嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、car133-nkt細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，公開了一種嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CAR133?NKT細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，所述嵌合抗原受體為CD133ScFv?CD8?CD137?CD3ζ，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、CD133ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。采用本發(fā)明的CAR133?NKT細(xì)胞與CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)CD133陽(yáng)性上皮腫瘤細(xì)胞具有很好的特異殺傷活性。
【專利說(shuō)明】
嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、CAR133-NKT細(xì)胞及 其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，具體地，涉及過(guò)繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重組表達(dá)載體、工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞 (CAR133-NKT細(xì)胞)及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然殺傷細(xì)胞(NKT)是一種特殊類型的T淋巴細(xì)胞亞群，具有T細(xì)胞和NK細(xì)胞細(xì)胞 兩重性質(zhì)。NKT細(xì)胞能表達(dá)T細(xì)胞的TCR與NK細(xì)胞的NKR-P1兩種受體，在TCR和NKR介導(dǎo)下，NKT 細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的IL-4及INF γ，對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。NKT細(xì)胞通過(guò)自身表面 的CD16與特異性抗體的Fc段結(jié)合，發(fā)揮抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC， antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。但在抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作 用過(guò)程中，由于抗體能與靶細(xì)胞上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合，NKT細(xì)胞可殺傷任何已與抗 體結(jié)合的靶細(xì)胞，因此抗體與靶細(xì)胞上的抗原結(jié)合是特異性的，但NKT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷 作用是非特異性的。另外，通常情況下，輸注的NKT細(xì)胞在患者體內(nèi)半衰期為2周左右，有效 期短暫，需要反復(fù)多次輸注。而且，NKT細(xì)胞本身缺少特異性抗體，不足以在腫瘤周圍或者瘤 巢中富集，制約了NKT細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤的靶向治療。再者，研究表明，NKT細(xì)胞并不是對(duì)所有 的腫瘤都有殺傷效果，且對(duì)部分腫瘤的殺傷作用比較弱，特異殺傷活性有待提高，NKT細(xì)胞 對(duì)腫瘤干細(xì)胞的免疫監(jiān)視目前仍然存在爭(zhēng)議。
[0003] 腫瘤干細(xì)胞是一類特殊的腫瘤細(xì)胞，其占腫瘤細(xì)胞的比率較低，但具有自我更新， 并分化為其他不同腫瘤細(xì)胞的潛能。大量研究指出，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤的復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 具有很大的相關(guān)性，并且可能是腫瘤對(duì)放化療產(chǎn)生抵抗的緣由。CD133是細(xì)胞表面的糖蛋 白，可作為分離腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記。另外，CD133在多種腫瘤細(xì)胞表面呈現(xiàn)高表 達(dá)，如結(jié)直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺 癌、子宮內(nèi)膜癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤起始細(xì)胞群里含有大量 的⑶133陽(yáng)性的細(xì)胞，同時(shí)，⑶133的高表達(dá)與腫瘤治療差的預(yù)后有關(guān)，由于以上特性，⑶133 抗原成為以抗體為基礎(chǔ)治療的理想靶點(diǎn)，但目前仍沒(méi)有一種對(duì)腫瘤特異殺傷活性較高的制 劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用比較弱、特異殺 傷活性有待提高的缺陷，充分利用CD133治療腫瘤的理想靶點(diǎn)的作用，提供一種嵌合抗原受 體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G及其基因和重組表達(dá)載體、工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞 (CAR133-NKT細(xì)胞)及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的嵌合抗原受體⑶133ScFv_⑶8-CD137-CD3G修飾的NKT細(xì)胞與CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很好的 特異殺傷活性。
[0006] 因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、CD133ScFv、CD8 的鉸鏈區(qū)(hinge區(qū)）和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了 一種工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是上述 嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細(xì)胞。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了一種工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法，所述方 法包括:包裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒，得到病毒濃縮液;利用得到 的病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。
[0011] 第六方面，本發(fā)明提供了上述方法制備得到的工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞。 [0012]第七方面，本發(fā)明提供了上述工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應(yīng)用。
[0013] 第八方面，本發(fā)明提供了一種治療CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤和/或抑制腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn) 移的方法，該方法包括：向CD 133陽(yáng)性的上皮腫瘤患者體內(nèi)回輸本發(fā)明的工程化CD 133靶向 性的NKT細(xì)胞。
