嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、car30-nkt細胞及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CAR30-NKT細胞及其制備方法和應用，所述嵌合抗原受體為CD30ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串聯的大鼠生長激素信號肽、CD30ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內信號結構域和CD3ζ的胞內信號結構域。采用本發(fā)明的CAR30-NKT細胞治療CD30陽性的霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤時，對淋巴瘤細胞具有很好的特異殺傷活性，且對已經過多次治療(如采用CD30單克隆抗體結合細胞毒素藥物或者放射性同位素治療等)但均無明顯療效的CD30陽性的霍奇金淋巴瘤患者有一定的治療效果。
【專利說明】
嵌合抗原受體及其基因和重組表達載體、CAR30-NKT細胞 及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領域，具體地，設及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重組表達載體、工程化CD30祀向性的NKT細胞 (CAR30-NKT細胞）及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞（MT)是一種特殊類型的T淋己細胞亞群，具有T細胞和NK細胞細 胞兩重性質。NKT細胞能表達T細胞的TCR與NK細胞的NKR-Pl兩種受體，在TCR和NKR介 導下，NKT細胞能夠產生大量的比-4及INF 丫，對腫瘤細胞發(fā)揮細胞殺傷作用。NKT細胞通 過自身表面的CD16與特異性抗體的Fc段結合，發(fā)揮抗體依賴性的細胞介導的細胞毒作用 (ADCC，antibody-dependent cell-mediated 巧totoxicity)。但在抗體依賴的細胞介導的 殺傷作用過程中，由于抗體能與祀細胞上的相應抗原表位特異性結合，NKT細胞可殺傷任何 已與抗體結合的祀細胞，因此抗體與祀細胞上的抗原結合是特異性的，但NKT細胞對祀細 胞的殺傷作用是非特異性的。另外，通常情況下，輸注的NKT細胞在患者體內半衰期為2周 左右，有效期短暫，需要反復多次輸注。而且，NKT細胞本身缺少特異性抗體，不足W在腫瘤 周圍或者瘤巢中富集，制約了 NKT細胞對惡性腫瘤的祀向治療。再者，研究表明，NKT細胞 并不是對所有的腫瘤都有殺傷效果，且對部分腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待 提局。
[0003] CD30抗原是一個120kDa糖蛋白，屬于TNF/nerve生長因子受體家族成員，幾乎表 達于所有的霍奇金淋己瘤、部分非霍奇金淋己瘤及被病毒感染的淋己細胞表面。由于W上 特性，CD30抗原成為W抗體為基礎治療的理想祀點。目前，在治療復發(fā)難治性霍奇金淋己 瘤患者過程中，臨床研究通常采用CD30單克隆抗體結合細胞毒素藥物或者放射性同位素 的方案，運種方案在產生一定臨床效應的基礎上，同時也存在一定的缺陷，如：CD30單克隆 抗體祀向效應的短暫性及CD30單克隆抗體在腫瘤部位分布的不足等。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現有技術中NKT細胞對腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高W及現有臨床研究中CD30單克隆抗體存在的上述缺陷，提供一種嵌合抗 原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C及其基因和重組表達載體、工程化CD30祀向性的NKT 細胞（CAR30-NKT細胞）及其制備方法和應用。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現，采用本發(fā)明的嵌合抗原受體 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞治療CD30陽性的霍奇金淋己瘤及非霍奇金淋 己瘤時，對淋己瘤細胞具有很好的特異殺傷活性，且對已經過多次治療（如采用CD30單克 隆抗體結合細胞毒素藥物或者放射性同位素治療等）但均無明顯療效的CD30陽性的霍奇 金淋己瘤患者有一定的治療效果。
[0006] 因此，為了實現上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為〔0305〇。￥-〔08-〔0137-〔03(，包括串聯的大鼠生長激素信號膚、〔0305〇。￥、〔08 的較鏈區(qū)化inge區(qū)）和跨膜區(qū)、CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第=方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達載體。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化CD30祀向性的NKT細胞，所述NKT細胞是上 述嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了一種工程化CD30祀向性的NKT細胞的制備方法，所述方 法包括：
[0011] 包裝攜帶 pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C 的慢病毒，得到病毒 濃縮液；利用得到的病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 G。
[0012] 第六方面，本發(fā)明提供了上述方法制備得到的工程化CD30祀向性的NKT細胞。 [001引第屯方面，本發(fā)明提供了上述工程化CD30祀向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應用。
[0014] 在治療CD30陽性的霍奇金淋己瘤及非霍奇金淋己瘤時，本發(fā)明的嵌合抗原受體 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞，即工程化CD30祀向性的NKT細胞能夠特異性 結合CD30抗原，明顯延長免疫細胞在患者體內的存活時間，增強免疫細胞祀向識別霍奇金 淋己瘤細胞及非霍奇金淋己瘤細胞表面CD30抗原的能力，加強對霍奇金淋己瘤細胞及非 霍奇金淋己瘤細胞的特異殺傷活性，而且對已經過多次治療（如采用CD30單克隆抗體結合 細胞毒素藥物或者放射性同位素治療等）但均無明顯療效的CD30陽性的霍奇金淋己瘤患 者有一定的治療效果。本發(fā)明的工程化CD30祀向性的NKT細胞為治療CD30陽性的霍奇金 淋己瘤及非霍奇金淋己瘤提供了一種新的選擇，具有良好的產業(yè)應用前景。
