一種用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的引物對(duì)及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的引物對(duì)及其應(yīng)用，所公開的引物對(duì)由SEQ ID No.1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成。
【申請(qǐng)人】進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明所公開的引物對(duì)能夠特異性的、高靈敏的判別病羊鼻腔分泌物樣品中是否含有羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因。
【專利說明】
-種用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的引物對(duì)及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒檢測(cè)的 引物對(duì)及其在檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊地方性鼻內(nèi)腫瘤（enzootic nasal tumor,ENT)是由羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒 (enzootic nasal tumor virus,ENTV)引起的一種慢性、進(jìn)行性、接觸傳染性的腫瘤性疾 病，該病表現(xiàn)為食欲減退，極度消瘦，呼吸困難，鼻漏，出現(xiàn)鼻內(nèi)單側(cè)或雙側(cè)性增生物，至今 報(bào)道的病例多數(shù)為腺癌，少數(shù)為乳頭狀腺瘤。本病目前已呈世界性分布，我國(guó)的內(nèi)蒙古、湖 南、四川、陜西等地也有該病發(fā)生。ENTV感染細(xì)胞后可誘導(dǎo)羊鼻內(nèi)粘膜上皮細(xì)胞非急性轉(zhuǎn)化 (即具有致瘤性），誘導(dǎo)腫瘤的產(chǎn)生。ENT-年四季均可發(fā)生，呈地方性流行，也有爆發(fā)或散 發(fā)，發(fā)病率5%~16%，死亡率100%。由于該病的潛伏期長(zhǎng)達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年，引起腫瘤，給養(yǎng) 羊業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] ENTV在分類學(xué)上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，扣I轉(zhuǎn)錄病毒屬的B/D嵌合型逆轉(zhuǎn)錄病毒。病 毒粒子呈圓形，直徑90皿~110皿，有囊膜，核衣殼為二十面體對(duì)稱，ENTV的基因組是單股正 鏈線性RNA(ssRNA)的二聚體，單體長(zhǎng)約7.化b。目前，我國(guó)用于羊地方性鼻內(nèi)腫瘤的實(shí)驗(yàn)室 診斷手段比較落后，主要依據(jù)臨床癥狀及其剖檢觀察進(jìn)行判斷，缺乏快速、簡(jiǎn)便的診斷方 法。國(guó)外已有利用RT-PCR方法從腫瘤組織中檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的報(bào)道，但運(yùn)需要 屠宰羊，提取腫瘤組織，所需時(shí)間較長(zhǎng)，耗時(shí)費(fèi)力，最主要不能進(jìn)行活體感染羊的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒檢測(cè)引物對(duì)。
[0005] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的引物對(duì)，由SEQ ID No.1 所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成。
[0006] 上述所公開的引物對(duì)特異性的針對(duì)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒不同基因中的高度保 守區(qū)域，能夠準(zhǔn)確、快速、方便的判別待測(cè)樣品中是否含有羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因，且 具有較高的靈敏度。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的PCR試 劑，包含由SEQ ID No. 1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)。
[000引本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的檢測(cè)試劑盒，包含上述 的引物對(duì)或PCR試劑。
[0009] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，作為完整商業(yè)和應(yīng)用封裝的試劑盒，為了提高檢測(cè)的 準(zhǔn)確性，便于進(jìn)行陰性和陽性對(duì)照，上述試劑盒中還可含有羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的陽性 對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0010] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，為了便于應(yīng)用，上述試劑盒中還可包含便于快速操作 使用的其它輔助試劑，如DNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑、電泳試劑等，運(yùn)些成分是PCR擴(kuò)增檢測(cè) 中常用的，其用量和使用也為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟練掌握，此處不予寶述。
[0011]最后，本發(fā)明還公開了上述的引物對(duì)、PC時(shí)式劑、檢測(cè)試劑盒在鑒別和檢測(cè)羊地方 性鼻內(nèi)腫瘤病毒中的應(yīng)用。