[0014] 在與CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明的嵌合抗原受體CD133ScFv-⑶8-⑶137-⑶3ζ修飾的NKT細(xì)胞，即工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞能夠特異性結(jié)合⑶133抗 原，增強(qiáng)免疫細(xì)胞靶向識(shí)別癌細(xì)胞表面CD 133抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)CD 133陽(yáng)性靶細(xì)胞的特異 殺傷活性。本發(fā)明的工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞為治療CD133陽(yáng)性的腫瘤及阻遏腫瘤轉(zhuǎn) 移與復(fù)發(fā)提供了一種新的選擇，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
[0015] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的NKT細(xì)胞表型分析的結(jié)果。
[0017] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPXL-CD8-CDl 37-〇)3ζ的限制性內(nèi)切酶Mlul/ Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0018] 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的限制性內(nèi)切 酶BamHI/Ndel雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0019] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片度，順時(shí)針為反向基因片段。
[0020] 圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含有嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的病毒濃縮 液對(duì)NKT細(xì)胞的感染效率。
[0021] 圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細(xì)胞 (CAR133-NKT細(xì)胞)表型鑒定的結(jié)果。
[0022] 圖7(A)-圖7(C)為本發(fā)明的實(shí)施例4中不同CD133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞的 ⑶133表達(dá)水平分析圖。
[0023]圖8為本發(fā)明的實(shí)施例4中CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)不同⑶133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞 的殺傷作用分析圖（4小時(shí)）。
[0024]圖9為本發(fā)明的實(shí)施例4中CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)不同⑶133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞 的殺傷作用分析圖（8小時(shí)）。
[0025] 圖10為本發(fā)明的實(shí)施例5中SW620和HT29的CD133表達(dá)水平分析圖。
[0026] 圖11為本發(fā)明的實(shí)施例5中注射生理鹽水、NKT細(xì)胞、Mock細(xì)胞、CAR133-NKT細(xì)胞后 的腫瘤組織體積圖。
[0027]圖12為本發(fā)明的實(shí)施例6中CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)造血系統(tǒng)的功能影響分析圖。
[0028]圖13(A)-圖13(D)為本發(fā)明的實(shí)施例7中CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)肝癌患者治療的毒副 反應(yīng)的分析圖，分別顯示了不同細(xì)胞回輸后天數(shù)時(shí)血紅蛋白（Hgb )、白細(xì)胞(WBC)、血小板 (PLT)和網(wǎng)織紅蛋白（Ret)的變化趨勢(shì)。
[0029]圖14為本發(fā)明的實(shí)施例7中CAR133-NKT細(xì)胞拷貝數(shù)與肝癌患者CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 的變化曲線圖。
[0030]圖15為本發(fā)明的實(shí)施例7中肝癌患者的治療效果的分析圖。
[0031 ]圖16為本發(fā)明的實(shí)施例8中CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)胰腺癌患者的治療效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0033] 本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為⑶133ScFv_⑶8-⑶137-⑶3ζ，包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、⑶133單鏈抗體⑶133ScFv、⑶8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、 CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。
[0034]優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G由大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、 CD133ScFv、CD8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián) 構(gòu)成。進(jìn)一步優(yōu)選地，嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，更進(jìn)一步優(yōu)選 地，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0035] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，編碼上述嵌合抗原受體的基因的核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。
[0036] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。優(yōu)選情況下，重組表達(dá)載體為慢病 毒表達(dá)載體。對(duì)于慢病毒表達(dá)載體沒(méi)有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 如293T包裝細(xì)胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT 細(xì)胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體為pWPXL-CDl 33ScFv-CD8-CDl 37-〇)3ζ。
[0037] 對(duì)于慢病毒表達(dá)載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的制備方法沒(méi)有特別的 限定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體口1?父1^-CD133ScFv-CD8-CDl 37-〇)3ζ的制備方法包括以下步驟：
