一種前列腺特異性抗原異構體、編碼基因及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種前列腺特異性抗原異構體、編碼基因及其應用，該蛋白在體外表現(xiàn)明顯的明膠酶的活性功能，該蛋白的缺乏和減少是導致男性不育的重要因素，因此該蛋白可作為男性不育癥的一個新的指標；同時缺乏該蛋白的精子不能完成受精，因此該蛋白也可作為人工輔助生殖IVF和ICSI技術選擇的指標；此外該蛋白也是男性不育癥的重要的藥物篩選靶分子。
【專利說明】
一種前列腺特異性抗原異構體、編碼基因及其應用 (一)
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種精子調控蛋白，特別涉及一種調控人類受精的新型蛋白酶、編碼 基因及其應用。 (二)
【背景技術】
[0002] 受精是精子與卵子融合為一個合子，從而起保證雙親遺傳的關鍵過程。精子離開 精巢時還不具有使卵子受精的能力，還需要兩個獲得性的過程:一是在穿越附睪過程中精 子質膜和內部結構中的蛋白和脂類的改造;二是在穿越雌性生殖道過程中精子表面和內部 的一些修飾，稱作獲能。獲能精子接觸卵周的卵膜或透明帶時，從而激發(fā)精子發(fā)生頂體反應 并有助于精子進一步穿越卵膜。受精發(fā)生在輸卵管壺腹部，精子必須先穿透卵子外周的卵 丘細胞團，當與卵子相遇后，特異地與卵膜上的糖蛋白結合并且開始一系列復雜的受精活 動:精子結合到卵子表面的透明帶(ZP)上;精子發(fā)生頂體反應;從頂體釋放各種有利于精子 穿透透明帶的水解酶;精子最后與卵子質膜融合完成受精。
[0003] 受精過程中有許多精子蛋白酶的參與，大部分屬于絲氨酸蛋白酶家族，包括 Acrosin，TESP5/PRSS21及纖溶酶原激活劑等。Acrosin是一種頂體酶，其生理功能長期以來 都被認為是通過對ZP的蛋白水解作用使精子穿過透明帶，然而Yamagata等的研究表明它的 缺失會導致體外實驗中受精早期精子穿過透明帶的延遲，精子仍能穿越透明帶。TESP5/ PRSS21是另外一種精子絲氨酸蛋白酶，定位在精子膜上作為一種GPI錨定蛋白。缺失Prss21 小鼠(Prss21-/-)的附睪精子在體外實驗中的受精能力嚴重缺陷。
[0004] 世界衛(wèi)生組織已明確指出，正常育齡夫婦同居12個月以上，未采取任何避孕措施 并且有規(guī)律性生活，而仍未受孕即可診為不育。已婚夫婦不育癥發(fā)生率約15%，其中男性因 素引起的不育癥占50%，稱為男性不育。男性不育的首要原因是精子異常(包括弱精癥、少 精癥、畸精癥、無精癥），其次是免疫學因素、男性副性腺感染、性交及射精障礙和原因不明 的不孕等。原因不明性不孕癥是指夫婦有正常性生活，女方有排卵且卵子正常，經婦科檢查 及全面檢查未發(fā)現(xiàn)異常，男方精液及其它檢查均屬于正常范圍，但兩年以上未懷孕者。也就 是說雙方均未查出與不孕有關的原因。據報道，原因不明性不孕的發(fā)生率約占不孕癥的25-30%且出現(xiàn)上升趨勢(Cahill and Wardle，2002)，目前尚未有精卵正常條件下生殖障礙的 檢測的分子指標。自從1978年世界上第一例試管嬰兒Louis Brown在英國誕生以來(Edward et al .，1980)，輔助生殖技術已經成為目前世界上解決不孕癥的主要方法和手段。臨床上 輔助生殖技術中，體外受精試管嬰兒技術(IVF)主要適用于由于女性因素引起的不孕癥，而 單精子胞漿注射技術(ICSI)主要用于男性因素引起的不育癥，通常在IVF失敗條件下使用。 目前在精液常規(guī)正常情況下使用IVF還是直接使用ICSI仍無選擇標準，此外，在治療男性不 育癥的藥物開發(fā)上還沒有明確的篩選靶向分子。 (三)

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種人精子表面調控受精的新型蛋白酶(前列腺特異性抗原異 構體PSA_h)及其編碼基因，本發(fā)明通過RP-HPLC從健康人的精子中分離純化到一種具有明 膠酶活性的蛋白，并鑒定了其氨基酸序列和DNA序列，該蛋白在體外表現(xiàn)明顯的明膠酶的活 性功能。研究明確了該蛋白在男性的前列腺中表達，存在于前列腺、睪丸及精子表面。研究 明確了該蛋白在精卵受精過程中起到重要的調控作用，同時證實其表達量的下降或缺失導 致人受精失敗，也是臨床上導致男性不育的重要因素。