[0015] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予W詳細說明。
【附圖說明】
[0016] 圖1為流式細胞術對分離培養(yǎng)的NKT細胞表型分析的結果。
[0017] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWP化-CD8-CD137-CD3 C的限制性內切酶MluI/ NdeI雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0018] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的限制性內 切酶BamHI/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0019] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達載體pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的結構示意 圖，其中，逆時針序列為正向基因片度，順時針為反向基因片段。
[0020] 圖5為流式細胞術檢測含有嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的病毒濃 縮液對NKT細胞的感染效率。
[0021] 圖6為流式細胞術檢測嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細 胞（CAR30-NKT細胞）表型鑒定的結果。
[0022] 圖7為本發(fā)明的CAR30-NKT細胞對CD30陽性的霍奇金淋己瘤細胞的殺傷作用的 細胞毒性分析圖。
[0023] 圖8為流式細胞術檢測CAR30-NKT細胞回輸至7例CD30陽性的霍奇金淋己瘤患 者中，CAR30-NKT細胞在患者外周血中的持續(xù)存在時間曲線圖。
[0024] 圖9為淋己結穿刺分析CAR30-NKT細胞回輸至CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者中， CAR30-NKT細胞在患者體內向祀病灶的歸巢情況。
[00巧]圖10為CT分析CD30陽性的霍奇金淋己瘤肝轉移患者經CAR30-NKT細胞治療兩 個月后，患者肝部位病灶變化。
【具體實施方式】
[0026] W下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C，包括串聯的大鼠生長激素信號膚、CD30單鏈抗體CD30ScFv、 CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域。
[0028] 優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C由大鼠生長激素信號膚、 CD30ScFv、CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域串 聯構成。進一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更進一步優(yōu) 選地，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0029] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，所述基因具有如SEQ ID NO. 2所示的核巧酸序列，進一步優(yōu)選地，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核巧酸序列如 沈QID NO. 2所示。
[0030] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達載體。優(yōu)選情況下，重組表達載體為慢病 毒表達載體。對于慢病毒表達載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉染包裝細胞 如293T包裝細胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3C修飾的 NKT細胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體為pWP化-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0031] 對于慢病毒表達載體pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的制備方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達載體 pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3C 的制備方法包括 W下步驟：
[003引 （1)從NKT細胞CDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞 內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域，并克隆至載體pWP化-GFP中，構建得到 pWP化-CD8-CD137-CD3C ;
[0033] 似合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD30ScFv的核巧酸序列， 并克隆至pWP化-CD8-CD137-CD3C中，經測序驗證后得到序列正確的 pWP化-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0034] 步驟（1)中，對于從NKT細胞CDNA中分別擴增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的 胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域的方法沒有特別的限定，可W為本領域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，NKT細胞可W通過分離人靜脈血中的單個核細胞， 然后進行培養(yǎng)獲得。
[0035] 具體地，得到pWP化-CD8-CD137-CD3 C的方法可W包括：提取NKT細胞的總RNA， 逆轉錄獲得NKT細胞cDNA，W得到的NKT細胞CDNA為模板，利用引物Pl (SEQID NO. 11)和 P2(SEQID NO. 12)進行PCR擴增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)（SEQID NO. 3);利用引 物P3(SEQID NO. 13)和P4(SEQID NO. 14)進行PCR擴增獲得CD137基因的胞內信號結構域 (SEQID NO. 4);利用引物 P5(SEQID NO. 15)和 P6(SEQID NO. 16)進行 PCR擴增獲得 CD3 C 基 因的胞內信號結構域（SEQID NO. 5)，將獲得的PCR產物分別進行雙酶切，然后與Mlul/Ndel 雙酶切后的慢病毒表達載體pWP化-GFP連接。
