一種紫花苜?？果}堿基因MsFLS及其編碼蛋白與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紫花苜?？果}堿基因MsFLS及其編碼蛋白與應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明公開的基因開放讀碼框全長1068bp，編碼355個氨基酸。具有SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，利用此序列信息，克隆該基因，構建MsFLS基因的克隆載體以及植物表達載體，并將該基因以農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草在含鹽堿成分的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結果表明轉(zhuǎn)基因植株與對照相比具有較強的耐鹽堿能力，說明MsFLS基因的過表達提高了植株對鹽堿的抗性，進一步說明該基因能夠參與植物的抗逆過程。本發(fā)明中的MsFLS基因為研究苜?？鼓娣肿訖C理及育種提供了理論依據(jù)。
【專利說明】
-種紫花首著抗鹽堿基因 MsFLS及其編碼蛋白與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體設及一種紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S及 其編碼蛋白與應用。
【背景技術】
[0002] 黃酬類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物中的一個龐大家族。在植物中，黃酬類化合物廣 泛參與各種生物學過程，包括對病原體的響應、授粉、光通路、種子發(fā)育等。另外，許多黃酬 類化合物的生物合成受到環(huán)境脅迫的誘導，因此，在植物受到生物或非生物脅迫時，黃酬類 物質(zhì)的表達水平會顯著增加，例如病原體，營養(yǎng)缺乏，鹽堿脅迫等。運些環(huán)境脅迫因素的共 同特點是，他們都會產(chǎn)生和積累次生活性氧，如超氧陰離子(〇2)、過氧化氨化2〇2)、徑基自 由基(OH)和單線態(tài)氧(1化)等。而活性氧的積累會導致胞內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫從而造成細胞組分 的損傷，例如核酸，脂質(zhì)，蛋白和多糖等物質(zhì)。植物細胞有一個復雜而完整的活性氧代謝系 統(tǒng)，包括酶促和非酶促調(diào)節(jié)機制。
[0003] 類黃酬物質(zhì)中包括多種廣為人知的抗氧化物質(zhì)參與植物活性氧代謝，例如抗壞血 酸，O-生育酪等。體外實驗中，黃酬類物質(zhì)作為氨離子和電子供體參與細胞的抗氧化代謝 中，抵御氧化脅迫的損傷。黃酬醇合成酶(FLS)是類黃酬合成代謝中的關鍵酶之一，催化3- 徑基黃酬生成黃酬醇，在鹽堿脅迫條件下受誘導大幅上調(diào)，進而調(diào)控類黃酬物質(zhì)在脅迫下 的響應。
[0004] ±壤鹽堿化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要因素之一，研究植物耐受機理和提高作物耐鹽堿 性已經(jīng)日漸成為廣泛關注的問題。鹽堿脅迫通常會引起植物細胞離子和滲透壓的失衡，并 因此引發(fā)次級的脅迫傷害，例如活性氧積累而形成的氧化脅迫，鹽堿脅迫伴隨的高pH更是 可W直接對細胞質(zhì)膜造成氧化損傷。長期W來，研究者利用形態(tài)學和生理學的研究方法已 經(jīng)初步認識了植物應對鹽堿脅迫的響應機制，并W基因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化等技術分析上述過 程中部分關鍵基因的功能，基因忍片技術也用于研究鹽堿脅迫下植株的轉(zhuǎn)錄組變化特征， 例如擬南芥，水稻等植物。盡管近年來已經(jīng)鑒定了一系列逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導途徑及相關基 因，但是目前對植物耐鹽堿機制研究的資料仍然十分匿乏，完善的植物鹽堿耐受機制尚未 建立，值得進行更加深入的研究。
[0005] 紫花首猜作為種植廣泛的牧草，有"牧草之王"的美稱，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，是 美國第=大作物，在我國也有大面積種植，是一種極具經(jīng)濟價值的豆科牧草。紫花首猜屬于 中等耐鹽堿植物，對鹽堿脅迫具有一定的耐受能力，但鹽堿脅迫仍是影響中國東北地區(qū)紫 花首猜產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一，嚴重限制了該地區(qū)紫花首猜的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種紫花首猜抗鹽堿基因 MsFLS及其編碼蛋白與應用。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)：