[0006] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種前列腺特異性抗原異構體(PSA_h)，所述前列腺特異性抗原異構 體的氨基酸序列為SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供一種所述前列腺特異性抗原異構體編碼基因，所述編碼基因核苷酸 序列為SEQ ID No.2所示。
[0009] 本發(fā)明涉及一種所述前列腺特異性抗原異構體在制備檢測精子受精障礙試劑中 的應用，所述檢測試劑是指檢測待測樣品前列腺特異性抗原異構體(PSA_h)表達量與標準 樣品表達量（即正常人前列腺特異性抗原異構體(PSA_h)表達量）的差異，顯著低于標準樣 品表達量則判斷為精子受精障礙。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種所述前列腺特異性抗原異構體在制備選擇體外受精或單精子 胞漿注射方法的指標分子試劑中的應用，所述指標分子試劑是指檢測待測樣品前列腺特異 性抗原異構體(PSA_h)表達量與標準樣品表達量(即正常人前列腺特異性抗原異構體(PSA_ h)表達量）的差異，顯著低于標準樣品表達量則判斷為可直接選擇單精子胞漿注射的方法 受精。
[0011] 此外，本發(fā)明還涉及一種所述前列腺特異性抗原異構體在制備男性生殖障礙治療 藥物中的應用。
[0012] 本發(fā)明提供的一種所述前列腺特異性抗原異構體只是在蛋白水平上判斷是否存 在受精障礙的一個指標，但不是最終判斷是否發(fā)病的唯一指標，還需要結合臨床等多因素 綜合確定。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一種調控人類受 精的新型精子蛋白酶及其編碼基因，臨床上該蛋白的缺乏和減少是導致男性不育的重要因 素，因此該蛋白可作為男性不育癥的一個新的指標；同時缺之該蛋白的精子不能完成受精， 因此該蛋白也可作為人工輔助生殖IVF和ICSI技術選擇的指標;此外該蛋白也是男性不育 癥的重要的藥物篩選靶分子。 (四）【附圖說明】
[0014] 圖1為精子洗滌前和洗滌后明膠酶活性的比較;a.精子在洗滌前后的明膠薄層分 析，箭頭表示由精子蛋白酶消化產生的暈輪，標尺為2〇Mi;b.精子在洗滌前后超聲破碎產物 的明膠酶譜，箭頭所示為洗滌后~30kD大小處出現(xiàn)的酶活條帶;c.精子抽提物與精漿體外 孵育后~30kD大小酶活條帶消失，SE = Sperm extract(精子抽提物）；SP = seminal plasma (精漿）；
[0015] 圖2為正常男性和不育男性精子抽提物明膠SDS-PAGE;箭頭所示為~30kD大小處 出現(xiàn)的酶活條帶;normal為正常男性，inf ertile為不育男性；
[0016] 圖3為具有明膠酶活性的30kD蛋白的分離純化;a.人類精子抽提物RP-HPLC色譜 圖；b.VIII、IX部分的明膠活性檢測;c.RP-HPLC色譜圖中VIII、IX部分放大圖；d.明膠-SDS-PAGE對c中各個峰洗脫后樣品的活性檢測；
[0017]圖4為RP-HPLC多次收集的蛋白酶及其質譜測序；a.明膠-SDS-PAGE活性檢測； b. SDS-PAGE，箭頭所指富集的目標蛋白所在位置;c.目標蛋白的質譜測序結果，下劃線表示 測得的肽段序列；
[0018] 圖5為PSA與PSA_h蛋白的比較;a.氨基酸序列比較，下劃線代表信號肽，星號代表 激活肽，▲代表PSA及PSA_h形成二硫鍵的半胱氨酸所在位置，Λ代表PSA_h不具有的半胱氨 酸，數(shù)字代表成熟肽的序號;b.PSA和PSA_h的預測三維結構比較，深色代表β折疊，淺色代表 α螺旋；
[0019] 圖6為PSA_h在精子（sperm)、精衆(zhòng)（seminal plasma)、前列腺(prostate)、睪丸曲 精小管（testis)的定位;a.Virtual Northern blot顯示PSA_h mRNA在各樣品中的表達， Negative表示陰性對照，指PCR過程中只加水不加模板的對照;b.Western blot顯示PSA_h 蛋白在各樣品中的分布;c.PSA_h在精子上的定位，箭頭所示為熒光信號在赤道板和中段， 標尺為20mi; d. PSA_h在前列腺和睪丸曲精小管的定位；
