抗c-Met單鏈抗體及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組抗人c?Met單鏈抗體，其重鏈可變區(qū)核酸序列如SEQ ID:1所示，輕鏈可變區(qū)核酸序列如SEQ ID NO:2所示；其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID:3所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其完整單鏈抗體核酸序列如SEQ ID:5所示，完整單鏈抗體氨基酸序列如SEQ ID:6所示。本發(fā)明所公開(kāi)的單鏈抗體能特異性與人c?Met結(jié)合，在篩選阻斷HGF/c?Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)的中和抗體藥物研發(fā)方面具有重大作用。
【專利說(shuō)明】
抗C-Met單鏈抗體及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域 [0001] 本發(fā)明屬于抗體藥物，具體設(shè)及一種針對(duì)人間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因 子C-Met分子的重組單鏈抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002] 人間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子（C-Mesenchymal epithelial transition factor, c-Met)是酪氨酸激酶受體，也是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子化epatoc}fte growth factor, HG巧已知唯一的受體。HGF與其受體C-Met結(jié)合并激活后，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙和血 管生成，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明HGF及其受體C-Met 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，C-Met的過(guò)量表達(dá)可見(jiàn)于人的肺癌、胃癌、肝癌、乳腺 癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膜腺癌和腦膠質(zhì)瘤等(Amemiya H等，化coJogy, 2002，63(3) :286- 296; Ho-Yen等，Cancer 2014， 120(2):163-171;Sun B等，化OS 0。6,2〇12,7(1): 630143)。在直結(jié)腸癌、肝癌、腦膠質(zhì)瘤中，C-Met的表達(dá)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。HGF及 其受體C-Met已成為極有前景的抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療新祀點(diǎn)。目前已開(kāi)展針對(duì)HGF/c-Met的腫瘤 治療包括反義核酸、酪氨酸激酶抑制劑、針對(duì)HGF或C-Met括抗劑W及抗HGF或C-Met的中和 抗體等。單鏈抗體(single chain variable fragment, scFv)作為腫瘤祀向治療的重要手 段之一的新型重組抗體，是用適當(dāng)?shù)墓押饲伤峤宇^將單克隆抗體(monoclonal ant化ody, mAb)重鏈可變區(qū)（Vh)和輕鏈可變區(qū)（Vl)連接起來(lái)使之形成單一膚鏈。scFv具有相對(duì)分子質(zhì) 量小，免疫原性弱、穿透力較強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有藥物導(dǎo)向、中和毒素等功能。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明解決問(wèn)題之一是采用兼并引物法準(zhǔn)確克隆出C-Met鼠單抗 3E1D7的可變區(qū)序列。
[0004] 本發(fā)明提供的重組抗人C-Met單鏈抗體，其重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，其輕鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0005] 本發(fā)明提供的重組抗人C-Met單鏈抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0006] 本發(fā)明解決的問(wèn)題之二是采用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗人 C-Met單鏈抗體。
[0007] 本發(fā)明提供重組抗人C-Met單鏈抗體，其完整的核酸序列如SEQ ID:5所示，其完整 的氨基酸序列如SEQ ID:6所示。
[000引本發(fā)明提供的重組抗人C-Met單鏈抗體基因序列在哺乳動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)，并獲 得了目的抗體。
[0009] W該序列為模板可W在保持特異性和親和力的前提下進(jìn)化成全人源抗體或人源 化抗體W及各種具有應(yīng)用前景的產(chǎn)品，如化b等。
[0010] 本發(fā)明所提供的重組抗人C-Met單鏈抗體，能特異性的與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體C- Met結(jié)合。與其親本抗體相比，其親和力和特異性不僅得到保留，而且在人體內(nèi)的免疫源性 將大大降低，因而更符合抗體藥物應(yīng)用于人體治療的要求。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為瓊脂糖電泳鑒定抗人C-Met單克隆抗體3E1D7重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)或單 鏈抗體基因的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中（a)是3E1D7重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)基因電泳結(jié)果(泳 道1為化2000 Marker;泳道2為重鏈可變區(qū)條帶339bp;泳道3為輕鏈可變區(qū)條帶32化p);(b) 是單鏈抗體基因電泳結(jié)果(泳道1為化2000 Marker;泳道2為目的基因條帶7(K)bp)。
[0012] 圖2為慢病毒載體pR化c-Met-scFv雙酶切后電泳圖（泳道1為Ikb DNA Marker; 泳道2為pRRL c-Met-scFv)。
[0013] 圖3為巧光顯微鏡（XlOO)觀察轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒的皿K293T細(xì)胞，其中（a)和(b)為 顯微鏡下觀察單鏈抗體組的綠色巧光蛋白表達(dá)(a:普通光鏡;b:巧光光鏡）。