[0036] 步驟（2)中，對于合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD30ScFv的核巧酸序列的方法 沒有特別的限定，可W為本領域常用的各種方法，例如可W通過全基因合成技術合成。
[0037] 具體地，得到序列正確的pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的方法可 W包括：通過全基因合成技術合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD30ScFv融合基 因的核巧酸序列（SEQID NO. 8)，克隆至載體pGSI中，得到pGSI-CD30ScFv ;然后 將pGSI-CD30ScFv進行BamHI/MluI雙酶切，與用BamHI/MluI雙酶切后的步驟 (1)得到的重組質粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C連接，經測序鑒定，得到序列正確的 pWP化-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C。其中，大鼠生長激素信號膚的核巧酸序列如沈QID NO. 6所示，CD30ScFv核巧酸序列如沈QID NO. 7所示。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種工程化CD30祀向性的NKT細胞，所述NKT細胞是由上述嵌合 抗原受體 CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C 修飾的 NKT 細胞（即 CAR30-NKT 細胞）。
[0039] 本發(fā)明還提供了一種工程化CD30祀向性的NKT細胞的制備方法，該方法包括：包 裝攜帶pWP化-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的病毒濃 縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C。
[0040] 對于包裝攜帶pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的慢病毒的方法沒有特 別的限定，可W為本領域技術人員常用的各種方法，優(yōu)選情況下，將慢病毒表達載體 pWP化-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C 與輔助質粒（如 PSPAX2、pMD2. G)共轉染 293T 包裝細 胞，轉染48-7化時收集病毒上清，離屯、、過濾，在濾液中添加5 XPEGeooo-NaCl進行混勻，離 屯、后棄上清，沉淀用0-4°C預冷的無菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。
[0041] 本發(fā)明的方法中，還包括通過如下方法制備NKT細胞：
[004引 （1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階 段培養(yǎng)；
[0043] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細胞進行第二階段培養(yǎng)。
[0044] 優(yōu)選情況下，所述第一階段培養(yǎng)的實施方式包括：將單個核細胞培養(yǎng)于第一 NKT 細胞培養(yǎng)液中，所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介 素-2和白介素-15 ;進一步優(yōu)選地，第一 NKT細胞培養(yǎng)液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為 30-70ng/mU和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mU和/或所述白介素-15的濃度為 3〇-70ng/mL。
[0045] 優(yōu)選情況下，所述第二階段培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細胞培 養(yǎng)于第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述第二NKT細胞培養(yǎng)液中含有NKT細胞培養(yǎng)基和白介素-2 ; 進一步優(yōu)選地，第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0046] 對于MT細胞培養(yǎng)基沒有特別的限定，可W為本領域常用的各種用于培養(yǎng)MT細 胞的培養(yǎng)基，例如可W為GT-T551培養(yǎng)基。
[0047] 在制備NKT細胞時，對于第一階段培養(yǎng)和第二階段培養(yǎng)的條件沒有特別的限定， 可W為本領域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中進 行培養(yǎng)。本領域技術人員可W對培養(yǎng)的時間進行適應性調整，此為本領域技術人員所公知， 在此不再寶述。
[0048] 本發(fā)明制備得到的NKT細胞中，CD3+細胞平均比率〉90%，CD3 +CD8+細胞占總CD3 + 細胞的平均比率〉7〇%仰3+〔056+細胞占總〔03+細胞的平均比率〉15%。
[004引對于感染NKT細胞的方法沒有特別限定，可W為本領域常用的各種方法，優(yōu)選情 況下，該方法包括：
[0050] (1)在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培 養(yǎng)；
[0051] (2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng) 的細胞進行第二階段感染培養(yǎng)。
[0052] 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將NKT細胞培養(yǎng)于第S NKT細 胞培養(yǎng)液中，所述第S NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介 素-2 ;進一步優(yōu)選地，第S NKT細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0053] 優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段感染培養(yǎng)的細 胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細胞培養(yǎng)液的具體組成可參見前述相應 內容，在此不再寶述。
