料。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的長效人促紅細(xì)胞生成素融合蛋白的純化方法，其特征在于，所 述步驟3.4洗脫中以20臟〇1/1^+80~360臟〇1/1他(：1為洗脫液進(jìn)行洗脫。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK105884906SQ201610367604
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】葉學(xué)君, 吳思恒, 余燕, 郜富權(quán)
【申請人】東莞太力生物工程有限公司