[0020] 圖7為PSA_h及其C末端序列缺失突變體的真核表達和活性分析;a.兩種重組蛋白 的構建簡圖，其中突變體為PSA_h成熟肽的N端186個氨基酸;b.兩種重組蛋白在HEK293T中 的表達，信號代表CFP熒光信號，標尺為100μπι; c.細胞破碎產物的Western檢測，左側表示所 使用的一抗，右側數(shù)字表示分子量大??；d.兩種經過純化、復性的重組蛋白明膠酶活性檢 測;左側數(shù)字表不分子量大小。
[0021 ] 圖8為PSA_h抗體降低了精子對卵子的結合效率圖；a.Mitotracker orange標記的 精子與HTF孵育后(-)再與卵子作用光鏡圖；b.Mitotracker orange標記的精子與HTF孵育 后(-)再與卵子作用焚光顯微鏡下精子信號；c.Mitotracker orange標記的相同濃度的精 子與PSA_h抗體孵育后(+ )再與卵子作用光鏡圖，d.Mi to tracker orange標記的相同濃度的 精子與PSA_h抗體孵育后(+)再與卵子作用焚光顯微鏡下精子信號，標尺為20μηι;
[0022] 圖9為PSA_h抗體阻止了精子穿越透明帶的作用圖；a.用Mitotracker Green標記 經抗體處理過的精子(+，白色箭頭所示），用Mitotracker Orange標記未經抗體處理的精子 (-，圓圈所示）；b.與a為同一顆卵子的不同焦距照片；c.用Mi to tracker Orange標記經抗體 處理過的精子(+，白色箭頭所示），用Mi totracker Green標記未經抗體處理的精子(-，白色 圓圈所示）；d.與c為同一顆卵子的不同焦距照片；圖中白色箭頭均表示在透明帶表面粘附 的經過抗體處理的精子，白色圓圈均表示未經抗體處理的精子在透明帶內部，標尺為20μπι; [00 23]圖10為PSA_h抗體對精子頂體反應率的影響；陰性對照(Negative control)為自 發(fā)頂體反應組，對照（〇〇]11：1'〇1)為用兔陰性]^6處理組，24以8/1111和192以8/1111413為用不同劑 量PSA_h抗體處理組;縱坐標表示已發(fā)生頂體反應的精子百分數(shù)，表示反應體系中未加 孕酮，"+"表示反應體系中加入了孕酮。
[0024]圖11為HPLC分離的天然PSA_h對人卵透明帶的作用;a. HPLC分離得到的PSA_h的明 膠活性驗證，箭頭所示PSA_h降解明膠的位置;b. PSA_h與5yg或0.25yg透明帶蛋白作用1小 時后的帶型，ZP表示透明帶蛋白；c.PSA_h與5yg或0.25yg透明帶蛋白作用24小時后的帶型；
[0025] 圖12為用Western blot比較PSA_h在體外受精正常（Fertile，8例）和體外受精失 敗（Infertile，12例)精子中的表達量(a)，左側箭頭指示PSA_h或Tubulin的蛋白分子大??； IVF失敗的精子仍可通過ICSI使卵子受精后的胚胎發(fā)育圖；4cell:四細胞期;8cell:八細胞 期;Morula:桑椹胚(b)。 (五)【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0027] 實施例1:人類精子上新型蛋白酶的獲得
[0028] 1.精液的采集及精子的獲取
[0029] 所有研究對象禁欲3~7天，手淫法取精，取樣容器一律選用一次性無菌取精杯，取 出精液后將其放置于37°C恒溫水浴中，充分液化后（即為洗滌前精子)進行計算機輔助精液 分析儀(CASA)分析。按《WHO人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》(第四版） 的標準洗滌充分液化后的精液，收集精子沉淀團（即洗滌后精子）。
[0030] 2.精子抽提物的制備
[0031] 對照組(Before wash)為0.5ml液化后精液直接超聲，實驗組(After wash)為加入 0.5ml Earle ' s培養(yǎng)液重懸步驟1中l(wèi)ml精液液化后所得精子沉淀團再進行超聲，超聲破碎 條件：60%功率，超聲3s，間歇3s的方式在冰浴中作用lOmin，隨后在12,000 Xg，4°C，離心 1 Omin。取上清液(即為精子抽提物)存于-20°C備用。
