提取植物基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于提取高完整度植物基因組DNA的方法。所述方法將植物組織在固定液中進(jìn)行固定，用刀切成小段放置于細(xì)胞核分離液中用勻漿器攪拌，隨后離心將大部分雜質(zhì)與細(xì)胞核分離，并用percoll細(xì)胞分離混合溶液進(jìn)一步進(jìn)行核層分離，并最終將細(xì)胞核包埋于低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中，最后在膠塊中進(jìn)行蛋白、RNA等物質(zhì)的去除。
【專利說明】
提取植物基因組DNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體的，涉及一種提取植物基因組DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近些年二代和三代測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了突飛猛進(jìn)的發(fā)展速度，極大的推動(dòng)了人類對于植物基因組學(xué)的認(rèn)識(shí)，而獲得完整性高、純凈度好的基因組DNA是獲得真實(shí)、準(zhǔn)確的基因組信息的前提和關(guān)鍵。目前常用的植物組織高分子量DNA提取方法包括Zhang等人和Peterson等人開發(fā)的方法，這些方法的缺陷在于提取的高分子量DNA成功率低、多糖等雜質(zhì)含量高，其主要有以下原因:首先是這些方法破碎組織的方式均為冷凍研磨，該方法稍有不慎，如研磨時(shí)間增長或者研磨力度過大，都會(huì)使核膜破裂導(dǎo)致未受到保護(hù)的DNA斷裂，其次是這些方法均使用離心-棄上清-重懸這樣的步驟進(jìn)行細(xì)胞核洗滌，從而去除細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、多糖多酚等物質(zhì)，但是該方法單一，無法有效去除雜質(zhì)，而且每次洗滌都會(huì)損失大量細(xì)胞核。另夕卜，這些方法使用的核分離液HB溶液中有大量的蔗糖，在保護(hù)DNA的同時(shí)也更容易引入多糖污染。上述這些弊端均會(huì)不同程度地破壞DNA的完整性，導(dǎo)致其在二代和三代測序技術(shù)中造成文庫構(gòu)建失敗或信息分析異常。
[0003]因此有必要開發(fā)一種能夠完整的提取植物基因組DNA的方法，為進(jìn)一步推動(dòng)植物基因組的研究和利用提供有效手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有的植物基因組提取方法中存在的缺陷，提供一種新的完整提取植物基因組的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種提取高分子量植物基因組DNA的方法，所述方法包括以下步驟:
[0006](一)將固定后植物組織與核分離液混合后利用勻漿器在30000-35000rpm的速度下勻漿處理30-40秒獲得勻漿混合物，用孔徑為80-100μπι的濾膜過濾所述勻漿混合物，收集濾液并在2000g-2500g下離心15-25min，收集沉淀；
[0007](二)用核分離液重懸步驟(一)獲得的沉淀，而后加入Triton X-100至Triton X-100終濃度為10-15體積％，獲得重懸混合物，用孔徑為20-40μηι的濾膜過濾，將濾液部分加至Ijpercoll細(xì)胞分離混合溶液上方，600g-650g離心30-50min后將中間層及緊挨著中間層下方的l_2ml液體一起吸出，獲得核液；
[0008](三)用核分離液重懸所述核液后離心去除percoll細(xì)胞分離混合溶液并收集沉淀，將沉淀用核分離液重懸并在43-45°C水浴3.5-4.5min后與瓊脂糖液混勻制膠塊；
[0009]其中，所述percoll細(xì)胞分離混合溶液的組成成分包括20-30體積％的核分離液和70-80體積％的？郎(:011細(xì)胞分離液。