[0054] 在感染NKT細胞時，對于第一階段感染培養(yǎng)和第二階段感染培養(yǎng)的條件沒有特別 的限定，可W為本領域常用的各種條件，例如可W在30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng) 箱中進行培養(yǎng)。本領域技術人員可W對培養(yǎng)的時間進行適應性調整，此為本領域技術人員 所公知，在此不再寶述。
[0055] 具體地，感染NKT細胞的方法包括：取IX IO7-SX IO7個NKT細胞，棄掉舊的培養(yǎng) 液，加入2-4血新鮮GT-l'SSl培養(yǎng)液，再加入200-400 y L病毒濃縮液、2-4 y L 1 X 10 Smg/ 血魚精蛋白和終濃度為300-70011/血的比-2，置于30-37°(：、飽和濕度為3-6%的〇)2培養(yǎng) 箱中感染12-1化后，棄培養(yǎng)液，將細胞轉至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培 養(yǎng)基，再加入終濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-7化g/ml的CD3單克隆抗體和終 濃度為30-7化g/mL的白細胞介素15,于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-1她，獲得嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞。
[0056] 進一步優(yōu)選地，感染NKT細胞的方法還包括：
[0057] (3)先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞進行體外誘導，待細 胞的密度為80-90%時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行 擴增培養(yǎng)。
[0058] 優(yōu)選情況下，所述體外誘導的實施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞培 養(yǎng)于所述第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述擴增培養(yǎng)的實施方式包括：將細胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液中。第一 NKT細胞培養(yǎng)液和第二NKT細胞培養(yǎng)液的具體組成可參見前述相 應內容，在此不再寶述。
[0059] 具體地，感染NKT細胞的方法還包括：將第二階段感染培養(yǎng)后獲得的慢病毒感染 的NKT細胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養(yǎng)液進行體外誘導，待細胞的密 度為80-90%時將細胞轉入細胞培養(yǎng)袋中，隔1.5-2.5天加入比-2的終濃度為300-70011/ mL、CD3單克隆抗體的終濃度為30-7化g/ml、白細胞介素-15的終濃度為30-7化g/血的新鮮 GT-巧51培養(yǎng)液進行擴增培養(yǎng)并將細胞擴增至總量為1 X 109-2 X IO9個細胞。經過本發(fā)明的 慢病毒對祀向CD30抗原的嵌合抗原受體進行NKT細胞感染，其感染效率高達30% -60%， 而獲得的CAR30-NKT細胞，其CD3+CD56+細胞占總CD3 +細胞的比率在15 % -40 %范圍之內。
[0060] 嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞表達的嵌合抗原受體 的蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領域技術人員應該理解的是，嵌合抗原受 體前體蛋白由大鼠生長激素信號膚、CD30ScFv、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內信 號結構域和CD3 C的胞內信號結構域串聯構成，蛋白質翻譯后在細胞內粗面型內質網切除 信號膚后成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細胞的細胞膜上。該嵌合 抗原受體的蛋白氨基酸序列對應的基因編碼序列如SEQID NO. 2所示。該嵌合抗原受體W 基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 C的胞內信號結構域串聯而成的結構為信號 傳導結構域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對應的基因編碼序列如SEQID NO. 10所示。 [006。 本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的工程化CD30祀向性的NKT細胞。
[006引本發(fā)明還提供了工程化CD30祀向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的 應用。優(yōu)選情況下，腫瘤是CD30陽性的淋己瘤。所述淋己瘤可W為霍奇金淋己瘤或非霍奇 金淋己瘤，進一步優(yōu)選地，所述淋己瘤為霍奇金淋己瘤。
[0063] 本發(fā)明的應用中，對于用于治療CD30陽性的腫瘤的制劑的組成沒有特別的限定， 只要含有本發(fā)明所述CAR30-NKT細胞或是由CAR30-NKT細胞制備而成即可，制劑的具體組 成和制備方法為本領域技術人員所公知，在此不再寶述。
[0064] 實施例
[0065] W下的實施例將對本發(fā)明作進一步的說明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0066] W下實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規(guī)方法。下述實施例中 所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到，其中：
[0067] NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551購自TaKaRa公司。
[0068] 淋己細胞分離液購自T抓公司。
[0069] CD3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購自TaKaRa公司。
[0070] 重組人蛋白干擾素 -丫、重組人白介素 2、重組人白介素 15均購自protech公司。 [007U 總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（PHmeSTA民K服DNA Polymerase)、T4DNA 連接酶購自 TaKaRa 公司。