[000引本發(fā)明公開了一種紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S，該抗鹽堿基因 Ms化S的核巧酸序列 如沈Q. ID.NO. I所示。
[0009] 該抗鹽堿基因 MsFLS全長為1068bp，編碼355個氨基酸。
[0010] 本發(fā)明公開了由上述紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序 列如沈Q. ID.NO. 2所示。
[0011] 本發(fā)明公開了含有上述的紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S的表達載體，該表達載體為 植物表達載體pCBM-FLS。
[0012] 本發(fā)明還公開了上述的紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S在提高紫花首猜對環(huán)境鹽堿脅 迫抗性中的應用。
[0013] 構建含有權利要求1所述紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S的植物表達載體，再將所構建 的植物表達載體通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化到煙草組織中，篩選獲得鹽堿抗性增強的植物。
[0014] 本發(fā)明還公開了上述紫花首猜抗鹽堿基因 Ms化S編碼的蛋白在提高紫花首猜對環(huán) 境鹽堿脅迫抗性中的應用。
[0015] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有W下有益的技術效果：
[0016] 本發(fā)明從紫花首猜中獲得Ms化S基因的全長cDNA，該基因的核巧酸序列如序列表 SEQ ID NO: 1所示，其編碼的蛋白氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明克隆了紫 花首猜MsFLS基因，并通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草，獲得過表達MsFLS基因煙草，轉(zhuǎn)基因煙草 在含鹽堿成分的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結果表明轉(zhuǎn)基因植株與對照相比具有較強的鹽堿耐受能 力，說明Ms化S基因的過表達提高了轉(zhuǎn)基因植株對鹽堿的抗性，說明該基因能夠參與植物的 抗逆過程。本發(fā)明中的Ms化S基因為研究首猜抗逆分子機理及育種提供理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0017]圖1為Ms化S的核巧酸和氨基酸序列信息；
[0018] 圖2為MsFLS與其他物種同源蛋白系統(tǒng)進化關系；
[0019] 圖3為植物表達載體pCBM-FLS構建示意圖
[0020] 圖4為過表達MsFLS轉(zhuǎn)基因煙草幼苗葉片PCR檢測圖；
[0021] 其中，V'為陽性對照，為陰性對照，0為空白對照，1-12為PCR獲的目的條帶，與 陽性一致，為轉(zhuǎn)基因植株；
[0022] 圖5為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L6與野生型煙草WT在30mmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和7 天后的葉片表型；
[0023] 圖6為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L6與野生型煙草WT在30mmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和7 天后煙草葉片的葉綠素含量；
[0024] 圖7為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L6與野生型煙草WT在30mmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和7 天后煙草葉片MDA的含量；
[0025] 圖8為Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草L16與野生型煙草WT在SOmmol L-I碳酸氨鋼脅迫處理0天和 7天后進行的NBT染色。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0027] I、紫花首猜MsFLS基因的克隆
[00巧]從NCBI數(shù)據(jù)庫中化ttp://www.ncbi.nlm.n化.gov/)捜索紫花首猜近源物種裝襲 首猜的核巧酸序列并保存，通過對紫花首猜鹽堿脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測序獲得紫花首猜中受鹽 堿脅迫誘導表達的化S基因，通過BLAST比對和進化樹分析確定化S基因的核巧酸序列。利用 該序列設計克隆引物，引物為：