[0038] (1)從ΝΚΤ細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域 和〇)3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，并克隆至載體pWPXL-GFP中，構(gòu)建得到pWPXL-CD8-CDl37-〇)3ζ; [0039] (2)合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和⑶133ScFv的核苷酸序列，并克隆至pWPXL- CD8-CD137-CD3G 中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后得到序列正確的 pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。
[0040] 步驟（1)中，對(duì)于從NKT細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi) 信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的方法沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方 法，例如可以為RT-PCR法。其中，NKT細(xì)胞可以通過(guò)分離人靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，然后進(jìn)行 培養(yǎng)獲得。
[0041 ] 具體地，得到pWPXL-CD8-CD137-CD3G的方法可以包括:提取NKT細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn) 錄獲得NKT細(xì)胞cDNA，以得到的NKT細(xì)胞cDNA為模板，利用引物PI (SEQID NO. 11)和P2(SEQID N0.12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)（SEQIDN0.3);利用引物P3(SEQID N0.13)和P4(SEQIDN0.14)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD137基因的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域(SEQIDN0.4) ; 利用引物P5(SEQID N0.15)和P6(SEQID N0.16)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得0)3ζ基因的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu) 域(SEQID勵(lì).5)，將獲得的？0?產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，然后與組111/制61雙酶切后的慢病毒 表達(dá)載體pWPXL-GFP連接。
[0042]步驟(2)中，對(duì)于合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和⑶133ScFv的核苷酸序列的方法 沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以通過(guò)全基因合成技術(shù)合成。 [0043] 具體地，得到序列正確的pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的方法可以包括:通 過(guò)全基因合成技術(shù)合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD133ScFv融合基因的核苷酸序列 (SEQID N0· 8)，克隆至載體pGSI 中，得到pGSI-CD133ScFv;然后將pGSI-CD133ScFv進(jìn)行 BamHI/MluI雙酶切，與用BamHI/MluI雙酶切后的步驟（1)得到的重組質(zhì)粒pWPXL-CD8-CD137-〇)3ζ連接，經(jīng)測(cè)序鑒定，得到序列正確的pWPXL-CD 133ScFv-CD8-CD 137-〇)3ζ。其中， 大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQID NO. 6所示，CD133ScFv核苷酸序列如SEQID NO. 7所示。
[0044] 本發(fā)明還提供了 一種工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞，所述NKT細(xì)胞是由上述嵌合 抗原受體 CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 修飾的 NKT 細(xì)胞(即 CAR133-NKT 細(xì)胞）。
[0045] 本發(fā)明還提供了 一種工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法，該方法包括:包 裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒，得到病毒濃縮液;利用得到的病毒濃 縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。
[0046] 對(duì)于包裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒的方法沒(méi)有特別的限 定，可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的各種方法，優(yōu)選情況下，將慢病毒表達(dá)載體PWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 與輔助質(zhì)粒(如 psPAX2、pMD2.G)共轉(zhuǎn)染293T 包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 48-72h時(shí)收集病毒上清，離心、過(guò)濾，在濾液中添加5 X PEG6000-NaCl進(jìn)行混勻，離心后棄上清， 沉淀用0-4 °C預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶解，獲得病毒濃縮液。
[0047]本發(fā)明的方法中，還包括通過(guò)如下方法制備NKT細(xì)胞：
[0048] (1)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第一階段 培養(yǎng)；
[0049] (2)在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng)。
[0050] 優(yōu)選情況下，所述第一階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于第一 NKT細(xì) 胞培養(yǎng)液中，所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白 介素-15;進(jìn)一步優(yōu)選地，第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述⑶3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL， 和/或所述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/mL。
[0051] 優(yōu)選情況下，所述第二階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2;進(jìn) 一步優(yōu)選地，第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0052]對(duì)于NKT細(xì)胞培養(yǎng)基沒(méi)有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種用于培養(yǎng)NKT細(xì)胞 的培養(yǎng)基，例如可以為GT-T551培養(yǎng)基。
[0053]在制備NKT細(xì)胞時(shí)，對(duì)于第一階段培養(yǎng)和第二階段培養(yǎng)的條件沒(méi)有特別的限定，可 以為本領(lǐng)域常用的各種條件，例如可以在30-37Γ、飽和濕度為3-6%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培 養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此 不再贅述。
