一種雙光子甲醛熒光探針及其制備與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙光子甲醛熒光探針及其制備與應(yīng)用，是一種基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制的以1,8?萘酰亞胺為雙光子熒光團(tuán)的新型甲醛類探針。探針分子具有良好的光穩(wěn)定性以及很大的斯托克位移，該探針在中性緩沖液中能夠很好檢測甲醛濃度，同時相對于其他醛類化合物，探針對甲醛具有很好的專一性。雙光子共聚焦熒光顯微鏡成像實驗很好地證明了探針能夠滲透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中且能夠在細(xì)胞中檢測甲醛濃度的變化，為研究細(xì)胞中甲醛的生理作用提供一種有效的研究工具。
【專利說明】-種雙光子甲酵黃光探針及其制備與應(yīng)用 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測細(xì)胞內(nèi)甲醒的雙光子巧光染料，具體設(shè)及基于1,8-糞酷亞胺 的新型雙光子甲醒類巧光探針的制備方法及應(yīng)用。 (二)【背景技術(shù)】
[0002] 甲醒作為一種公認(rèn)的致癌物質(zhì)，主要來源有=:一類是來源于工業(yè)生產(chǎn)，一類來自 于自然界的釋放，一類是來源于內(nèi)源性的甲醒，例如氧化酶、嗜中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶等 生物反應(yīng)就能釋放甲醒。在正常的人體血液中，甲醒濃度就可達(dá)到0.1 mM左右。但是體內(nèi)過 量的甲醒能夠引起呼吸道慢性疾病、胚胎崎形、阿茲海默病和癌癥等等。在現(xiàn)階段的甲醒檢 測方法當(dāng)中，大多是檢測空氣中的甲醒，國內(nèi)外報道的檢測細(xì)胞內(nèi)甲醒的探針還是寥寥無 幾。目前能夠?qū)Ｒ恍詸z測細(xì)胞內(nèi)甲醒的主要方法有兩種，一種是氨基與甲醒反應(yīng)后，隨后自 發(fā)發(fā)生2-氮雜-柯普重排W及水解，生成信號增強(qiáng)的效果;另一種利用阱和甲醒反應(yīng)生成產(chǎn) 物達(dá)到巧光信號變化的效果。基于雙光子染料低細(xì)胞毒性、高穿透性等優(yōu)點(diǎn)，我們設(shè)計并合 成了一種Wl ,8-糞酷亞胺為母核的雙光子的甲醒類巧光探針，運(yùn)類探針能夠成功檢測甲醒 溶液W及細(xì)胞內(nèi)甲醒濃度的變化。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種1,8-糞酷亞胺的新型雙光子甲醒類巧光探針及其制備方 法與用途。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種式(I)所示雙光子甲醒巧光探針，
[0006]
[0007]本發(fā)明還提供一種所述雙光子甲醒巧光探針的制備方法，所述方法為:將式(4)所 示化合物溶于甲醇中，冰浴至(TC,加入7mol/L氨甲醇溶液，(TC下反應(yīng)半小時，隨后加入丙 締基棚酸鄰二叔醇醋，室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)液分離純化，獲得所述雙光子甲醒巧光探針；
[0008；
[0009]進(jìn)一步，所述式(4)所示化合物與丙締基棚酸鄰二叔醇醋物質(zhì)的量之比為1:2,所 述氨甲醇溶液用量W氨物質(zhì)的量計，所述式(4)所示化合物與氨物質(zhì)的量之比為1:10。
[0010 ]進(jìn)一步，所述甲醇體積用量W式(4)所示化合物物質(zhì)的量計為1 OmL/mmo 1。
[0011] 進(jìn)一步，所述反應(yīng)液分離純化方法為:反應(yīng)液減壓旋蒸去除溶劑，取濃縮物進(jìn)行娃 膠柱分離，W體積比20:1的二氯甲燒甲醇混合液為洗脫劑，收集目標(biāo)組分，干燥，獲得所述 雙光子甲醒巧光探針。