[001^ 具體的說，是WSEQ ID No. 1所示的單鏈DNA和沈Q ID No.2所示的單鏈DNA分別作 為上游引物、下游引物，對(duì)待測(cè)樣品中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;檢測(cè)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有314bp特異性片段(該片段的堿基排列如SEQ ID No.3所示），則表明待 測(cè)樣品羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒陽性。相應(yīng)的，如果沒有擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)片段，則表明待檢樣品中 羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒陰性。
[0013] 在上述應(yīng)用中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件可采用常見分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材上記載的常規(guī) 條件、時(shí)間、溫度、循環(huán)次數(shù)，作為一種優(yōu)選，PCR擴(kuò)增條件為變性溫度94 °C、退火溫度55°C、 延伸溫度72 °C。
[0014] 與已有技術(shù)方案相比，本發(fā)明具有如下技術(shù)進(jìn)步:本發(fā)明采用的引物對(duì)來自羊地 方性鼻內(nèi)腫瘤病毒不同基因中高度保守的區(qū)域，能準(zhǔn)確、快速、方便的判別病料中是否含有 羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒，靈敏度達(dá)0.5pg;本發(fā)明的引物對(duì)在PCR檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病 毒中具有敏感性高、特異性好的特點(diǎn)。
【附圖說明】
[0015] 圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)電泳圖：其中，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量化-2000,1~5為羊地方性鼻 內(nèi)腫瘤的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0016] 圖2為PCR方法敏感性試驗(yàn)：其中，1~6為所用模板的量分別為5ng，50化g，50pg， 5pg，0.5pg，0.05pg，M 為標(biāo)準(zhǔn)分子量化-2000;
[0017] 圖3為PCR方法檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的特異性試驗(yàn)：其中，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量 Dk2000，1為羊地方性鼻內(nèi)腫瘤患羊腫瘤樣品，2為羊地方性鼻內(nèi)腫瘤患羊鼻拭子樣品，3為 羊口瘡疫苗，4為口蹄疫疫苗，5為小反當(dāng)獸疫疫苗，6為山羊痘疫苗，7為正常羊鼻液樣品，8 為羊胚胎成纖維細(xì)胞樣品，9為陰性對(duì)照；
[0018] 圖4為試劑盒保存不同時(shí)間后PCR擴(kuò)增結(jié)果:其中，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量化-2000,1為保 存一個(gè)月，2為保存=個(gè)月，3為保存六個(gè)月，4為保存九個(gè)月，5為保存十二個(gè)月；
[0019] 圖5為試劑盒凍融不同次數(shù)后PCR擴(kuò)增結(jié)果:其中，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量化-2000,1為凍 融1次，2為凍融3次，3為凍融6次，4為凍融10次，5為凍融20次。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了更好的說明本發(fā)明技術(shù)方案的效果及其操作方法，在如下實(shí)施例中
【申請(qǐng)人】提 供了本發(fā)明引物對(duì)、試劑盒、PC時(shí)式劑等的具體類型、規(guī)格、用量、操作過程。本領(lǐng)域技術(shù)人員 容易理解，如下所提供的實(shí)現(xiàn)僅為示意性的，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成特別限定。本發(fā)明的保護(hù)范 圍涵蓋于權(quán)利要求及其等同變換。
[0021 ]實(shí)施例1:引物對(duì)W及采用本發(fā)明引物對(duì)和相關(guān)PC時(shí)式劑的試劑盒的制備 [0022]羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒病料的獲?。号R床病料于2015年8月采自陜西省寶雞市和 楊凌高新農(nóng)業(yè)技術(shù)示范區(qū)羊養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病羊的鼻腔棉拭子共21份，將棉拭子加30化L生理鹽 水浸泡20min，轉(zhuǎn)入1.5mL的EP管，反復(fù)凍溶2~3次后，于-20°C保存。
[0023] 引物：上游引物PUENTVS): 5 ' -AATATTTCTTTAGATCTTC-3 '，下游引物P2化NTVA): 5 ' -CCTAAAAGCTCCATTAGC-3 '，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為314bp。引物由上海英俊合成，20D/管。
[0024] 試劑盒所用其它PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)用試劑：
[0025] DNA提取試劑:購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的的病毒核酸提取試劑盒 (血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒DP304)。
[0026] 超純水(d地20):自行過濾制備，ImL/管。
[0027] 2XPCP master Mix:購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，ImL/管。
[002引 50 X TAE電泳緩沖液采用0.5mo 1 /L乙錠四乙酸二鋼（化DTA)溶液(P冊(cè).0)配制，配 置過程為:邸TA 18.61g、滅菌雙蒸水80mL、氨氧化鋼調(diào)抑至8.0、滅菌雙蒸水加至lOOmL。
[0029] 50 X TAE電泳緩沖液配制過程為:S徑甲基氨基甲燒(Tris)242g、冰乙酸57 . ImL、 0.5mol/L邸TA溶液(p冊(cè).0)lOOmL、滅菌雙蒸水加至lOOOmL，使用時(shí)滅菌雙蒸水稀釋50倍。
[0030] Glodview核酸染料:購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，ImL/管。
[0031] 上樣緩沖液：購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（2 XPCP master Mix中已加 入），ImL/管。
[0032] 將上述試劑和器材封裝到試劑盒中，用量可如下所示：
[0033] 羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各5(K)yL
[0034] DNA提取試劑:可直接采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的病毒核酸提取試 劑盒(血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒DP304);
[0035] PCR反應(yīng)試劑：由引物Pl 1 扣L(IOmM),引物P2 1 扣L(IOmM),2XPCR MasterMix 200化和d地20 (超純水)200化組成；
[0036] 電泳檢測(cè)試劑：由50XTAE電泳緩沖液20mL，GoldView 50化組成。
[0037] 實(shí)施例2:基于本發(fā)明的檢測(cè)方法
[003引主要儀器如下：？〔巧廣增儀化卵611(10計(jì)）、離屯、機(jī)（1-14,51肖1]1日）、紫外凝膠成像儀 (JS-780全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，上海培清）、電泳槽(DYCP-31BN，北京六一生物科技有限 公司）。
[0039] 具體方法如下；
[0040] 首先進(jìn)行待測(cè)樣品DNA的提取:采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的的病毒 核酸提取試劑盒(血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒DP304)，根據(jù)說明書提取病毒的DNA，具 體為：
[0041 ] (Ia)取羊鼻腔棉拭子放入含有20化L PBS液的EP管，浸泡20min，使羊鼻腔內(nèi)容物 進(jìn)入PBS液中，棄去棉拭子，留下的液體作為樣品，如果樣品不足20化L，可加PBS至20化L。
[0042] (化)加入20山Proteinase K溶液，混勻，在56°C放置，直至組織溶解，簡(jiǎn)短離屯、W 去除管蓋內(nèi)壁的水珠，再進(jìn)行下一步驟。。
[0043] (Ic)加入200iil緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離 屯、W去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0044] (Id)加人2(K)山無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離 屯、W去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0045] (Ie)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12，000巧m離屯、30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0046] (If)向吸附柱CB3中加入50化I緩沖液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇）， 12，O(K)巧m離屯、30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0047] (Ig).向吸附柱CB3中加入eOOiil漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙 醇），12，000巧m離屯、30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[004引（化)將吸附柱CB3放回收集管中，12,00化口111離屯、2111111，倒掉廢液。將吸附柱〔83置 于室溫放置數(shù)分鐘，W徹底驚干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0049] (II)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50- 200iil洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12，000巧m離屯、2min，將溶液收集到離屯、管中，-20°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 如采用其它廠家的病毒核酸提取試劑盒，按照其提供的說明書操作即可。
[0051] 然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)：
[0化2] 2化LPCR擴(kuò)增體系：2 XPCR Master Mix 12.扣レddH20 6.扣レ上游引物Pl 下游引物P2 1化和模板化L
[0053] PCR 反應(yīng)條件:94°C5min;然后 94^3〇3,55^3〇3,72^3〇8,30個(gè)循環(huán)；最后72。(：延 伸 IOmin，4 °C 保存。