[0010]其中，所述核分離液的組成成分包括:10mM-15mM Tris-HCL，10mM_25mM EDTA,10mM-150mM氯化鉀，10mM-20mM NaCl，0.5mM_l.5mM精胺，0.5mM_l.5mM亞精胺，0.25-0.5體積% Tr i tonX-100,2.5-7.5體積% M2-巰基乙醇和8-10 % (w/v) PVP1 (聚乙烯吡咯烷酮)。[0011 ] 其中，所述Percoll細(xì)胞分離液是經(jīng)過聚乙稀卩比略燒酮(polyvinyl pyrolidone，PVP)處理的硅膠顆?；鞈乙?，對細(xì)胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經(jīng)過高速離心后，可形成一個(gè)連續(xù)密度梯度，將比重不同的細(xì)胞分離純化。
[0012]在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，percol I細(xì)胞分離混合溶液可以為購自Pharmac ia公司的商品名為Per coll的產(chǎn)品。
[0013 ] 優(yōu)選的，步驟(二)中相對于每毫升的所述濾液部分，perco 11細(xì)胞分離混合溶液的用量為1-1.5ml。
[0014]在勻漿處理過程中，每勻漿12-15秒后在冰水中靜置冷卻30-40秒。
[0015]其中，步驟(一)中將固定后植物組織與核分離液按照1:8-12的質(zhì)量體積比混合。
[0016]優(yōu)選的，步驟(一)還包括，用清洗液清洗新鮮植物組織表面的雜質(zhì)后用固定液接觸固定獲得固定后植物組織；所述清洗液的組成成分包括:10mM-15mM Tris-HCL,1mM-30mM EDTA和10mM-150mM NaCl;所述固定液的組成成分包括:10mM-15mM Tris-HCL,1mM-30mM EDTA，10mM-150mM NaCl和終體積百分含量為2%的甲醛。
[0017]其中，清洗和固定的步驟包括:將新鮮植物組織按照1:10-15的質(zhì)量體積比與所述清洗液接觸，清洗植物組織表面的雜質(zhì)5-10分鐘，去除清洗液后將清洗后的植物組織按照I: 20-25的質(zhì)量體積比與固定液接觸，去除容器中的氣泡，在冰上固定20-25min后去除固定液，用清洗液在0-4 °C下洗滌植物組織后獲得固定后植物組織。
[0018]優(yōu)選的，步驟(一)還包括先將所述固定后植物組織切成尺寸為2X 2-3 X 3mm的小碎片后再與核分離液混合。
[0019]其中，在步驟(二)中，利用5-8倍體積的核分離液(體積相當(dāng)于沉淀體積的5-8倍的核分離液)重懸步驟(一)獲得的沉淀。
[0020]在步驟(二)中，輕柔的將所述濾液部分加在percoll細(xì)胞分離混合溶液上方，利用冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，離心后吸取中間層，以及位于中間層下方的緊挨中間層部分的l-2ml液體，作為核液。
[0021 ]優(yōu)選的，在步驟(三)中，利用5-8倍體積的核分離液(體積相當(dāng)于核液體積的5-8倍的核分離液)重懸核液，而后離心去除percoll細(xì)胞分離混合溶液并收集沉淀，該步驟優(yōu)選可以重復(fù)2-4遍，具體可以按照以下步驟進(jìn)行:加入沉淀5-8倍體積的核分離液重懸沉淀，并在4 °C下2500g離心8-12min，可以重復(fù)此步驟2_4遍。
[0022]在離心去除percoll細(xì)胞分離混合液并回收沉淀后，再利用5-8倍體積的核分離液重懸。
[0023 ]步驟(三)中制膠塊所使用的瓊脂糖液為1-2 %低熔點(diǎn)瓊脂糖液，優(yōu)選為2 %低熔點(diǎn)瓊脂糖液。
[0024]可選的，所述方法還包括先利用蛋白酶k溶液和RNA酶溶液對膠塊進(jìn)行孵育，再用Η)ΤΑ溶液和TE溶液對膠塊進(jìn)行清洗獲得清洗后膠塊，用溶膠酶溶解膠塊后透析獲得植物基因組DNA。
[0025 ] 其中，所述蛋白酶K溶液的組成成分包括:0.8-1.5mg/m I蛋白酶K、0.5 -1 % (v/V)M2-巰基乙醇，蛋白酶K緩沖液，所述蛋白酶K緩沖液可以為上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司貨號S#YM-S2049 的產(chǎn)品。