[00 巧]MsFLS-F:5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3';
[0030] MsFLS-R:5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3 \
[0031 ] 具體流程如下：
[0032] 1)RNA的提?。豪肨RIZOL試劑盒提取紫花首猜(Medicago sativa)全株RNA，經(jīng) RT-PCR反轉(zhuǎn)錄為CDNA，W該CDNA為模板進行Ms化S基因的克??；
[0033] 2)RT-PCR反應：用反轉(zhuǎn)錄試劑盒化irst Strand cDNA Synthesis Kit,Toyobo)進 行RT-PCR反應，反應程序：37°C延伸15min;98°C變性5min。反轉(zhuǎn)錄植物全株RNA，獲得單鏈 CDNA，W內(nèi)參引物Act in為引物，W該CDNA為模板進行PCR評估CDNA質(zhì)量無誤，用W進行后續(xù) 實驗；
[0034] 3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHSa(Toyobo)中，將插入的核巧酸序列利用CEQ8000 DNA Sequence;r(Beckman Coulter,California,USA)進行測序；
[0035] 4)最終拼接獲取MsFLS基因 ORF的CDS全長序列。MsFLS基因 CDS全長為1068bp，編碼 355個氨基酸。將其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，發(fā)現(xiàn)與MtFLS (Medicago truncatula丄)相比，氨基酸同源性為97%，具備2個保守結構域，包括一個氨基端的鐵離子 依賴的DIOX結構域和一個20G-FeII_0xy結構域，結果如圖1所示。通過對其它物種中近源基 因的比對及進化樹構建可見，紫花首猜化S基因與裝襲首猜，大豆，鷹嘴豆等植物中的同源 基因進化關系較近，與小麥等植物進化關系較遠，結果參見圖2。
[0036] 2、紫花首猜MsFLS基因植物表達載體構建
[0037] 1) W本發(fā)明中MsFLS的CDNA序列，設計引物如下：
[0038] MsFLS-F:5'-ATGGCTCTGGAGGCATCCTC-3';
[0039] MsFLS-R:5'-TTATTTATCCATCTCCTTTT-3 \
[0040] W紫花首猜CDNA為模板，擴增MsFLS基因序列。
[0041] 反應條件：
[0042]
[0043] PCR產(chǎn)物低溫保藏備用；
[0044] 2)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN)，回收PCR產(chǎn)物，獲得的PCR產(chǎn)物與T載體 pMD-lST進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞D冊a,挑取轉(zhuǎn)化陽性的克隆提取質(zhì)粒 送交上海生工公司進行測序，經(jīng)過測序獲得正確序列的克隆用于后續(xù)實驗；
[0045] 3)將pCBM質(zhì)粒用PstI進行酶切，去憐酸化，并用瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段， 同時用PstI進行酶切連接在T載體的FLS片段，并回收，將回收的FLS片段與pCBM載體片段連 接，然后后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，獲得重組克隆，結果酶切和PCR檢測后將正確的克隆命名 為pCBM-FLS，載體圖如圖3所示。
[0046] 3、農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草
[0047] 1)煙草的培養(yǎng)
[004引野生性煙草SR-I種子40粒W75%的乙醇浸沒3min后用滅菌蒸饋水反復沖洗6次， 然后W10%的次氯酸鋼原液浸泡15min，再用滅菌蒸饋水清洗6次，將種子置于MS固體培養(yǎng) 基中。待種子萌發(fā)后，移至含有MS固體培養(yǎng)基的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，待其葉片足夠大時進行侵 染。
[0049] 2)農(nóng)桿菌菌液制備
[0化0] 挑取-80°C凍存的帶有Ms化S重組表達載體的農(nóng)桿菌甘油菌在YEB+50mg/L Rif+ 50mg/L Km巧Omg/L Str的固體培養(yǎng)基上活化菌株，并在28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36-4化，將 活化得到的農(nóng)桿菌單菌落接種于相同成分的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)約16-24h， 0D600 = 0.4-0.6。取出培養(yǎng)液按照1:10接種相同成分的YEB液體培養(yǎng)基中進行二次活化，當 00600 = 0.4-0.6時，將菌液倒入無菌的50ml的離屯、管，于4°C條件下，5000巧m離屯、IOmin，去 掉上清液，用MS培養(yǎng)液重懸菌體至0D600為0.4左右，用于轉(zhuǎn)化。