[0012] 本發(fā)明還提供一種所述雙光子甲醒巧光探針在檢現(xiàn)巧醒中的應(yīng)用，所述甲醒為扣 mo 1 /L~Smmo 1 /L甲醒水溶液（優(yōu)選0.25~SmM )，所述甲醒為細(xì)胞內(nèi)扣mo 1/L~Smmo 1 /L甲醒 (優(yōu)選2~5mM)，所述細(xì)胞為子宮頸癌細(xì)胞化La。所述甲醒檢測限為如mol/L。
[0013]當(dāng)檢測溶液中甲醒時，所述檢測方法是將探針溶液加入憐酸緩沖液（IOmM pH = 7.4)中，再加入甲醒水溶液，所述探針溶液為ImM探針二甲基亞諷溶液，所述探針溶液與甲 醒水溶液體積比為1: 2，所述甲醒終濃度為扣mo 1 /L~5mmo 1 /L，即檢測范圍為扣mo 1 /L~ 當(dāng)檢測細(xì)胞中甲醒時，檢測范圍為如mol/L~5mmol/L。
[0014] 反應(yīng)路線如下：
[0015：
[0016] 本發(fā)明所述化合物(I)可作為雙光子巧光探針，應(yīng)用于甲醒的巧光檢測。所述的甲 醒濃度的巧光檢測的方法為：W化合物（I)作為巧光探針，與PBS緩沖溶液中的甲醒進(jìn)行反 應(yīng)，生成中間產(chǎn)物，隨后2-氮雜-柯普重排W及水解，生成巧光物質(zhì)4,測定在激發(fā)為350nm下 的巧光強(qiáng)度變化，從而獲得甲醒濃度。
[0017] 其次，W化合物（I)作為巧光探針，與化La細(xì)胞進(jìn)行解化，然后加入外源甲醒進(jìn)行 巧光成像，激發(fā)波長為720nm，發(fā)射波長為425nm到470nm。
[0018] 本發(fā)明巧光探針的結(jié)構(gòu)中W3號位的取代基的改變，實現(xiàn)推-拉電子能力的變化， 從而達(dá)到吸收光譜W及發(fā)射波譜藍(lán)移的效果。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明選用的1,8-糞酷亞胺結(jié)構(gòu) 是個雙光子巧光團(tuán)，具有良好的光穩(wěn)定性W及很大的斯托克位移。我們合成的探針對甲醒 水溶液具有很好的特異性，在生物細(xì)胞成像時選用長波長的激發(fā)波長，降低細(xì)胞自身巧光 背景，穿透能力強(qiáng)，對細(xì)胞損傷小，能夠檢測細(xì)胞內(nèi)甲醒的濃度，最低檢測限為扣M，為研究 細(xì)胞中甲醒的生理作用提供一種有效的研究工具。 (四）
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明中探針(I)的核磁氨譜。
[0021] 圖2為本發(fā)明中探針（I)的核磁碳譜。
[0022] 圖3為本發(fā)明中探針（I)在抑為7.4條件下加入OmM和5mM甲醒水溶液濃度的紫外吸 收光譜，曲線（I) +甲醒是指探針(I)加入5mM甲醒水溶液，曲線（I)是指探針（I)加入OmM甲醒 水溶液。
[0023] 圖4為本發(fā)明中探針（I)在pH為7.4激發(fā)波長為450nm條件下加入不同甲醒水溶液 濃度下的巧光光譜，曲線（I)是指探針(I)加入OmM甲醒水溶液。
[0024] 圖5為本發(fā)明中探針（I)在pH為7.4激發(fā)波長為350nm條件下加入不同甲醒水溶液 濃度下的巧光光譜。
[0025] 圖6為本發(fā)明中探針（I)在抑為7.4激發(fā)波長為350nm發(fā)射波長為510nm條件下加入 0.5mM甲醒水溶液下的時間巧光變化圖。
[0026] 圖7為本發(fā)明中探針（I)在pH為7.4激發(fā)波長為350nm條件下加入甲醒和不同生物 相關(guān)活性小分子的巧光光譜。
[0027] 圖8為本發(fā)明中探針（I)在不同抑值激發(fā)波長為350nm發(fā)射波長為510nm條件下加 入OmM和5mM甲醒濃度的巧光變化，（I)是指探針（I)加入OmM甲醒水溶液。
[0028] 圖9為本發(fā)明中探針(I)和化合物4的密度泛函數(shù)計算。
[0029] 圖10為本發(fā)明中探針（I化抑為7.4的條件下加入ImM后不同時間段的高效液相色 譜圖。
[0030] 圖11為本發(fā)明中探針（I)在子宮頸癌細(xì)胞化eLa)中的雙光子共聚焦巧光成像效果 圖，（a)(d)(g)分別表示激發(fā)光為720nm時0、2、5mM甲醒濃度解化下細(xì)胞的雙光子共聚焦巧 光成像效果圖；（b) (e)化)分別表示0、2、5mM甲醒濃度解化下細(xì)胞的細(xì)胞明場效果圖；（C) (f)(i)分別表示(a)和(b)、（d)和(e)、（g)和化)的疊加效果圖。 (五)