[0026]可選的，所述方法包括:
[0027](四)48-52°C下用相對于膠塊5_25倍體積的蛋白酶k溶液浸沒膠塊孵育12_24小時(shí)后在15-25°C下靜置4-6分鐘，靜置結(jié)束后去除液體組分，用5-25倍體積的蛋白酶K溶液孵育1.5-2.5h，15-25°C下靜置4-6分鐘獲得蛋白酶k孵育后膠塊。
[0028]具體的，在步驟(四)中，加入蛋白酶k溶液后，可以每10分鐘以450rpm-500rpm轉(zhuǎn)10-15秒獲得蛋白酶k.孵育后物料。
[0029 ](五)將所述蛋白酶k孵育后膠塊在RNA酶溶液中孵育去除RNA獲得RNA酶孵育后膠塊。
[0030]具體的，RNA酶孵育的步驟可以包括:將所述蛋白酶K孵育后膠塊與RNA酶溶液接觸，在37 °C孵育I小時(shí)，其中每10分鐘450rpm-500rpm轉(zhuǎn)10-15秒獲得RNA酶孵育后物料。
[0031]可選的，所述方法還包括:
[0032 ](六)在所述RNA酶孵育后膠塊中加入50mM的EDTA，晃動(dòng)1秒后棄液體，該步驟重復(fù)2-3遍，再加入50mM EDTA，室溫下在水平搖床上180rpm轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)15分鐘后棄液體，該步驟重復(fù)3-4遍;加入TE緩沖液，并且室溫下在水平搖床上180rpm轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)15分鐘然后棄液體，該步驟重復(fù)4-5遍。
[0033](七)吸干膠塊表面水分后將膠塊在70°C保溫使膠塊完全溶解后在43°C保溫5分鐘，加入溶膠酶混勻后在43°C孵育45分鐘，5000rpm離心I秒后將混合液于4°C保存。
[0034](八)準(zhǔn)備培養(yǎng)皿，加入TE緩沖液，用鑷子將0.1ym的透析膜飄在培養(yǎng)皿上，蓋上蓋子使膜徹底浸濕10分鐘，吸取DNA混合液混勻，滴在膜的中心，蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，室溫放置2-2.5小時(shí)，從膜中心吸取剩余DNA，5000rpm瞬時(shí)離心后于4 °C保存。
[0035]本發(fā)明所提供的方法可以用于各類型植物的新鮮幼嫩苗及葉片，以及幼嫩根尖部位的高分子量DNA提取。
[0036]本發(fā)明所提供的方法首先利用清洗液對植物組織進(jìn)行漂洗處理，并結(jié)合固定液對植物組織進(jìn)行固定保護(hù)，利用勻漿器對植物組織進(jìn)行破碎，同時(shí)利用percoll細(xì)胞分離混合溶液將核層與雜質(zhì)分開。最后將分離的細(xì)胞核與溶膠混合，蛋白消化、洗脫等過程均在膠塊中完成。該方法對植物起始量要求少，而且流程操作簡單，操作時(shí)長短，而且勻漿方法相對于研磨法來說更容易控制勻漿程度，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性強(qiáng)，大幅提高了所提基因組DNA的完整度。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所提取的水稻基因組DNA進(jìn)行0.75%瓊脂糖凝膠脈沖場電泳檢測的結(jié)果。泳道I為Lambda DNA/HindllI Marker ；泳道2為0.5個(gè)水稻細(xì)胞核包埋膠塊。
[0038]圖2為本發(fā)明對比例I所提取的水稻基因組DNA進(jìn)行0.75%瓊脂糖凝膠脈沖場電泳檢測的結(jié)果。泳道I為Lambda DNA/Hindll I Marker ；泳道3為0.5個(gè)水稻細(xì)胞核包埋膠塊，第2泳道和第4泳道未上樣。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0040]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。[0041 ] 實(shí)施例1
[0042]第一天:
[0043]1:將新鮮水稻葉片2.5g展平擦干，用刀片去除葉柄及主葉脈。轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。加入25ml清洗液，將葉片上的雜物和土壤洗掉，倒出液體。
[0044]清洗液的組分:1mMTris-HCL,20mM EDTA和 150mM NaCl。
[0045]2:加入60ml固定液完全淹沒組織樣。攪拌或者敲擊瓶子去除掉里面的氣泡放在冰上固定20min。
[0046]固定液的組分:1mM Tris-HCL,20mM EDTA，150mM NaCl和終體積百分含量為2%的甲醛。
[0047]3:倒掉固定液，加入60ml清洗液，震蕩瓶身盡量減少瓶子里的氣泡。冰上放置5min
后倒掉，重復(fù)三次。
[0048]4:將瓶子里的葉片取出擦干，放置于冰鎮(zhèn)的干凈平皿中。在葉片上滴2_4ml核分離液，使葉片微濕。
[0049]核分離液的組分:10mMTris-HCL,20mM EDTA，150mM氯化鉀，1mM NaCl，0.5mM精胺，0.5mM亞精胺，0.25% (v/v)TritonX-100,2.5% (v/v)M2_疏基乙醇和8% (w/v)PVP10。
[0050]5:用刀片切碎葉片至2 X 2mm小片，收集至50ml離心管中。
[0051 ] 6:加入25ml核分離液，將手持勻漿器(QIAGEN，#9001272)豎直插入到液面以下。
[0052]7:用35000rpm的速度攪拌15秒。將離心管放在冰上冰鎮(zhèn)30秒，并輕柔搖晃避免局部過熱。然后再用該速度攪拌15秒，攪拌結(jié)束后立即放在冰上。
[0053]8:將混合液用ΙΟΟμπι孔徑的濾膜過濾至新的50ml離心管中。
[0054]9:4°C下2500g離心力離心20min(升速=9，降速= 9)。
[0055]10:棄掉上清液，加入Iml核分離液重懸沉淀。隨后再加入3.5ml的核分離液，500μ1的 10% (ν/ν)的Triton X-100溶液，手搖30秒。
[0056]11:用40μπι孔徑的濾膜過濾，將濾液部分轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中。
[0057]12:輕柔將11步中的濾液部分加在5ml percoll細(xì)胞分離混合溶液的上面。冷凍離心機(jī)650g離心30min_50min(升速=9，降速=I)。
[0058]percol I細(xì)胞分離混合溶液的組成成分為2.5ml核分離液和7.5ml的percol I細(xì)胞分離液。
[0059]percol I細(xì)胞分離液購自Pharmacia公司，商品名為Percol I。
[0060]13:將中間的核層及核層下方2ml液體吸出至15ml離心管中。
[0061 ] 14:加入3ml核分離液，輕柔上下顛倒5-10次徹底混勻。4°C下650g離心30min，(升速=9，降速=9)棄掉上清，加入1ml核分離液重懸沉淀，并在4°C下2500g離心1min，(升速=9，降速=9)，重復(fù)此步驟2遍，徹底洗掉perco 11離心混合溶液。
[0062]15:棄掉上清，留下200μ1的液體。用寬口的槍頭重懸核沉淀，并將其轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，4°C下5000rpm離心5min。
[0063]16:完全棄掉上清，用核分離液混勻沉淀至186μ1，放至43°C水浴中4min，與114μ1的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖液混勻，并分別吸取90μ1放置在凝膠模具中。
[0064]17:將含有膠液的模具水平放入4°C冰箱20min，使膠塊徹底凝固。
[0065]18:50 °C下每個(gè)50ml康寧管中加入2.5ml蛋白酶k溶液(2.5ml蛋白酶k緩沖液(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，#YM-S2049 ),1%( ν/ν )M2-巰基乙醇，lmg/ml蛋白酶K)，每個(gè)管放置3個(gè)膠塊。
[0066]第二天:
[0067]1:過夜(12h)之后將離心管拿出，室溫下平衡5min。倒掉舊蛋白酶k，讓膠塊回到底部。