[0032] 3.精漿的制備
[0033] 待精液充分液化后，12，000 X g，25°C，離心15min。取上清液（即精漿)存于-20°C備 用。
[0034] 4.明膠薄層分析(Gelatin substrate film assay)
[0035] 精子對明膠的水解作用通過明膠薄層法進行分析，由于精子頭部所含的蛋白酶對 它周圍的明膠有水解作用，水解的結果使精子頭部周圍形成一圈較透亮的暈輪區(qū)，借助相 差顯微鏡可以對暈輪區(qū)大小進行觀察，具體過程如下：
[0036] (1)明膠薄層的制備：
[0037] a.0.4g明膠溶解在10ml的去離子水中（4%)。
[0038] b.取40μ1均勻地涂布在載玻片上，在4 °C濕盒中水平放置24h，使明膠充分凝固。
[0039] c ·玻片在含0 · 05 %戊二醛的PBS中固定2min。
[0040] d.分別用PBS和去離子水清洗兩次后，4°C存放。
[0041] (2)取40μ1的對照組和實驗組的精子懸液均勻地涂布在明膠薄層上，室溫下水平 放置10min。然后將此明膠板放于濕盒內，37°C反應過夜。明膠板在倒置顯微鏡下觀察。其中 對照組為液化后精液按體積比1:4與Earle's培養(yǎng)液混合均勻的精子懸液，實驗組為步驟1 中獲得的精子沉淀團按體積比1:4與Earle's培養(yǎng)液混合均勻的精子懸液，兩組精子密度調 成IX 106 個/ml。
[0042] 5.明膠SDS-PAGE(Gelatin-SDS-PAGE)
[0043] 在下層分離膠中加入0.1 %明膠的12.5% SDS-PAGE。15yg的精子抽提物上樣，在 20mA，4 °C和非變性條件下進行電泳。電泳結束后，整塊凝膠在含有2.5 % Tri ton X-100的 0.1M Tris-HCl，pH 8.0緩沖液中，在室溫下平衡1.5h。凝膠用0.1M Tris-HCl，pH 8.0緩沖 液充分洗滌幾次后，在含有5mM CaCl2和0.2M NaCl的Tris-HCl緩沖液中于37 °C反應過夜。 按照常規(guī)方法，凝膠用考馬斯亮藍染色，脫色。
[0044] 6.采用步驟4中明膠薄層分析的方法，將對照組和實驗組精子懸液分別鋪在明膠 板上，反應后觀察精子對明膠的水解作用，結果表明精子經過洗滌之后具有更強的明膠降 解圈（圖1中a)。同樣的，將步驟2精子抽提物通過步驟5中明膠電泳的方法比較他們具有酶 活條帶的差異，結果發(fā)現(xiàn)實驗組精子抽提物在約30kD大小處出現(xiàn)了明顯的降解條帶（圖1中 b)。通過將步驟3的精漿與步驟2實驗組精子抽提物體外孵育30min (37 °C )后明膠SDS-PAGE 檢測，我們發(fā)現(xiàn)精漿可以使精子30kD大小的活性條帶受到顯著抑制（圖1中c)。
[0045] 7.采用步驟1、2、5的方法比較不育男性和正常男性的精子抽提物的活性，結果表 明，前者在30kD大小蛋白的酶活要顯著高于后者（圖2)。
[0046] 結論:這種30kD大小的蛋白酶在精漿中處于非活化狀態(tài)，脫離精漿后才表現(xiàn)出活 性，并且它的活性可能對精子的正常受精起到關鍵作用。
[0047] 實施例2:人類精子上新型蛋白酶的分離及鑒定
[0048] 1.應用RP-HPLC，從正常人精子抽提物（實施例1方法獲?。┲蟹蛛x純化30kD蛋白 酶，選用的色譜柱為：Shim-pack CLC-0DS(4.6_ X 250mm);溶劑為含有0.05 %TFA的乙腈； 洗脫條件為溶劑濃度從0-65 %，60min梯度洗脫;流速為lml/min，柱溫箱溫度控制在28°C ; 根據出峰時間收集洗脫液于1.5ml Eppendorf管，然后置于預冷至4°C的真空濃縮儀后開始 濃縮，去除揮發(fā)性液體乙腈并不使洗脫液濃縮干;濃縮后透析于Earle ' s培養(yǎng)液，明膠SDS-PAGE檢測截留液的活性，結果見圖3。
[0049] 2.通過多次收集、濃縮、透析并檢測活性，最后將樣品上樣于SDS-PAGE(圖4中a、 b)，小心地從膠上切下目標條帶后送上海中科新生命生物科技有限公司進行MALDI T0F/ TOF MS測序，序列結果見圖4中c。