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0032] 參照文獻(xiàn)（J.Fang, J Am 化em Soc ,2015,137,757-769，S.-K.化ang,Dyes and Pigments)的合成方法，按照合成路線分別合成結(jié)構(gòu)式(2 )、（ 3)和(4)的中間產(chǎn)物。
[003；
[0034]實施例1探針(I)的合成
[00巧]在50mL的圓底燒瓶中，加入148mg化合物4(0.5mmo 1)溶于5mL甲醇中，冰浴至(TC， 加入0.72mL氨甲醇溶液(7mo 1 /L Smmo 1)，(TC下反應(yīng)半小時，隨后加入168mg丙締基棚酸鄰 二叔醇醋（Immol)。反應(yīng)轉(zhuǎn)至室溫且過夜，混合液減壓旋蒸去除溶劑，取濃縮物進(jìn)行硅膠柱 分離（W體積比20:1的二氯甲燒：甲醇混合液洗脫），得到產(chǎn)物118mg，產(chǎn)率70%。核磁氨譜見 圖1，核磁碳譜見圖2。
[0036] iHMffi(500MHz，d6-DMS0)S:8.43(d，J = 7.8，lH)，8.25(d，J = 7.0，lH)，8.03(s, lH),7.35(t J = 7.6,lH),5.72(ddt J=13.8,10.1,6.8,lH),5.06(dd J = 25.4,13.6,2H), 4.50-4.32(m,lH),4.09-3.94(m,2H),2.88-2.75(m,lH),2.74-2.63(m,lH),1.64-1.49(m, 2H)，1.39-1.26(m，2H)，0.92(t，J=7.4,3H)〇Uc 醒R(126MHz，d6-DMS0)S:175.4，164.2， 162.7,134.0,130.9,130.2,127.4,121.4,120.8,118.1,98.5,52.5,38.6,36.4,30.1, 20.0，13.9.ESI calcd.for C20肥202N3(M+H)339.2，found 339.2。
[0037] 實施例2探針(I化抑為7.4條件下加入OmM和5mM甲醒濃度的紫外吸收光譜測定
[0038] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（IOmM抑=7.4)，分別加入化L超純水和化L、500ml甲醒 水溶液，37°C下反應(yīng)3小時后，測定兩個混合液的紫外吸收光譜，結(jié)果見圖3。
[0039] 實驗證明，糞酷亞胺類染料的3位上推-拉電子的能力的不同能夠影響化合物的吸 收光譜，由于醒基的拉電子能力比較強(qiáng)，所W探針（I)與甲醒反應(yīng)后的產(chǎn)物的吸收光譜有個 藍(lán)移的過程，最大吸收波長從440nm降到了 370nm。
[0040] 實施例3探針（I)在pH為7.4激發(fā)波長為450nm條件下加入不同當(dāng)量甲醒濃度下的 巧光效果檢測。
[0041] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（1 OmM抑=7.4)，分別加入化L不同濃度甲醒水溶液(最 終甲醒在水中的濃度分別為OmM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM、5mM)，37°C下反應(yīng)3小時后，測定 其巧光值。激發(fā)波長為450nm，發(fā)射波長為480-740nm，巧光譜圖見圖4。
[0042] 實驗證明，在增加甲醒當(dāng)量的情況下，由于醒基的拉電子能力比較強(qiáng)，在激發(fā)波長 為450nm時，探針（I)與甲醒反應(yīng)后的產(chǎn)物的發(fā)射光譜有個藍(lán)移的過程，最大發(fā)射波長從 550nm降到了 520nm。
[0043] 實施例4探針（I)在pH為7.4激發(fā)波長為350nm條件下加入不同當(dāng)量甲醒濃度下的 巧光效果檢測。