[0068]2:加入新的約2.7ml的蛋白酶k溶液。確保所有的膠塊都在溶液里，2h之后將離心管拿出，室溫下靜置5min去除液體組分。
[0069]3:加入 50μ1 RNA 酶，37 cC 孵育 I 小時(shí)。
[0070]4:將上述RNA酶溶液倒掉，加入1ml 50mM EDTA，室溫下在水平搖床上180rpm轉(zhuǎn)速輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)15分鐘，然后倒掉。重復(fù)此步驟7遍。
[0071]5:倒掉最后一遍的EDTA溶液，加入1ml TE緩沖液。并且室溫下在水平搖床上180rpm轉(zhuǎn)速輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)15分鐘然后倒掉。重復(fù)該步驟5遍。
[0072]6:倒掉最后一遍的TE緩沖液，用鈍邊的勺子或者鏟子撈出膠塊，微微傾斜鏟子，用潔凈的吸水紙吸干水分。將膠塊放入到1.7ml離心管中，一個(gè)管一個(gè)膠塊。
[0073]7:5000rpm離心I秒，使膠塊到離心管管底。
[0074]8:將離心管放到70°C的金屬浴中2分鐘，使膠塊完全溶解。
[0075]9:迅速將離心管放入43 °C金屬浴中5分鐘
[0076]10:每個(gè)管中加入2μ1溶膠酶，用槍頭旋轉(zhuǎn)混勻10秒。
[0077]11:將混合液在43 °C孵育45分鐘。
[0078]12: 5000rpm離心I秒，立即將混合液放入到4度冰箱。
[0079]13:準(zhǔn)備培養(yǎng)皿，加入15ml TE緩沖液。
[0080]14:用鑷子將0.Ιμπι的透析膜飄在培養(yǎng)皿上，蓋上蓋子使膜徹底浸濕10分鐘。
[0081 ] 15:用寬口的槍頭吸取DNA混合液混勻，滴在膜的中心，蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，室溫放置2.5小時(shí)。
[0082 ] 16:用寬口槍頭從膜中心吸取剩余DNA，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。4 °C保存。
[0083 ]通過以上步驟提取的 DNA，經(jīng) Nanodrop 檢測:260/280 = 1.81,260/230 = 2.19。
[0084]利用提取的水稻基因組DNA進(jìn)行0.75%瓊脂糖凝膠脈沖場電泳檢測結(jié)果(如圖1所示)。泳道I為Lambda DNA/HindIII Marker;泳道2為0.5個(gè)水稻細(xì)胞核包埋膠塊。
[0085]對比例I
[0086]首先取水稻嫩葉2.85g，在液氮中粗磨后立即轉(zhuǎn)入30ml預(yù)冷的IXHB(成分為0.0lMTris, 0.08M KCl,0.0lM EDTA ,Im M 精胺，Im M 亞精胺，0.5M 蔗糖)，使用前加入 0.15% (V/V)M2-巰基乙醇溶液，冰上攪拌10分鐘。將混合液用四層紗布和兩層神奇濾布過濾，并離心20min，條件為4°C，1800g。將沉淀直接用I X HB懸浮，用四層神奇濾布過濾，離心20min，條件為4°C，1800g。將沉淀直接用I XHB懸浮。之后從上述第一天16步后相同于實(shí)施例1。
[0087]通過以上方法提取的DNA，經(jīng)Nanodrop檢測:260/280= 1.51,260/230 = 1.38。Nanodrop檢驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法提取的DNA中多糖多酸類及蛋白類物質(zhì)殘余量高，電泳圖上有明顯降解現(xiàn)象(如圖2所示)，難以區(qū)分主帶，這是降解和雜質(zhì)共同作用的結(jié)果。