[0054] 本發(fā)明制備得到的NKT細(xì)胞中，CD3+細(xì)胞平均比率>90%，⑶3+⑶8+細(xì)胞占總⑶3+細(xì) 胞的平均比率>70%;⑶3+CD56+細(xì)胞占總⑶3+細(xì)胞的平均比率>15%。
[0055]對(duì)于感染NKT細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，優(yōu)選情況 下，該方法包括：
[0056] (1)在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素_2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培 養(yǎng)；
[0057] (2)在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的 細(xì)胞進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng)。
[0058]優(yōu)選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將NKT細(xì)胞培養(yǎng)于第三NKT細(xì)胞 培養(yǎng)液中，所述第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2;進(jìn)一步優(yōu)選地，第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。
[0059] 優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì) 胞培養(yǎng)于所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液的具體組成可參見前述相應(yīng)內(nèi) 容，在此不再贅述。
[0060] 在感染NKT細(xì)胞時(shí)，對(duì)于第一階段感染培養(yǎng)和第二階段感染培養(yǎng)的條件沒(méi)有特別 的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種條件，例如可以在30-37 °C、飽和濕度為3-6 %的⑶2培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)培養(yǎng)的時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，此為本領(lǐng)域技術(shù)人員 所公知，在此不再贅述。
[0061 ]具體地，感染NKT細(xì)胞的方法包括:取1 X 107-5X 107個(gè)NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液， 加入2-4mL新鮮GT-T551培養(yǎng)液，再加入200-400yL病毒濃縮液、2-4yL 1 X 10-6mg/mL魚精蛋 白和終濃度為300-700U/mL的IL-2,置于30-37°C、飽和濕度為3-6%的C0 2培養(yǎng)箱中感染12-16h后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至未包被的培養(yǎng)瓶中，加入20-50mL的GT-T551培養(yǎng)基，再加入終 濃度為300-700U/mL的IL-2、終濃度為30-70ng/ml的CD3單克隆抗體和終濃度為30-70ng/mL 的白細(xì)胞介素15，于30-37°C、飽和濕度為3-6 %的⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-18h，獲得嵌合抗原 受體 CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 修飾的 NKT 細(xì)胞。
[0062]進(jìn)一步優(yōu)選地，感染NKT細(xì)胞的方法還包括：
[0063] (3)先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞 的密度為80-90 %時(shí)，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 培養(yǎng)。
[0064]優(yōu)選情況下，所述體外誘導(dǎo)的實(shí)施方式包括:將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)于所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液和第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液的具體組成可參見前述相應(yīng) 內(nèi)容，在此不再贅述。
[0065]具體地，感染NKT細(xì)胞的方法還包括:將第二階段感染培養(yǎng)后獲得的慢病毒感染的 NKT細(xì)胞用IL-2的終濃度為300-700U/mL的GT-T551培養(yǎng)液進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為 80-90%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔1.5-2.5天加入IL-2的終濃度為300-700U/mL、CD3 單克隆抗體的終濃度為30_70ng/ml、白細(xì)胞介素 -15的終濃度為30-70ng/mL的新鮮GT-T551 培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并將細(xì)胞擴(kuò)增至總量為IX 109-2X 109個(gè)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)本發(fā)明的慢病毒對(duì) 靶向CD133抗原的嵌合抗原受體進(jìn)行NKT細(xì)胞感染，其感染效率高達(dá)30%-60%，而獲得的 CAR133-NKT細(xì)胞，其⑶3+CD56+細(xì)胞占總⑶3+細(xì)胞的比率在15 % -40 %范圍之內(nèi)。
[0066] 嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗原受體的 蛋白氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，嵌合抗原受體前 體蛋白由大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、⑶133ScFv、⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、⑶137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu) 域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成，蛋白質(zhì)翻譯后在細(xì)胞內(nèi)粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切除信號(hào)肽后 成為成熟嵌合抗原受體蛋白，分泌輸出后并定位于NKT細(xì)胞的細(xì)胞膜上。該嵌合抗原受體的 蛋白氨基酸序列對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQID N0.2所示。該嵌合抗原受體以基因 CD8的 hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其 氨基酸序列如SEQIDN0.9所示，對(duì)應(yīng)的基因編碼序列如SEQIDN0.10所示。
[0067]本發(fā)明還提供了上述方法制備得到的工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞。
[0068]本發(fā)明還提供了工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中的 應(yīng)用。優(yōu)選情況下，腫瘤是CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述上皮腫瘤為結(jié)直腸 癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜 癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。