[0044] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到394化憐酸緩沖液（IOmM抑=7.4)，分別加入化L不同濃度的甲醒水溶液 (最終甲醒在水中濃度分別為〇1111、〇.251111、0.5111]\1、1111]\1、21111、51111)，37°(：下反應(yīng)3小時后，測定 其巧光值。激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為440-740nm，巧光譜圖見圖5。
[0045] 實驗證明，在激發(fā)波長為350nm的條件下，能夠觀察到隨著甲醒濃度的提高，巧光 強(qiáng)度也能隨之增大，檢測限為如M。
[0046] 實施例5探針（I)在pH為7.4條件下加入100倍當(dāng)量甲醒濃度的時間與巧光效果的 關(guān)系檢測
[0047] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（IOmM抑=7.4)，加入化L甲醒水溶液(最終甲醒在水中 的濃度為〇.5mM)，37°C下反應(yīng)，在不同時間點(diǎn)（分別為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、8、9、23、24、 25h)測定其巧光值。激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為510nm，巧光譜圖見圖6。
[0048] 實驗證明，隨著時間的流逝，巧光強(qiáng)度也能隨之增強(qiáng)，符合探針檢測甲醒的效果。
[0049] 實施例6探針(I)在抑為7.4條件下的選擇性實驗
[0050] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L憐酸緩沖液（1 OmM抑=7.4)，分別加入化L甲醒水溶液(最終甲醒在 水中的濃度均為1mmol/L)和生物相關(guān)活性小分子水溶液化醒、丙酬醒、4-甲基苯甲醒、4- 硝基苯甲醒、苯甲醒、雙氧水、谷脫甘膚、半脫氨酸、高半脫氨酸、丙酬酸鋼、葡萄糖，最終濃 度均為lmmol/L)，37°C下反應(yīng)3小時，測定其巧光值。激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為440- 740nm，巧光譜圖見圖7。
[0051] 實驗證明，探針(I)的抗干擾能力十分好，即對甲醒的專一性比較好。
[0052] 實施例7探針(I)在不同pH值下的檢測性能實驗
[0053] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取化L加入到39化L不同抑值的巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖液(抑分別為3.4、4、4.6、5.2、 5.8、6.4、7、7.4、8)，分別加入化1不同濃度的甲醒水溶液(最終甲醒在水中的濃度分別為0 和lmmol/L)，37°C下反應(yīng)3小時，在不同抑值條件下測定其巧光值。激發(fā)波長為350nm，發(fā)射 波長為510nm，巧光譜圖見圖8。
[0054] 實驗證明，在抑中性或偏堿性時，抑的變化對探針（I)的影響不大，即探針（I)能夠 在中性的生物體內(nèi)檢測甲醒的濃度。
[0055] 實施例8探針(I)和化合物4的密度泛函數(shù)計算
[0056] 利用高斯09軟件計算探針(I)和化合物4的密度泛函數(shù)，結(jié)果見圖9。
[0057] 實驗證明，通過高斯09計算，進(jìn)一步證明了探針與甲醒反應(yīng)后產(chǎn)物的巧光最大發(fā) 射波長是藍(lán)移的。
[0058] 實施例9探針(I)在抑為7.4的條件下與甲醒反應(yīng)的中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物效果分析
[0059] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為ImM的探針母液，用移液 槍吸取80化加入到31化L憐酸緩沖液（IOmM pH=7.4)，隨后加入化L甲醒水溶液(最終甲醒 在水中的濃度為lmmol/L)37°C下反應(yīng)，分別在0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、她時取樣，然后利 用高效液相色譜分析。高效液相譜圖見圖10。