[0014] 圖4為實(shí)施例4中感染pR化HGFR-scFv慢病毒細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖（泳道1是 DL2000 Marker;泳道2是肥K293T細(xì)胞的RT-PCR產(chǎn)物）。
[001引圖5為實(shí)施例5中化ISA檢測(cè)SCFv與人服FR的結(jié)合活性。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0017] 肥K293T細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，克隆載體pCR-Blunt購(gòu)自 Invitrogen公司，大腸桿菌D冊(cè)a、慢病毒表達(dá)載體pR化-CMV為本實(shí)驗(yàn)室保存。TRIZO1總RNA 提取試劑購(gòu)自Invi化Ogen公司;匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自化KaRa公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu) 自Gibco公司；各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和地USion高保真DNA聚合酶購(gòu)自肥B 公司；膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自公司；重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體C-Met 蛋白購(gòu)自R&D公司；小鼠抗Flag單抗和HRP標(biāo)記的馬抗小鼠I gG抗體購(gòu)自Ce 11 Signal ing公 司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中抽試劑盒購(gòu)自Promega公司。
[0018] 實(shí)施案例一小鼠抗人C-Met單克隆抗體3E1D7可變區(qū)的克隆及鑒定 TRIzol法從分泌抗人C-Met的雜交瘤細(xì)胞株3E1D7中提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 再WcDNA為模板，分別用引物P1/P2和P3/P4，PCR擴(kuò)增出抗C-Met抗體的重鏈可變區(qū)Vh和輕 鏈可變區(qū)化基因。其中擴(kuò)增Vh的5'端引物Pl自信號(hào)膚開(kāi)始，擴(kuò)增Vh的3'端引物P2與IgGl的 CHl及可變區(qū)交界部位序列互補(bǔ)。用于擴(kuò)增化的3'端引物P4與Ck及可變區(qū)交界部位序列互 補(bǔ)。利用設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增單抗的Vh和化基因（圖1曰），電泳結(jié)果顯示成功克隆出mAb重鏈可變 區(qū)Vh基因，大小為339 bp和輕鏈可變區(qū)化基因，大小為321 bp。測(cè)序結(jié)果符合小鼠mAb可變區(qū) 特征，經(jīng)同源性分析比對(duì)確定無(wú)論是在基因序列還是氨基酸序列上均具有唯一性。采用重 疊延伸PCR法將測(cè)序正確的Vh和化基因連接成單鏈基因，具體操作如下：WVh片段基因作為 模板，WP5/P6為引物擴(kuò)增，上游引入AgeI酶切位點(diǎn)，下游引入用于連接的linker序列；同 時(shí)，W化片段基因作為模板，WP7/P8為引物擴(kuò)增，上游引入用于連接的linker序列，下游引 入Flag標(biāo)簽及Sail酶切位點(diǎn)。將純化后的重鏈輕鏈基因等摩爾混合，再WP5/P8為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，獲得抗人C-Met單鏈抗體基因。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在約700 bp處有特異性 條帶（圖化），與預(yù)期SCFv基因片段大小一致。PCR產(chǎn)物純化回收后，連接至pCR-Blunt克隆載 體，構(gòu)建pCR-Blunt c-Met-scFv。轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli D冊(cè)a,挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行酶切電泳鑒 定。陽(yáng)性質(zhì)粒送蘇州金唯智公司測(cè)序。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定成功克隆了抗人C-Met單克隆抗體 3E1D7可變區(qū)序列。
[0019]擴(kuò)增免疫球蛋白重鏈、輕鏈可變區(qū)基因的PCR引物序列如下： Vh Pl引物序列:F:5'-ATG(G/C)A(A/G)GT(A/G)(A/C)AGCTG (C/G)AG(C/G)AGTC-3,； Vh P2引物序列：R: 5'-GGGGGTGTCGTTTTGGCTGA(A/G)GAGAC(G/T/A)GTGA-3' ； Vi P3引物序列：F: 5'-GA(C/T)ATTGTG(A/C)T(C/G)AC CCAGACTCCA -3'； Vi P4 引物序列：R: 5 '-GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCC-3 ' ； Vh-Linker P5引物序列：F:5'-TATACCGGTCGCCACCATGGA(A/G)GT(A/G) (A/C)AGCTG(C/ G)AG-3'（下劃線所示是心el酶切位點(diǎn)）； VH-Linker P6 引物序列：R: 5 ' -CGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTG AGAGTGGTGC-3； 化-Linker P7引物序列：F:5'-TTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGC TCACCCAGTCTC-3' ； 化-Linker P8引物序列：R:5'-CGCGTCGACTTACf劇T化TTTGATT TCCAGCTTG -3'（下劃線所示是&訂酶切位點(diǎn)，斜體部分含有Flag標(biāo)簽）。
[0020] h冰PCR巧府化系化下：
F(JK僅化殺件：視雙 1"生98 -U，3 min;雙 1"生98 -Ulb S，退乂W -U3U S;化伸U，l.b min,循環(huán)30次;延伸72°C10 min,反應(yīng)結(jié)束。
[0021] 實(shí)施案例二抗人C-Met單鏈抗體慢病毒表達(dá)載體pRRL c-Met-scFv的構(gòu)建 將測(cè)序鑒定正確的pCR-Blunt c-Met-scFv質(zhì)粒和pR化-CMV慢病毒表達(dá)質(zhì)粒用AgeI和 Sail分別進(jìn)行雙酶切。T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體PR化c-Met-scFv。連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，獲得陽(yáng)性克隆后，AgeI和Sail雙酶切鑒定與目的基因700 bp 大小一致（圖2)。同時(shí)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了抗人C-Met單鏈 抗體慢病毒表達(dá)載體。