[0069] 本發(fā)明的應(yīng)用中，對(duì)于用于治療CD133陽(yáng)性的腫瘤的制劑的組成沒(méi)有特別的限定， 只要含有本發(fā)明所述CAR133-NKT細(xì)胞或是由CAR133-NKT細(xì)胞制備而成即可，制劑的具體組 成和制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不再贅述。
[0070] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，上皮腫瘤為結(jié)直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管 癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經(jīng)膠 質(zhì)瘤等時(shí)，本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞能夠識(shí)別CD133陽(yáng)性的細(xì)胞，包括腫瘤起始細(xì)胞、腫瘤 干細(xì)胞、上皮祖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，并發(fā)揮靶向殺傷活性，從而對(duì)前述不同種類的CD133陽(yáng)性 上皮瘤均有殺傷作用，不僅能夠清除原位腫瘤并且可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，還可能減少腫 瘤的復(fù)發(fā)。
[0071] 本發(fā)明還提供了一種治療CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤和/或抑制腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的方 法，該方法包括：向⑶133陽(yáng)性的上皮腫瘤患者體內(nèi)回輸本發(fā)明的工程化⑶133靶向性的NKT 細(xì)胞。優(yōu)選地，所述上皮腫瘤為結(jié)直腸癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺 癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
[0072]實(shí)施例
[0073] 以下的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[0074] 以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到，其中：
[0075] NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551購(gòu)自TaKaRa公司。
[0076] 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自TBD公司。
[0077] ⑶3單克隆抗體、重組纖維連接蛋白（retronectin)均購(gòu)自TaKaRa公司。
[0078] 重組人蛋白干擾素_γ、重組人白介素2、重組人白介素15均購(gòu)自protech公司。
[0079] 總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶（primeSTARXHS DNA Polymerase)、T4 DNA連接酶購(gòu)自 TaKaRa公司。
[0080] RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司。
[0081] Bgl Π 、EcoRI、MluI、BamHI、NdeI、EcoR V購(gòu)自Fermentas公司。
[0082] 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自天 根生化科技有限公司。
[0083] pWPXL-GFP、psPAX2、pMD2 · G均購(gòu)自 Addgene 公司。
[0084] pGSI購(gòu)自北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。
[0085] Transl-Tl Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公 司。
[0086] Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自 Invitrogen公司。
[0087] 293T包裝細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。
[0088] PEG6000-NaCl中PEG6000終濃度為25.5質(zhì)量％，NaCl終濃度為1.2M，PEG6000和 NaCl均購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0089] 胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAA公司。
[0090] CD107a-PECy5抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。
[0091] ⑶133陽(yáng)性的結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0092] CD133陽(yáng)性的人肝癌細(xì)胞Hep3B購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0093] CD133陽(yáng)性的人胰腺癌細(xì)胞SW1990購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0094] ⑶133陽(yáng)性的人結(jié)直腸癌細(xì)胞DLD1購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0095] ⑶133陽(yáng)性的人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0096] ⑶133陰性的人結(jié)直腸癌細(xì)胞L0V0購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0097] CD133陰性的人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
[0098] 5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司。
[0099]膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。
[0100] MethoCult? H4434經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自stem cell公司。
[0101] 所有引物均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。
[0102] 實(shí)施例1 NKT細(xì)胞的制備
[0103] (1)取人靜脈血于含肝素的真空管中。采用淋巴細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離心方 法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。