[0072] Reve;rtAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 購自 F'ermentas 公司。
[0073] Bgl II、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V購自 Fermentas 公司。
[0074] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、質粒小提試劑盒均購自天 根生化科技有限公司。
[00巧]pWP化-GFP、PSPAX2、pMD2. G 均購自 Addgene 公司。
[0076] pGSI購自北京天一輝遠生物科技有限公司。
[0077] Transl-Tl Phage Resistant化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公 司。
[0078] LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent 轉染試劑購自 Invitrogen 公司。
[0079] 293T包裝細胞購自美國ATCC。
[0080] 陽G6000-NaCl中陽G6000終濃度為25. 5質量％，化Cl終濃度為I. 2M，PEG6000和 化Cl均購自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0081] 胎牛血清購自德國PAA公司。
[0082] CD30陽性的人霍奇金淋己瘤細胞系L428由南方醫(yī)科大學提供。
[0083] 5-簇基巧光素班巧酷亞胺醋購自上海譜振生物科技有限公司。
[0084] 膜聯蛋白V-R陽試劑盒購自美國抓公司。
[0085] 所有引物均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。
[0086] 實施例1NKT細胞的制備
[0087] (1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋己細胞分離液，通過密度梯度離屯、方 法分離獲得單個核細胞（PBMCs)。
[0088] 似PBMCs洗；次后，采用含有0. 6體積％的人自體血清的NKT細胞培養(yǎng)基 GT-巧51調整細胞終濃度為2 X IO6個細胞/mL ;將細胞接種于預先經過終濃度為10 y g/mL 的retronectin包被的75cm2細胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重 組人白介素2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素-15,在37°C、飽和濕度 為5 %的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0089] (3)培養(yǎng)第4天，將細胞轉移至未包被的培養(yǎng)瓶中，每2天按照細胞生長數量加入 NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551，控制細胞濃度為1 X IO8個細胞/mU并加入終濃度為500U/ml的 重組人白介素2 ;培養(yǎng)至第12天，得到NKT細胞，流式細胞術對NKT細胞表型進行分析。結 果見圖 1，其中 CD3+:95. 04% ;CD3+CD8+:90. 99% ;CD3+CD56+:24. 12% ;CD8+CD56+:24. 63%。
[0090] 實施例2慢病毒表達載體pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C的構建
[0091] (1) NKT 細胞 cDNA 的制備
[0092] 離屯、沉淀實施例1培養(yǎng)得到的NKT細胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提 取細胞的總RNA，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA用逆轉錄試劑盒RevedAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄得MT細胞cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0093] (2)慢病毒質粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的制備
[0094] 巧計并合成化下引物序列（巧中，下劃線標巧為保護堿某，方樞為酶切位點）：
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[010引 P6(沈QID NO. 16) ：GATC |CATATG| ATAATCAACCTCTGGATTAC
[010 引 NdeI
[0107] W步驟（I)中MT細胞cDNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR擴增，得到長28化P 的CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核巧酸序列如SEQID NO. 3所示，兩端分別含有MluI和Bgl II 酶切位點和保護堿基；用引物P3和P4進行PCR擴增，得到長146bp的CD137胞內信號結構 域，核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，兩端分別含有Bgl II和EcoRI酶切位點及保護堿基；用 引物P5和P6進行PCR擴增，得到長359bp的CD3 C的胞內信號結構域，核巧酸序列如SEQID NO. 5所示，兩端分別含有EcoRI和NdeI酶切位點及保護堿基。各步PCR擴增反應體系相 同，W擴增CD137胞內信號結構域為例，進行PCR擴增，PCR反應條件參照PrimeSTAK@ 服DNA Polymerase的說明書，反應體系巧OyL)如下：
[010引 雙蒸水：32. SliL
[0109] 5 X 反應 buffer : IOy L
[0110] dNTP 混合物（每種 2. 5mM) :4 y L [01川 P3 (IOmM)=Iy L
[0…]P4 (IOmM)=Iy L
[0113] NKT 細胞 cDNA (200ng/ul) : 1 y L
[0114] Pfim巧TAR Kj HS DNA Polymerase :0. 5 y L
[0115] 將上述PCR產物用1 %的瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進 行DNA片段回收。得到片段后分別進行雙酶切反應，酶切產物用普通DNA產物純化試劑盒 回收備用。