[0050] 結論：由圖3可見，2號峰的蛋白是我們想要分離的30kD蛋白酶，具有明顯的水解明 膠的活性，測序結果表明，此蛋白酶是前列腺特異性抗原(PSA)的一種異構體PSA_CRA h(以 下簡寫為PSA_h)，氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，核苷酸序列為SEQIDN0.2所示。
[0051] 實施例3:蛋白三維結構預測
[0052] 將PSA(氨基酸序列如SEQ ID ^).3所示）和？3六_11的氨基酸序列進行比對（圖5中 a)，和PSA-樣，PSA_h具有完全相同的17個氨基酸的信號肽，7個氨基酸的激活肽和N端186 個氨基酸的成熟肽，然而C末端的序列相差甚遠。在PSA的C末端序列中有兩個用于形成二硫 鍵的半胱氨酸，而PSA_h則缺失了這兩個半胱氨酸（圖5中a，A表示），我們推測它可能會形 成與PSA截然不同的三維結構。目前PSA的三維結構已經解析，PSA具有兩個明顯的β折疊桶 結構域(Α1及Α2)。第一個結構域Α1由7個β折疊組成，第二個結構域Α2由6個β折疊和11個氨 基酸殘基形成的長α螺旋組成。我們利用三維結構在線預測軟件Protein Homology/ analogY Recognition Engine V 2·0(http://www.sbg.bio·ic.ac.uk/phyre2)對PSA_h進 行了預測，結果見圖5中b。
[0053] 結論：由圖5中b可見，PSA_h不具有結構域A2中的β折疊桶和長α螺旋結構。結果表 明PSA_h有著不同于PSA的結構，預示可能具有不同的功能。
[0054] 實施例4: PSA_h的表達特征和蛋白分布研究
[0055] 1.利用Virtual Northern blot技術檢測PSA_h基因的表達情況，結果見圖6中a。
[0056] 抽提精漿(實施例1步驟3制備的精漿）、精子(實施例1步驟1制備的精子沉淀團）、 前列腺組織和睪丸曲精小管的RNA，Superscript?/First-strand cDNA synthesis kit將 其逆轉錄后制備得到的c D N A作為擴增模板，利用引物P S A _ h _ P F : 5 ' -TCTTGACCCCAAAGAAACTT-3 ' 和 PSA_h_PR: 5 ' -CGAGCAGGTGCTTTTGCC-3 ' PCR 擴增后的產物制備 探針，而后用DIG標記。
[0057] PCR反應體系為：
[0059] 反應條件為：94°C預變性5min;94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，進 行30個循環(huán);最后72°C延伸lOmiruPCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0060] 2.抗體的制備:在華安生物科技有限公司合成了多肽(VSHPYSQDLEGKGEWGPC，此段 序列位于PSA_h的187-203位，可區(qū)別于PSA異構體及其他基因）免疫兔子制備了多克隆抗 體。經Wes tern b lot檢測，該抗體具有很高的特異性。
[0061] 3.將睪丸曲精小管和前列腺組織分別凍于液氮中，于液氮中研磨成粉末后，使用2 XProtein loading buffer溶液提取總蛋白。按照實施例1中步驟1獲得的正常人洗滌后精 子沉淀團同樣用2XProtein loading buffer溶液提取總蛋白，將上述三種樣品充分振蕩， 混勻，12，000 X g，離心1 Omin，上清即為總蛋白。精漿的樣品是通過實施例1中步驟3獲得的 精衆(zhòng)與2 XProtein loading buffer混合后制備的，用分光光度計測定蛋白濃度。通過 Western b 1 〇t的方法，確定PSA_h在精漿、精子、前列腺和睪丸曲精小管的表達，結果見圖6 中b〇
[0062] 4.利用免疫熒光的方法確定PSA_h在精子上的定位，利用免疫組化的方法確定該 蛋白在前列腺和曲精小管的定位，結果分別見圖6中c和6中d。
[0063] 結論：由圖6可見，PSA_h在前列腺的表達量最高，在睪丸中表達量較低。在精漿或 精子上無表達;PSA_h蛋白在精子、前列腺和睪丸中均有分布，而在精漿中沒有分布;PSA_h 定位于精子的赤道板和中段;PSA_h定位于前列腺的上皮細胞和睪丸曲精小管中的各種生 精細胞。表明PSA_h在生殖系統(tǒng)中可能發(fā)揮著某種功能。