[0051] 3)煙草的侵染
[0052] 在超凈工作臺內(nèi)，將重懸的農(nóng)桿菌菌液倒入無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)的煙草SR-I葉 片切至0.8mm的方形，作于外植體置于菌液中浸泡8min，其間不斷震蕩。取出外植體置于無 菌濾紙上吸去附著菌液，葉背面朝上接種于誘導愈傷組織形成的培養(yǎng)基MSl (MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA)，在25±2°C條件下暗培養(yǎng)48-7化。然后接種到MS2(MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L NAA+l.lmg/L PPT巧OOmg/L Cef)培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，每20d更換一次誘導培 養(yǎng)基。經(jīng)過侵染的葉片長出新的幼芽時，放入到MS3(MS+1.3mg/L PPT+500mg/L Cef)培養(yǎng)基 中進行生根，W待后續(xù)分子鑒定。
[0053] 4)轉(zhuǎn)基因煙草小量DNA的提取
[0化4] 稱取植物樣品0.1 g,液氮研磨，向管中加入70化1預熱到65。(：的2 XCTAB Buffer緩 沖液，混勻，65°C水浴45min，每5min輕輕的顛倒混勻，之后將離屯、管取出置于冰上，冷卻至 室溫，加入等體積的酪:氯仿:異戊醇搖勻，12000rpm離屯、IOmin，取上清，向管中加入與上清 等體積的氯仿-異戊醇（24:1)輕輕混勻，4°C，12000rpm離屯、IOmin，取上清，加 1/10體積 3mol/L醋酸鋼和2倍體積預冷乙醇(或等體積異丙醇），輕輕搖勻至出現(xiàn)絮狀沉淀，置-20°C 醇沉30min，之后離屯、15min，棄上清，加入50化1預冷的70 %乙醇沖洗，離屯、IOmin，棄上清， 空氣干燥，加入去離子水溶解。
[0055] 4、轉(zhuǎn)MsFLS基因的煙草轉(zhuǎn)化體的獲得W及轉(zhuǎn)化體的PCR檢測
[0化6] PCR鑒定:FLS內(nèi)部基因引物如下 [0057 ] Pr imer 1:5 '-TCTTGATCAATCCTTCCATC-3 '
[0化引 Primer 2:5'-GAATTTGTTCGATCTCTTGG-3'
[0化9]反應條件：
[006
[0061] 參見圖4, W提取的陽性植株的DNA為模板，用Ms化S內(nèi)部基因引物進行PCR擴增，瓊 脂糖凝膠電泳結果顯示編號16為PCR獲得的目的條帶，與陽性一致（即能擴增出大約500bp 的目標DNA條帶），為轉(zhuǎn)基因植株。其中，V'為陽性對照，為陰性對照（即W野生型植株基 因組DNA為模板的PCR檢測結果），0為空白對照，M為Marker DL2000。
[0062] 5、轉(zhuǎn)基因煙草植株功能的初步驗證
[0063] 1)配制30mmol L-In址C〇3溶液。
[0064] 2)煙草葉綠素含量測定
[0065] 取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草相同狀態(tài)的葉片，用7mm直徑的打孔器打孔，用化肥化培養(yǎng) 液脅迫處理7天，觀察葉片變化，記錄并拍照。參見圖5,在30mM鹽堿脅迫處理下，野生型煙草 明顯變黃，轉(zhuǎn)基因株系維持綠色，表明轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫的耐受性顯著高于野生型，30mM 鹽堿脅迫條件下轉(zhuǎn)基因株系葉片丙二醒含量，NBT染色結果表明轉(zhuǎn)基因型植株的葉片在脅 迫條件下生成的超氧陰離子顯著低于野生型，W上實驗結果表明Ms化S基因在煙草中的過 表達提升了煙草對鹽的耐受能力。
[0066] 取上述脅迫處理7天的葉片，提取葉綠素，測定葉綠素含量，計算鹽脅迫處理7天后 植株葉綠素含量的變化量。測葉綠素含量方法如下：
[0067] ① 0.1 g葉片放入預冷的研鉢中，加 Iml預冷80%丙酬，加入少量石英砂研磨
[0068] ②轉(zhuǎn)移液體到大離屯、管中，用80%丙酬洗研鉢直至無色。
[0069] ③ 10000巧m，離屯、5min，4°C。
[0070] ④取上清(記取上清量）。
[0071 ] ⑤像沉淀中加入80 %丙酬，洗沉淀，再離屯、，直至沉淀無色(記取上清量）。
[0072] 注:取上清的離屯、管暗處理。
[0073] @樣品測定:取31111上清液在645]11]1和663]11]1處測吸光值。80%丙酬調(diào)零。
[0074] ⑦結果計算：Ca= 12.72A663- 2.59A64 已
[0075] Cb = 22.88A645-4.67A663