[0088]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提取高分子植物基因組DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: (一)將固定后植物組織與核分離液混合后利用勻漿器在30000-35000rpm的速度下勻漿處理30-40秒獲得勻漿混合物，用孔徑為80-100μπι的濾膜過濾所述勻漿混合物，收集濾液并在2000g-2500g下離心15-25min，收集沉淀； (二)用核分離液重懸步驟(一)獲得的沉淀，而后加入TritonX-100至Triton X-100終濃度為10-15體積％，獲得重懸混合物，用孔徑為20-40μηι的濾膜過濾，將濾液部分加到percol I細(xì)胞分離混合溶液上方，600g_650g離心30_50min后將中間層及中間層下方l_2ml液體吸出獲得核液； (三)用核分離液重懸所述核液后離心去除percoll細(xì)胞分離混合溶液并收集沉淀，將沉淀用核分離液重懸并在43-45°C水浴3.5-4.5min后與瓊脂糖液混勻制膠塊； 其中，所述percoll細(xì)胞分離混合溶液的組成成分包括20-30體積％的核分離液和70-80體積％的？郎(:011細(xì)胞分離液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(二)中相對于每毫升的所述濾液部分，percoll細(xì)胞分離混合溶液的用量為1-1.5ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(一)中將固定后植物組織與核分離液按照I:8-12的質(zhì)量體積比混合。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述核分離液的組成成分包括:10mM-15mMTris-HCL,10mM-25mM EDTA，100mM_150mM氯化鉀，10mM_20mM NaCl，0.5mM_l.5mM精胺，0.5mM-l.5mM亞精胺，0.25-0.5體積％TritonX-100,2.5-7.5體積％M2_巰基乙醇和8-10%聚乙烯吡咯烷酮。5.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(一)包括，用清洗液清洗植物組織表面的雜質(zhì)后用固定液接觸固定獲得固定后植物組織;所述清洗液的組成成分包括:10mM-15mM Tris-HCL，10mM-30mM EDTA和 100mM_150mM NaCl;所述固定液的組成成分包括Tris-HCL，10mM_30mM EDTA,1 OOmM-150mM NaCl和終體積百分含量為2%的甲醛。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(一)還包括先將所述固定后植物組織切成尺寸為2 X 2-3 X 3mm的小碎片后再與核分離液混合。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括先利用蛋白酶k溶液和RNA酶溶液對膠塊進(jìn)行孵育，再用EDTA溶液和TE溶液對膠塊進(jìn)行清洗獲得清洗后膠塊，用溶膠酶溶解膠塊后透析獲得植物基因組DNA。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的組成成分包括:0.8-1.5mg/ml蛋白酶K、0.5_1體積% M2-巰基乙醇，蛋白酶K緩沖液。9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、6-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (四)48-52°C下用5-25倍體積的蛋白酶k溶液浸沒膠塊孵育12_24小時(shí)后在15_25 °C下靜置4-6分鐘，靜置結(jié)束后去除液體組分，用5-25倍體積的蛋白酶K溶液孵育1.5-2.5h，15-25 °C下靜置4-6分鐘獲得蛋白酶k孵育后膠塊； (五)將所述蛋白酶k孵育后膠塊在RNA酶溶液中孵育去除RNA獲得RNA酶孵育后膠塊。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，所述植物組織為植物新鮮幼嫩苗、葉片或幼嫩根尖部位。
【文檔編號】C12N15/10GK105925564SQ201610325854
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】鄭洪坤, 劉慧 , 宋軍, 楊帆
【申請人】北京百邁客生物科技有限公司