[0104] (2)PBMCs洗三次后，采用含有0.6體積％的人自體血清的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551 調(diào)整細(xì)胞終濃度為2X 106個(gè)細(xì)胞/mL;將細(xì)胞接種于預(yù)先經(jīng)過(guò)終濃度為10yg/mL的 retronectin包被的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。然后在培養(yǎng)基里加入終濃度為500U/mL的重組人 白介素2、50ng/ml CD3單克隆抗體和50ng/mL的重組人白介素-15,在37°C、飽和濕度為5% 的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0105] (3)培養(yǎng)第4天，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未包被的培養(yǎng)瓶中，每2天按照細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量加入 NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551，控制細(xì)胞濃度為1 X 108個(gè)細(xì)胞/mL，并加入終濃度為500U/ml的重 組人白介素2;培養(yǎng)至第12天，得到NKT細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)NKT細(xì)胞表型進(jìn)行分析。結(jié)果見圖 1，其中 CD3+: 95 · 04 % ; CD3+CD8+: 90 · 99 % ; CD3+CD56+: 24 · 12 % ; CD8+CD56+: 24 · 63 %。
[0106] 實(shí)施例2慢病毒表達(dá)載體pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的構(gòu)建
[0107] (l)NKT 細(xì)胞 cDNA 的制備
[0108] 離心沉淀實(shí)施例1培養(yǎng)得到的NKT細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒RNAiso Reagent提取 細(xì)胞的總RNA，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｌ崛〉目俁NA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄得NKT細(xì)胞cDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0109] (2)慢病毒質(zhì)粒 pWPXL-CD8-CD137-CD3G 的制備
[0110] 設(shè)計(jì)并合成如下引物序列(其中，下劃線標(biāo)記為保護(hù)堿基，方框?yàn)槊盖形稽c(diǎn)）：
[0113] 以步驟（1)中NKT細(xì)胞cDNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)287bp的⑶8 的hinge區(qū)和跨膜區(qū)，核苷酸序列如SEQID勵(lì).3所示，兩端分別含有組111和88111酶切位點(diǎn) 和保護(hù)堿基；用引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)146bp的CD137胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序 列如SEQID N0.4所示，兩端分別含有Bgl Π 和EcoR頂每切位點(diǎn)及保護(hù)堿基；用引物P5和?6進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)359bp的⑶3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列如SEQIDN0.5所示，兩端分 另IJ含有EcoRI和Ndel酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。各步PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，以擴(kuò)增CD137胞內(nèi)信 號(hào)結(jié)構(gòu)域?yàn)槔?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件參照p rimeSTAR?HS DNA Polymerase的說(shuō)明 書，反應(yīng)體系(50yL)如下：
[0114] 雙蒸水：32.5yL
[0115] 5X 反應(yīng) buffer:10yL
[0116] dNTP 混合物(每種 2.5mM):4yL
[0117] P3(10mM):lyL
[0118] P4(10mM):lyL
[0119] NKT 細(xì)胞 cDNA(200ng/ul):lyL
[0120] PrimeSTAR?HS DNA Polymerase：0.5yL
[0121] 將上述PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行 DNA片段回收。得到片段后分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒回收 備用。
[0122] 慢病毒表達(dá)載體pWPXL-GFP用Mlul/Ndel雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn) 行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收大的載體片段，然后與之前回收的CD8、CD137、 0)3ζ片段通過(guò)T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-Tl Phage Resistant化學(xué)感受態(tài) 細(xì)胞，37°C培養(yǎng)16h后挑取單克隆，37°C，250rpm培養(yǎng)12h后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提 取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mlul和Nde I雙酶切鑒定，鑒定電泳圖見圖2,其中，Ml: DNA分子量 標(biāo)記D15000;l泳道：質(zhì)粒pWPXL-CD8-CD137-CD3G的未酶切片段；2泳道：質(zhì)粒pWPXL-CD8-CD137-CD3G的酶切片段(751bp);M2:DNA分子量標(biāo)記D2000。將鑒定正確的質(zhì)粒送北京天一 輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名 為pWPXL-CD8-CD137-CD3ζ，其中，CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示， CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQID腸.4所示，003(的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的核苷 酸序列如SEQIDN0.5所示。
[0123] (3)慢病毒質(zhì)粒 pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 的制備
[0124] 全基因合成編碼大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和⑶133ScFv融合基因的核苷酸序列，序列 如SEQID如.8所示，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，其5'端含有8 &111!11、1?)似1^序 列，3'端含有Mlul酶切位點(diǎn)，將前述融合基因克隆在質(zhì)粒pGSI中，命名為pGSI-CD133ScFv。 質(zhì)粒經(jīng)BamHI/MluI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試 劑盒回收目的片段備用。