[0076] Ca+b = 20.21A645+8.02A663
[0077] 葉綠素含量(mg ? g-I或mg ? dm-2) =CXV/AX 1000
[0078] 式中：C為葉綠素濃度(mg ? kl) ;V為提取液總體積(ml) ;A為取樣鮮重(g)。
[0079] 轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在30mM Na肥化脅迫下，葉綠素含量因脅迫下降，轉(zhuǎn)基因 植株在脅迫7天條件下，葉綠素含量明顯高于相同脅迫條件下野生型植株，如圖6所示。
[0080] 3)轉(zhuǎn)基因葉片MDA含量測定
[0081 ] 取上述脅迫處理7天的葉片，測定MDA含量。
[0082] ①植物葉片置于預冷研鉢中，加入=氯乙酸研磨，離屯、取上清。
[0083] ②4 °C 1000巧m離屯、IOmin，取上清，上清即酶液。
[0084] ③測定液:2ml酶液+2ml TBA;對照調(diào)零:2ml蒸饋水+2ml TBA。
[0085] ④10(TC20分鐘，降至常溫。
[0086] ⑤4°C 5000巧m離屯、15min，取上清?，F(xiàn)化32nm和450nm處OD值。
[0087] 計算公式如下：
[008引丙二醒含量(皿ol/g) = (6.45 XA532 -0.56 XA450) X ViAWX V2)
[0089] Vi:樣品液體總體積(ml)
[0090] V2:測定時樣品體積(ml)
[0091] W:樣品鮮重(g)
[0092] 將生長狀態(tài)相同的野生型煙草和Ms化S轉(zhuǎn)基因煙草用含30mM化肥化的MS培養(yǎng)基 脅迫處理7天，巧憶丙二醒(MDA)的含量。結果如圖7所示，轉(zhuǎn)基因株系在脅迫下的MDA積累量 顯著低于野生型煙草。
[0093] 4)脅迫下煙草葉片NBT染色
[0094] 取脅迫處理的轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片于小瓶中，加入NBT染液（Img/mL)直至浸 沒樣品，將處理過的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片浸泡在染色液中，在室溫黑暗培養(yǎng)過夜。吸去 染色液，加入乙醇:甘油：乳酸(3:1:1)漂洗液，沸水浴10分鐘，迅速冷卻，換漂洗液，至去除 全部葉綠素。染色結果如圖8所示。在30mM鹽堿脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因植株的著色范圍顯著小 于野生型煙草。
[00M]綜上所述，本發(fā)明公開了紫花首猜的Ms化S基因及其克隆方法和應用，該基因開放 讀碼框全長l〇68bp，編碼355個氨基酸。利用此序列信息，克隆該基因，構建Ms化S基因的克 隆載體W及植物表達載體，并將該基因W農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草 在含鹽堿成分的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結果表明轉(zhuǎn)基因植株與對照相比具有較強的耐鹽堿能 力，說明Ms化S基因的過表達提高了植株對鹽堿的抗性，進一步說明該基因能夠參與植物的 抗逆過程。本發(fā)明中的Ms化S基因為進行植物抗逆分子育種提供了新的基因資源，為研究植 物抗逆分子機理奠定了基礎。
【主權項】
1. 一種紫花苜?？果}堿基因 MsFLS，其特征在于，該抗鹽堿基因 MsFLS的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.1 所示。2. 如權利要求1所述的紫花苜?？果}堿基因 MsFLS，其特征在于，該抗鹽堿基因 MsFLS全 長為1068bp，編碼355個氨基酸。3. 由權利要求1所述的紫花苜?？果}堿基因 MsFLS編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白的 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。4. 含有權利要求1所述的紫花苜?？果}堿基因 MsFLS的表達載體，其特征在于，該表達 載體為植物表達載體PCBM-FLS。5. 權利要求1所述的紫花苜?？果}堿基因 MsFLS在提高紫花苜蓿對環(huán)境鹽堿脅迫抗性 中的應用。6. 如權利要求5所述的應用，其特征在于，構建含有權利要求1所述紫花苜?？果}堿基 因 MsFLS的植物表達載體，再將所構建的植物表達載體通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化到煙草組織 中，篩選獲得鹽堿抗性增強的植物。7. 權利要求2所述的蛋白在提高紫花苜蓿對環(huán)境鹽堿脅迫抗性中的應用。
【文檔編號】C12N15/53GK105925589SQ201610414881
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】郭長虹, 安逸民, 杜秉昊, 張軍, 張雪
【申請人】哈爾濱師范大學