[0054] 最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳：
[0055] 將0.5g瓊脂糖和50mL 1 XTAE置于錐形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView 1.0化，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取10化點(diǎn)于已凝固的瓊脂糖凝 膠孔中，WllOV電壓于1 XTAE中電泳35min
[0056] 基于上述過程，判斷結(jié)果：
[0057] 紫外燈下觀察結(jié)果。如果擴(kuò)增出一條314bp特異性片段，則表明待檢棉拭子羊地方 性鼻內(nèi)腫瘤病毒陽性;如果沒有擴(kuò)增出片段，則表明待檢棉拭子羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒陰 性，結(jié)果見圖1。
[005引實(shí)施例3:本發(fā)明檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)。
[0059] W羊地方性鼻內(nèi)腫瘤組織提取的DNA為模板，從5ng DNA開始按10倍遞增稀釋，用 羊地方性鼻內(nèi)腫瘤組織提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖 凝膠電泳，結(jié)果表明PCR方法可檢測(cè)出5pg的模板DNA，具有較高的敏感性，結(jié)果如圖2所示。
[0060] 實(shí)施例4:特異性試驗(yàn)。
[0061] 用相同的方法提取羊地方性鼻內(nèi)腫瘤患羊腫瘤樣品，羊地方性鼻內(nèi)腫瘤患羊鼻棉 拭子樣品，羊口瘡疫苗，口蹄疫疫苗，小反當(dāng)獸疫疫苗，山羊痘疫苗，正常羊鼻棉拭子樣品， 羊胚胎成纖維細(xì)胞樣品組織的DNA，并W此為摸板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1 %的瓊脂 糖進(jìn)行凝膠電泳，只有羊地方性鼻內(nèi)腫瘤患羊腫瘤樣品和鼻棉拭子樣品擴(kuò)增出一條314bp 的片段，將羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，與Genbank中已發(fā)表的序列進(jìn) 行比較，結(jié)果與已發(fā)表的羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因序列達(dá)99%的同源性，運(yùn)表明所擴(kuò)增 的片段為羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒，而羊口瘡疫苗，口蹄疫疫苗，小反當(dāng)獸疫疫苗，山羊痘疫 苗，正常羊鼻棉拭子樣品，羊胚胎成纖維細(xì)胞樣品組織的DNA和陰性對(duì)照都未擴(kuò)增出條帶 來，運(yùn)表明該方法所擴(kuò)增的片段為羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的特異性片段，結(jié)果如圖3所示。
[0062] 實(shí)施例5:穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0063] 將試劑保存于-20°C，經(jīng)過一年的保存和反復(fù)凍融后，對(duì)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的 模板重新進(jìn)行檢測(cè)，見圖4和圖5,結(jié)果表明，該試劑盒的穩(wěn)定性較好，可W長(zhǎng)期保存。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的引物對(duì)，其特征在于由SEQ ID No.1所 示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成。2. -種用于檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因的PCR試劑，其特征在于包含權(quán)利要求1中 的由SEQ ID No. 1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)。3. -種羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的引物 對(duì)或權(quán)利要求2所述的PCR試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3的檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒的陽性對(duì)照 和陰性對(duì)照。5. 權(quán)利要求1的引物對(duì)，或權(quán)利要求2的PCR試劑，或權(quán)利要求3的檢測(cè)試劑盒，在鑒別和 檢測(cè)羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于以SEQ ID No. 1所示的單鏈DNA和SEQ ID No.2所 示的單鏈DNA分別作為上游引物、下游引物，對(duì)待測(cè)樣品中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;檢 測(cè)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有314bp特異性片段，則表明待測(cè)樣品羊地方性鼻內(nèi) 腫瘤病毒陽性。7. 根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于PCR擴(kuò)增條件為變性溫度94°C、退火溫度55°C、延 伸溫度72°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK105925726SQ201610311800
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】許信剛, 付明哲, 張琪, 何亞鵬
【申請(qǐng)人】西北農(nóng)林科技大學(xué)