[0116] 慢病毒表達載體pWP化-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產物經1 %的瓊脂糖凝 膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、 CD137XD3 C片段通過T4DNA連接酶連接，連接產物轉化Transl-TlPhage Resistant化學 感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)1化后挑取單克隆，37°C，250巧m培養(yǎng)1化后用質粒小提試劑盒提取 質粒。提取的質粒經限制性內切酶MluI和NdeI雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2,其中，Ml : DNA分子量標記D15000 ;1泳道：質粒pWP化-CD8-CD137-CD3 C的未酶切片段；2泳道：質粒 pWP化-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（75化P) ;M2 :DNA分子量標記D2000。將鑒定正確的質 粒送北京天一輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結果正確的 重組質粒命名為pWP化-CD8-CD137-CD3C，其中，CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)的核巧酸序列如 SEQID NO. 3所示，CD137的胞內信號結構域的核巧酸序列如SEQID NO. 4所示，CD3 C的胞 內信號結構域的核巧酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0117] (3)慢病毒質粒 pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C 的制備
[0118] 全基因合成編碼大鼠生長激素信號膚和CD30ScFv融合基因的核巧酸序列，序列 如SEQID NO. 8所示，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成，其5'端含有BamHI、kozak序 列，3'端含有MluI酶切位點，將前述融合基因克隆在質粒pGSI中，命名為pGSI-CD30ScFv。 質粒經BamHI/MluI雙酶切，酶切產物經1 %瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試 劑盒回收目的片段備用。
[0119] pWP)(L-CD8-CD137-CD3 C質粒經限制性內切酶BamHI/MluI酶切，酶切產物經1 % 瓊脂糖凝膠進行分離，用瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含 有大鼠生長激素信號膚和CD30ScFv的DNA片段通過T4DNA連接酶進行連接，具體方法見 說明書。將連接產物轉化化ansl-TlPhage Resistant化學感受態(tài)細胞，37°C培養(yǎng)1化后 挑取單克隆，37°C，250rpm培養(yǎng)1化后，用質粒小提試劑盒提取質粒。提取的質粒經限制性 內切酶BamHI/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結果如圖3所示，其中，Ml :DNA分子量標記D15000 ; 1 泳道：質粒 pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C 未酶切片段（11260bp) ;2 泳道：質粒 pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3C的酶切片段（158化P)。將鑒定正確的質粒送北京天一 輝遠生物科技有限公司對插入的融合基因片段進行測序。將測序結果正確的重組質粒命名 為pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C，其結構示意圖如圖4所示，其中包括大鼠生長激素 信號膚（核巧酸序列如SEQID NO. 6所示）、抗CD30單鏈抗體（核巧酸序列如SEQID NO. 7 所示）、CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137的胞內信號結構域和CD3 C的胞內信號結構域， 其中，該嵌合抗原受體W基因CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3 C的胞內信號結構 域串聯而成的結構為信號傳導結構域，其氨基酸序列如SEQID NO. 9所示，對應的基因編碼 序列如沈QID NO. 10所示。
[0120] 實施例3嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞的制備
[0121] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0122] 用分光光度計分別測定慢病毒表達質粒pWP)(L-CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C 和輔助質粒PSPAX2、pMD2. G的濃度，S種質粒W 4:2:1的質量比用Lipofectamine? 2000Transfection Reagent轉染試劑共轉染293T包裝細胞。分別在轉染4她、7化時收 集病毒上清于50mL EP管中，4°C，2000g離屯、lOmin，轉移兩次得到的上清至新EP管中，用 4. 5 ym濾器過濾病毒上清；過濾的病毒上清與5X陽Geooo-NaCl按照4:1的體積比混勻， 4°C靜置化，然后4°C，1000 Og離屯、20min，棄上清，沉淀用1血的4°C預冷的無菌PBS溶解， 即得嵌合抗原受體的病毒濃縮液，按每管100 y L進行分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0123] 按照上述方法，利用慢病毒表達質粒pWP化-GFP和輔助質粒PSPAX2、pMD2. G共轉 染293T包裝細胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0124] (2)慢病毒感染NKT細胞及感染后細胞的擴增培養(yǎng)