[0064] 實施例5:PSA_h及PSA_h C末端缺失突變體(只具有1-186個氨基酸的成熟肽序列） 的真核表達
[0065] 1.真核表達質粒的構建
[0066]為了驗證PSA_h蛋白是否具有明膠酶活性以及C末端的缺失是否會對整個PSA_h的 功能造成損害，我們利用真核細胞系Η E K 2 9 3 T進行重組表達。抽提前列腺組織的R N A， Superscrip?/First-strand cDNA synthesis kit將其逆轉錄后制備得到的cDNA作為擴增 模板，PSA_h質粒構建的正向引物wild type F:CCGCTCGAGATGCACCACCACCACCACCACATTGTGG GAGGCTGGGAGTGCGAG(5'端帶有Xho頂每切位點，加粗代表引入的6 X His標簽，下劃線代表 PSA_h成熟肽開始序列），反向引物wild type R:CGCGGATCCcgAGGTCCCCACTCACCTTTCCC； PSA_h C末端缺失突變體的正向引物也是wild type F，反向引物mutant type R: CGCGGATCCcgCGAGCAGGTGCTTTTGCCCCCTGT(5 '端帶有BamH I酶切位點），擴增產物經過雙酶 切連接入含有CFP標簽的真核表達載體pECFP-Nl中。質粒抽提，雙酶切，DNA連接，E. co 1 i細 胞轉化，測序。我們采用QIAGEN plasmid midi試劑盒提供的方法從大腸桿菌培養(yǎng)物中提取 適合轉染細胞用的無內毒素質粒。
[0067] PCR反應體系為：
[0069] 反應條件為:94°C預變性5min;94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，進 行30個循環(huán);最后72°C延伸lOmiruPCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
[0070] 2.細胞的轉染
[0071]當人胚腎上皮細胞系HEK293T匯合度達90%左右時，使用&?抑(^6116轉染試劑進 行細胞轉染，對于每孔(6孔板)細胞，分別取1.2yg質粒DNA(步驟1構建），4.5μ1 attractene 轉染試劑稀釋于100μΙ無胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中，輕輕混勻；室溫放置20min后加 入到含有10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基中。將細胞置于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48h后使用熒光顯微鏡進行觀察并收集細胞。
[0072] 3.表達產物的分離純化
[0073]由于PSA_h及PSA_h C末端缺失突變體的表達產物帶His標簽，我們采用Ni-NTA純 化系統(tǒng)，在非變性條件下進行分離純化。具體過程如下：步驟2中收集的HEK293T細胞用 Lysis Buffer懸浮，超聲破碎儀破碎后，收集可溶性上清。將可溶性上清加到Ni-NTA中，再 置于冰箱中旋轉混合器上輕微混合lh，使重組蛋白充分地與Ni-NTA相作用。500 X g，離心 20sec后，Ni-NTA用Wash Buffer充分洗滌兩次，棄上清。再次500 Xg，離心20sec后，棄去微 量殘留上清，Ni-NTA用Elution Buffer洗滌三次，每次500Xg，離心20sec后保留上清，上清 為含有重組蛋白的洗脫液。SDS-PAGE分析表達蛋白的分離純化情況。
[0074] 4.pECFP-Nl_PSA_h wild及mutant的復性
[0075] 由于上述步驟3中兩種重組蛋白分離純化過程中引入了咪唑，為了排除此物質對 蛋白活性的影響，我們采用一套復性緩沖液對這些重組蛋白進行復性和天然構象的恢復。 具體過程如下：
[0076] (1)透析袋的處理：