[0022] 實(shí)施案例S抗人C-Met單鏈抗體在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá) 接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肥K293T細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%~60%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。慢病毒 表達(dá)載體PR化c-Met-scFv和作為陽(yáng)性對(duì)照含有綠色巧光蛋白的空載體(pR化-CMV-GFP)均 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將5.4 iig慢病毒包裝質(zhì)粒混合物和5.1 iig慢病毒表達(dá)質(zhì)粒用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸至 84化。取16化無(wú)菌化C12溶液逐滴加入到混合液中，輕輕混勻，室溫靜置10 min。將W上兩 種混合液逐滴加入到培養(yǎng)皿K293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)，轉(zhuǎn)染24h后病毒包裝成功，換完全DMEM 培養(yǎng)基，加入工作濃度的助感染劑P〇lybrene，W利于病毒顆粒進(jìn)一步感染肥K293T細(xì)胞。感 染24 h后通過(guò)巧光顯微鏡觀察慢病毒感染后的肥K293T細(xì)胞綠色巧光蛋白表達(dá)情況。巧光 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)單鏈抗體組有綠色巧光蛋白表達(dá)，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對(duì)照組細(xì)胞則無(wú)巧光 表達(dá)，說(shuō)明慢病毒感染成功。
[0023] 實(shí)施案例四將感染pR化c-Met-scFv慢病毒24 h的肥K293T細(xì)胞使用完全DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，消化并擴(kuò)大培養(yǎng)。TRIzol法提取總RNA，采用RT- PCR法檢測(cè)感染細(xì)胞目的基因pRRL HGFR-scFv的轉(zhuǎn)錄。瓊脂糖凝膠電泳分析，在約700 bp處 可見(jiàn)目的條帶。測(cè)序結(jié)果表明，目的條帶為編碼抗人HGFR-scFv的基因序列。
[0024] 實(shí)施案例五ELISA檢測(cè)抗人C-Met單鏈抗體的抗原結(jié)合活性 WlOO ng/mL重組人C-Met蛋白按100化/孔，4°C過(guò)夜包被酶標(biāo)板。用10 g/L BSA封閉 液37°C封閉2 h。分別加入pRRL c-Met-scFv慢病毒感染后的肥K293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液，W及 未感染的皿K293T細(xì)胞上清（陰性對(duì)照），抗人C-Met 3ElD7mAb(陽(yáng)性對(duì)照）。37 °C解育2 h。 PBST洗涂3次，W小鼠抗Flag HiAb作為一抗（陽(yáng)性對(duì)照不需要一抗），37°C作用1 h;PBST洗涂 3次，使用HRP標(biāo)記的馬抗小鼠IgG抗體作為檢測(cè)抗體，37°C作用1 h;PBST洗涂后每孔加入 100化TMB顯色液，37°C避光顯色10 min,終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀讀取A450數(shù)值。間接ELISA檢 測(cè)結(jié)果所示，感染pR化c-Met-scFv慢病毒的皿K293T細(xì)胞表達(dá)上清可與抗原人C-Met蛋白 發(fā)生特異性的結(jié)合，且隨著上清體積的減少，信號(hào)逐漸減弱，在0.39 iiL時(shí)仍然顯示陽(yáng)性結(jié) 果，而未感染的細(xì)胞上清為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照（100 yg/mL抗人C-Met 3E1D7 mAb)與重組 人C-Met蛋白結(jié)合信號(hào)顯著。由此證明，成功構(gòu)建并表達(dá)了具有與人C-Met抗原特異性結(jié)合 活性的抗人C-Met單鏈抗體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組抗人C-Met單鏈抗體，其重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其輕 鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。2. -種重組抗人c-Met單鏈抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；其 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。3. -種DNA分子，編碼了權(quán)利要求1或2所述的重組抗人c-Met單鏈抗體 權(quán)利要求3所述的DNA分子，所述重組抗人c-Met單鏈抗體完整的核酸序列如SEQ ID: 5 所示。4. 權(quán)利要求3所述的DNA分子，所述重組抗人c-Met單鏈抗體完整的氨基酸序列如SEQ ID: 6所示 編碼有權(quán)利要求1-5任一所述重組抗人c-Met單鏈抗體DNA的質(zhì)粒。5. 編碼有權(quán)利要求1-5任一所述重組抗人c-Met單鏈抗體的表達(dá)，包括在原核和真核細(xì) 胞的表達(dá)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的重組抗人c-Met單鏈抗體，其特征在于其與肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子受體c-Met特異性結(jié)合。7. -種如權(quán)利要求4-5所述的重組抗人c-Met單鏈抗體的應(yīng)用，其特征在于：用于腫瘤 的診斷及治療。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK105924523SQ201610254061
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年4月23日
【發(fā)明人】郭佳, 蔣明, 于麗華, 蔣韻, 毛玉婷
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院