[01巧]取實施例1的在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的IX 10 7個NKT細胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入 2血新鮮NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551、200 y L步驟（1)得到的病毒濃縮液、2 y L 1 X 10 6mg/mL 魚精蛋白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5 %的C〇2培養(yǎng)箱中 感染12小時后，棄培養(yǎng)液。同時用表達GFP綠色巧光蛋白的慢病毒濃縮液對NKT細胞進行 同步感染（得到的NKT細胞稱為CART-GFP細胞），用于計算該病毒的感染效率。將感染后 的細胞轉至未經CD3和retronectin包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入20血的NKT細胞培養(yǎng)基 GT-T551，再加入終濃度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的CD3單克隆抗體 和終濃度為50ng/mL的重組人白介素15,于37°C、飽和濕度為5%的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1她， 得到的NKT細胞稱為CAR30-NKT細胞。用相同的方法制備CAR30-T細胞燈細胞的制備方法 參貝胥文南犬：Yajin邑 Zhan邑，et al. Autologous CIK Cell Immunotherapy in Patients with Renal Cell Carcinoma after Radical Nephrectomy. Clinical Study, 2013 中 2. 4 部分 CIK細胞的制備方法）。用流式細胞術檢測該病毒的感染效率，結果如圖5所示，CAR30-NKT 細胞的感染效率為46. 17%。
[0126] (3)體外誘導擴增CAR30-NKT細胞群
[0127] 將上述培養(yǎng)后的NKT細胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細胞培養(yǎng) 基GT-T551進行體外誘導，待細胞的密度為85%時將細胞轉入細胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入重 組人白介素2的終濃度為500U/mL、CD3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介素15 的終濃度為50ng/mL的新鮮NKT細胞培養(yǎng)基GT-T551進行擴增培養(yǎng)，待細胞擴增到總量為 1. 5X 1〇9個細胞左右后，采用流式細胞儀對感染的細胞群體進行鑒定，細胞表型一般達到 〔03陽性細胞比例>90%;〔03〔08雙陽性細胞比例〉70%;〔03〔056雙陽性細胞比例〉15%， 結果見圖 6, CD3+:90. 99 % ;CD3 +CD4+:21. 03 % ;CD3 +CD8+:81. 66 % ;CD3 +CD56+:30. 65 % ; CD8+CD56+:29. 63%。
[012引實施例4 CAR30-NKT細胞對人霍奇金淋己瘤細胞殺傷作用的細胞毒性分析
[0129] 分別取實施例3中制備的CAR30-NKT細胞、CAR30-T細胞和實施例1中培養(yǎng)的 NKT細胞接種于96孔板，用5-簇基巧光素班巧酷亞胺醋（WS巧進行染色，與CD30陽性的 人霍奇金淋己瘤細胞系L428 W效祀比（殺傷細胞：祀細胞）5:1,10:1，20:1,40:1的比率進 行共培養(yǎng)，經過24小時的共培養(yǎng)后，將細胞用膜聯蛋白V-R陽試劑盒染色，同時設置對照組 分別為未加入免疫細胞殺傷處理的L428細胞，并將細胞用膜聯蛋白V-RPE試劑盒染色。流 式細胞術對細胞調亡進行檢測，細胞調亡的量根據下面的公式計算：調亡率=(對照-樣 品）/對照X100%，對照為未加免疫細胞殺傷處理的細胞存活數目；樣品為加入相對應的 效祀比（殺傷細胞：祀細胞）的免疫細胞殺傷處理的細胞存活數目，見圖7。由圖7可知， 嵌合抗原受體CD30ScFv-CD8-CD137-CD3 C修飾的NKT細胞對CD30陽性的霍奇金淋己瘤細 胞具有特異殺傷活性，且CAR30-NKT細胞的特異殺傷活性明顯優(yōu)于CAR30-T細胞和NKT細 胞。
[0130] 實施例5 CAR30-NKT細胞對CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者的治療效果
[013U 取 5X IO8個 CD30ScFv-1-CD8-CD137-CD3 C 修飾的 NKT 細胞（即 CAR30-NKT 細 胞），經過100mL生理鹽水稀釋后，連續(xù)=天靜脈回輸到下述CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者 (在利用本發(fā)明的CAR30-NKT細胞進行祀向免疫治療前，已經過多次治療（包括采用CD30 單克隆抗體結合細胞毒素藥物或者放射性同位素治療等），但均無明顯療效）體內，回輸后 對患者的治療狀況進行評估。
[0132] 圖8為流式細胞術檢測CAR30-NKT細胞回輸至7例CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者 中，CAR30-NKT細胞在患者外周血中的持續(xù)存在時間曲線圖。圖8結果顯示，經過CAR30-NKT 細胞祀向免疫治療，CAR30-NKT細胞在7例CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者外周血中呈現高 水平的拷貝數，并持續(xù)存在一個月（轉基因拷貝數在100/yg曲NAW上），說明CAR30-NKT 細胞能夠在CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者體內大量的增殖來發(fā)揮殺傷活性。
[0133] 圖9為淋己結穿刺分析CAR30-NKT細胞回輸至CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者 中，CAR30-NKT細胞在患者體內向祀病灶的歸巢情況，其中，從前述7例患者中隨機選取4例 患者的經過CAR30-NKT細胞治療1個月后的淋己結及外周血的樣本。圖9結果顯示，患者 淋己結中的CAR30-NKT細胞的拷貝數明顯高于患者外周血中的拷貝數，說明CAR30-NKT細 胞能夠在CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者體內大量的歸巢至祀病灶來發(fā)揮殺傷治療效果。
[0134] 圖10為CT分析CD30陽性的霍奇金淋己瘤肝轉移患者經CAR30-NKT細胞治療兩 個月后，患者肝部位病灶變化。圖10結果顯示，霍奇金淋己瘤患者治療后一處肝病灶（參 見箭頭）明顯減少，另外一處肝病灶大?。▍⒁娂^）持續(xù)穩(wěn)定，說明CAR30-NKT細胞對 CD30陽性的霍奇金淋己瘤患者（經已有的多種治療手段治療后均無明顯療效）治療后，對 患者的疾病有明顯的治療效果。