[0077] 剪取合適長度的透析袋，分別置于溶液1(含質量濃度8%NaHC03的0.5M EDTA水溶 液，pH 8.0)和溶液2(0.5M EDTA水溶液，pH 8.0)中各煮沸l(wèi)Omin，然后用去離子水徹底清 洗，備用。
[0078] (2)將步驟3中用Elution Buffer洗脫的重組蛋白洗脫液放入透析袋中，于50mM Tris-HCl，pH 8 · 0緩沖液，4°C透析過夜，以交換Buffer。
[0079] 結果見圖7。
[0080] 結論:兩種重組蛋白在HEK293T細胞中得到了成功地表達，重組PSA_h蛋白確實具 有明膠酶的活性，并且降解條帶大小與融合蛋白大小吻合。此外，PSA_h的C末端序列缺失的 突變體蛋白也具有降解明膠的活性，表明C末端序列對維持PSA_h的明膠降解活性不是必需 的。
[0081 ]實施例6 :PSA_h的體外功能研究
[0082] 1 .PSA_h抗體對于精子結合卵子能力的影響
[0083] (1)按實施例1方法收集精液，于37 °C恒溫培養(yǎng)箱放置30-60min以充分液化；
[0084] (2)上游法:取lml液化后的精液置于15ml的無菌錐形離心管中，在精液上方輕緩 加入1.2ml HTF培養(yǎng)液形成液層，傾斜45°后放入37 °C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育lh使精子上游； 輕輕將試管豎直，吸取最上層0.5ml液體其中包含高活力的精子；用0.5ml HTF培養(yǎng)液稀釋， 以500g離心5min，然后棄去上清液，獲得精子團；
[0085] (3)用500μ1 HTF培養(yǎng)液重懸精子團，等體積分成兩份，加入Mitotracker Orange 染料，37°C避光處理15min;
[0086] (4)500g離心5min，沉淀各用100μΙ HTF培養(yǎng)液懸浮；
[0087] (5)Mitotracker Orange標記的精子等分成兩份，一份用實施例4步驟2中制備的 132μg/ml PSA_h抗體處理，另一份加入等體積的HTF培養(yǎng)液，輕微混合后在37°C二氧化碳培 養(yǎng)箱孵育lh;
[0088] (6)在孵育結束前將卵母細胞轉移至20μ1預熱的HTF培養(yǎng)液中，然后將步驟5中10μ 1 Mitotracker Orange標記并用PSA_h抗體或HTF處理的精子等體積混合到卵母細胞培養(yǎng) 液滴中，輕輕混合均勻；
[0089] (7)在37°C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4h，將卵母細胞轉移至新鮮的HTF培養(yǎng)液洗滌4次 以去除非特異性結合的精子，熒光顯微鏡觀察結果。結果見圖8。
[0090] 結論:正常精子經過PSA_h抗體處理后與卵子的結合效率顯著降低。
[0091 ] 2. PSA_h抗體對于精子穿透透明帶的作用 [0092] (1)按照步驟1中上游法獲取精子；
[0093] (2)用0.5ml HTF培養(yǎng)液稀釋，以500g離心5min，然后棄去上清液，獲得精子團；
[0094] (3)用500μ1 HTF培養(yǎng)液重懸精子團，等體積分成兩份，分別加入Mitotracker Orange 或 Green染料，37 °C 避光處理 15min;
[0095] (4)500g離心5min，沉淀各用100μΙ HTF培養(yǎng)液懸??；
[0096] (5)Mitotracker Orange標記的精子等分成兩份，一份用132μg/ml PSA_h抗體處 理，另一份加入等體積的Η T F培養(yǎng)液，輕微混合后在3 7 °C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育1 h ; Mitotracker Green標記的精子也以相同方式操作；
[0097] (6)在孵育結束前將卵母細胞轉移至20μ1預熱的HTF培養(yǎng)液中，然后將步驟(5)中 10μ1 Mitotracker Green標記并用PSA_h抗體處理的精子和Mitotracker Orange標記并用 HTF處理的精子等體積混合到卵母細胞培養(yǎng)液滴中，輕輕混合均勻；另一組（圖9中c和d)則 是步驟（5)中10μ1 Mitotracker Orange標記并用PSA_h抗體處理的精子和Mitotracker Green標記并用HTF處理的精子等體積混合到另一顆卵母細胞培養(yǎng)液滴中，同樣輕輕混合均 勻；