[0060] 高效液相色譜分析條件為:利用C18柱，洗脫條件為從100%乙臘梯度到100%水， 每次液相時間均為15分鐘。
[0061] 實驗證明，我們描述的探針（I)與甲醒反應(yīng)的機(jī)理是正確的。探針（I)與甲醒先生 成中間產(chǎn)物1、2,然后經(jīng)過2-氮雜-柯普重排W及水解生成最終物質(zhì)4。
[0062] 實施例10探針(I)在子宮頸癌細(xì)胞化eLa)中的成像分析
[0063] 準(zhǔn)確稱取一定量的探針（I)，用二甲基亞諷配制成濃度為IOmM的探針母液。子宮頸 癌細(xì)胞化La接近1 X IO5個細(xì)胞培養(yǎng)接種在共聚焦盤中，由DMEM培養(yǎng)基在37°C、5%C02條件下 進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后，棄去培養(yǎng)基。將化L探針加入到199祉L新鮮DMEM培養(yǎng)基中，混 合均勻后加入共聚焦盤的細(xì)胞中，37°C下解化半小時，用新鮮DMBl培養(yǎng)基洗涂3次，然后用 不同甲醒濃度(最終甲醒濃度分別為0、l、5mM)解化3小時，新鮮DMEM培養(yǎng)基洗涂兩次，最終 用Leica TCS SP5Multiphoton Confocal Scanning Microscope進(jìn)行雙光子成像，激發(fā)波 長為720nm，發(fā)射波長為420-475nm。圖11為細(xì)胞雙光子共聚焦巧光成像效果圖。
[0064]實驗證明，在甲醒濃度提高的情況下，我們能夠看到細(xì)胞中的巧光信號也在變強(qiáng)。 說明我們的物質(zhì)能夠檢測細(xì)胞內(nèi)的甲醒。
【主權(quán)項】
1. 一種式(I)所示雙光子甲醛熒光探針，2. -種權(quán)利要求1所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述方法為:將式 (4)所示化合物溶于甲醇中，冰浴至0 °C，加入7mo 1 /L氨甲醇水溶液，0 °C下反應(yīng)半小時，隨后 加入丙烯基硼酸鄰二叔醇酯，室溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)液分離純化，獲得所述雙光子甲醛熒光探 針；3. 如權(quán)利要求2所述所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述式(4)所示 化合物與丙烯基硼酸鄰二叔醇酯物質(zhì)的量之比為1:2,所述氨甲醇溶液用量以氨物質(zhì)的量 計，所述式(4)所示化合物與氨物質(zhì)的量之比為1:10。4. 如權(quán)利要求2所述所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述甲醇體積 用量以式(4)所示化合物物質(zhì)的量計為1 OmL/mmo 1。5. 如權(quán)利要求2所述所述雙光子甲醛熒光探針的制備方法，其特征在于所述反應(yīng)液分 離純化方法為:反應(yīng)液減壓旋蒸去除溶劑，取濃縮物進(jìn)行硅膠柱分離，以體積比20:1的二氯 甲烷甲醇混合液為洗脫劑，收集目標(biāo)組分，干燥，獲得所述雙光子甲醛熒光探針。6. -種權(quán)利要求1所述雙光子甲醛熒光探針在檢測甲醛中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述甲醛為5ymol/L~5mmol/L甲醛水溶液。8. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述甲醛為細(xì)胞內(nèi)5ymol/L~5mmol/L甲醛。9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)胞為子宮頸癌細(xì)胞HeLa。10. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述甲醛檢測限為5ymol/L。
【文檔編號】G01N21/64GK105924394SQ201610340384
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】朱勍, 謝振達(dá)
【申請人】浙江工業(yè)大學(xué)