[0135] W上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中 的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可W對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，運 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0136] 另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛 盾的情況下，可W通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0137] 此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可W進行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內容。
【主權項】
1. 一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ， 包括串聯的大鼠生長激素信號肽、⑶30ScFv、⑶8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、⑶137的胞內信號結 構域和CD3G的胞內信號結構域；優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨 基酸序列，進一步優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優(yōu)選地，所述基因具有如SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列，進一步優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. 含有權利要求2所述的基因的重組表達載體，優(yōu)選地，所述重組表達載體為慢病毒 表達載體，進一步優(yōu)選地，所述慢病毒表達載體為PWPXL-⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。4. 一種工程化CD30靶向性的NKT細胞，其特征在于，所述NKT細胞是由權利要求1所 述的嵌合抗原受體修飾的NKT細胞。5. -種工程化⑶30靶向性的NKT細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 包裝攜帶PWPXL-⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的慢病毒，得到病毒濃縮液；利用得到的 病毒濃縮液感染NKT細胞，使NKT細胞表達嵌合抗原受體⑶30ScFv-⑶8-⑶137-⑶3 ζ。6. 根據權利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過如下方法制備NKT細胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個核細胞進行第一階段 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第一階段培養(yǎng)的實施方式包括：將單個核細胞培養(yǎng)于第一 NKT細胞培養(yǎng) 液中，所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介 素-15 ;進一步優(yōu)選地，第一 NKT細胞培養(yǎng)液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/ mL ； (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細胞進行第二階段培養(yǎng)；優(yōu)選地，所 述第二階段培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一階段培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)于第二NKT細胞培養(yǎng)液 中，所述第二NKT細胞培養(yǎng)液中含有NKT細胞培養(yǎng)基和白介素-2 ;進一步優(yōu)選地，第二NKT 細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。7. 根據權利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細胞進行第一階段感染培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將NKT細胞培養(yǎng)于第三NKT細胞培養(yǎng)液 中，所述第三NKT細胞培養(yǎng)液含有NKT細胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2 ;進 一步優(yōu)選地，第三NKT細胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL ; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的細 胞進行第二階段感染培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實施方式包括：將所述第一 階段感染培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞培養(yǎng)液中。8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞進行體外誘導，待細胞的 密度為80-90%時，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細胞進行擴增 培養(yǎng)；優(yōu)選地，所述體外誘導的實施方式包括：將所述第二階段感染培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)于所 述第二NKT細胞培養(yǎng)液中，所述擴增培養(yǎng)的實施方式包括：將細胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細胞 培養(yǎng)液中。9. 權利要求5-8中任意一項所述方法制備得到的工程化CD30靶向性的NKT細胞。10.權利要求4或9所述的工程化CD30靶向性的NKT細胞在制備用于治療腫瘤的制劑 中的應用，優(yōu)選地，所述腫瘤是CD30陽性的淋巴瘤，進一步優(yōu)選地，所述淋巴瘤為霍奇金淋 巴瘤。
【文檔編號】C12N5/10GK105924527SQ201510670506
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年10月13日
【發(fā)明人】韓為東, 王曉慧, 王瑤, 伍志強, 郭業(yè)磊, 代漢仁, 王春萌
【申請人】中國人民解放軍總醫(yī)院