[0098] (7)在37 °C二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4h，將卵母細胞轉移至新鮮的HTF培養(yǎng)液洗滌20次 以去除非特異性結合的精子，4%多聚甲醛避光固定過夜，次日早上共聚焦顯微鏡觀察結 果。結果見圖9。
[0099] 結論:正常精子經過PSA_h抗體處理后無法穿越卵子的透明帶。
[0100] 3.PSA_h對精子頂體反應的影響
[01 01 ]利用步驟1中上游法獲取可育男性的精子，在含有質量濃度3.5 % BSA的HTF培養(yǎng)基 中放置5小時獲能，隨后用不含BSA的HTF培養(yǎng)基洗滌精子。洗滌過的精子單獨與兔源IgG(對 照組）和不同劑量的PSA_h抗體（24μg/ml和192μg/ml)孵育30min，隨后用15μΜ的孕酮作用 15min(陰性對照除外，陰性對照為不加孕酮的自發(fā)頂體反應組）。頂體反應的狀態(tài)由FITC標 記的豌豆凝集素區(qū)分。未發(fā)生頂體反應的精子在頂體區(qū)會有明亮的染色，而已發(fā)生頂體反 應的精子熒光僅限于赤道板或無熒光信號。每組樣本計數(shù)200顆精子。結果見圖10。
[0102]結論:正常精子經過PSA_h抗體處理后頂體反應率也大大降低。
[0103] 4.PSA_h對透明帶的降解作用
[0104] (1)透明帶蛋白的獲取:GV期卵子在含有體積濃度0.5%Triton X-100的50mM PBS (pH 7.4)中輕輕搖動過夜(4°〇，1500(^離心1511^11，取上清液備用。
[0105] (2)利用實施例2步驟1中通過HLPC獲得的PSA_h經蛋白透析后，與透明帶蛋白在37 °C、50mM roS(pH 7.4)中孵育1小時或24小時。孵育結束后，不經過煮沸步驟在非還原條件 下進行SDS-PAGE，并用銀染法對蛋白條帶進行染色。結果見圖11。
[0106] 結論:PSA_h作為酶本身并不能降解透明帶蛋白。表明PSA_h是通過調控精子頂體 反應來調節(jié)精子穿越透明帶的能力的。
[0107] 實施例7: PSA_h在臨床樣本中的Western檢測
[0108] 我們選取8例體外受精成功的男性精子和12例體外受精失敗的男性精子，利用 Western blot的方法檢測PSA_h量的差異。精子的處理方法為:簡單洗滌之后用2 X loading buffer充分研磨，沸水中處理10min，12，000g離心10min，取上清用分光光度計定量后行 Western blot檢測。檢測結果見圖12，b說明這些體外受精失敗的精子可以通過ICSI的方法 使卵母細胞正常受精，受精卵能正常發(fā)育。
[0109] 結論：由圖12可見，體外受精失?。↖nfertile)這組相比于體外受精成功 (Fertile)的精子樣本中，PSA_h的表達量明顯下降。然而這些體外受精失敗的精子通過單 精子胞漿注射(ICSI)仍能使卵子正常受精，受精率為61.8%，妊娠率為53.8% (臨床數(shù)據）。 表明PSA_h在臨床上可以作為男性不育癥篩查的一個分子Marker，蛋白的缺失并不影響精 子自身的受精能力，可以采用ICSI的方法進行臨床治療。
【主權項】
1. 一種前列腺特異性抗原異構體，其特征在于所述前列腺特異性抗原異構體的氨基酸 序列為SEQ ID No. 1所示。2. -種權利要求1所述前列腺特異性抗原異構體編碼基因，其特征在于所述編碼基因 核苷酸序列為SEQ ID No.2所示。3. -種權利要求1所述前列腺特異性抗原異構體在制備檢測精子受精障礙試劑中的應 用。4. 一種權利要求1所述前列腺特異性抗原異構體在制備選擇體外受精或單精子胞漿注 射方法的指標分子試劑中的應用。5. -種權利要求1所述前列腺特異性抗原異構體在制備男性生殖障礙治療藥物中的應 用。
【文檔編號】C12N9/64GK105886490SQ201610317306
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】楊衛(wèi)軍, 錢葉青
【申請人】浙江大學