[0125] pWPXL-CD8-CD137-CD3G質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI/MluI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊 脂糖凝膠進(jìn)行分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段備用。然后與回收的含有大 鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽和CD133ScFv的DNA片段通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，具體方法見說(shuō)明 書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transl-Tl Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)16h后挑取單 克隆，37°C，250rpm培養(yǎng)12h后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶 BamHI/Ndel雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖3所示，其中，其中，M1:DNA分子量標(biāo)記D15000;l泳 道：質(zhì)粒pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G未酶切片段（11281p) ;2泳道：質(zhì)粒pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G 的酶切片段（65(^口，956匕口）；]?2:0嫩分子量標(biāo)記02000。將鑒定 正確的質(zhì)粒送北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對(duì)插入的融合基因片段進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié) 果正確的重組質(zhì)粒命名為pWPXL-⑶133ScFv-⑶8-⑶137-⑶3ζ，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，其 中包括大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽(核苷酸序列如SEQID Ν0.6所示）、抗⑶133單鏈抗體(核苷酸序 列如SEQID N0.7所示）、⑶8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及⑶137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和⑶3ζ的胞內(nèi)信 號(hào)結(jié)構(gòu)域，其中，該嵌合抗原受體以基因 CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)及CD137和CD3G的胞內(nèi)信號(hào) 結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的結(jié)構(gòu)為信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如SEQID N0.9所示，對(duì)應(yīng)的基因 編碼序列如SEQIDN0.10所示。
[0126] 實(shí)施例3嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細(xì)胞的制備
[0127] (1)慢病毒的包裝和濃縮
[0128] 用分光光度計(jì)分別測(cè)定慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G和輔 助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G的濃度，三種質(zhì)粒以4:2:1的質(zhì)量比用Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。分別在轉(zhuǎn)染48h、72h時(shí)收集病毒上 清于50mL EP管中，4°C，2000g離心10min，轉(zhuǎn)移兩次得到的上清至新EP管中，用4.5μπι濾器過(guò) 濾病毒上清;過(guò)濾的病毒上清與5 X PEG6000-NaCl按照4:1的體積比混勻，4°C靜置2h，然后4 °C，10000g離心20min，棄上清，沉淀用lmL的4°C預(yù)冷的無(wú)菌PBS溶解，即得嵌合抗原受體的 病毒濃縮液，按每管l〇〇yL進(jìn)行分裝，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0129] 按照上述方法，利用慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPXL-GFP和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染 293T包裝細(xì)胞，收集病毒上清，濃縮，獲得表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的慢病毒濃縮液。
[0130] (2)慢病毒感染NKT細(xì)胞及感染后細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)
[0131] 取實(shí)施例1的在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的1 X 107個(gè)NKT細(xì)胞，棄掉舊的培養(yǎng)液，加入2mL 新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551、200yL步驟（1)得到的病毒濃縮液、2yL 1 X 10-6mg/mL魚精蛋 白，終濃度為500U/mL的重組人白介素2,置于37°C、飽和濕度為5%的C0 2培養(yǎng)箱中感染12小 時(shí)后，棄培養(yǎng)液。同時(shí)用表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的慢病毒濃縮液對(duì)NKT細(xì)胞進(jìn)行同步感染(得 到的NKT細(xì)胞稱為CART-GFP細(xì)胞），用于計(jì)算該病毒的感染效率。將感染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)至未經(jīng) CD3和retronectin包被的75cm2培養(yǎng)瓶中，加入20mL的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551，再加入終濃 度為500U/mL的重組人白介素2、終濃度為50ng/ml的⑶3單克隆抗體和終濃度為50ng/mL的 重組人白介素15，于37 °C、飽和濕度為5 %的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，得到的NKT細(xì)胞稱為 CAR133-NKT細(xì)胞。按照CN 105384823 A中公開的方法制備CAR33-NKT細(xì)胞作為Mock細(xì)胞。用 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該病毒的感染效率，結(jié)果如圖5所示，CAR133-NKT細(xì)胞的感染效率為 36.32%〇
[0132] (3)體外誘導(dǎo)擴(kuò)增CAR133-NKT細(xì)胞群
[0133] 將上述培養(yǎng)后的NKT細(xì)胞用重組人白介素2的終濃度為500U/mL的NKT細(xì)胞培養(yǎng)基 GT-T551進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密度為85%時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，隔2天加入重組 人白介素2的終濃度為500U/mL、⑶3單克隆抗體的終濃度為50ng/ml、重組人白介素15的終 濃度為50ng/mL的新鮮NKT細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增到總量為1.5 X 1〇9個(gè)細(xì)胞左右后，采用流式細(xì)胞儀對(duì)感染的細(xì)胞群體進(jìn)行鑒定，細(xì)胞表型一般達(dá)到CD3陽(yáng) 性細(xì)胞比例>90% ;CD3⑶8雙陽(yáng)性細(xì)胞比例>70% ;CD3⑶56雙陽(yáng)性細(xì)胞比例>15%，結(jié)果見 圖 6，CD3+: 94 · 09 % ; CD3+CD4+: 8 · 79 % ; CD3+CD8+: 79 · 95 % ; CD3+CD56+: 27 · 68 % ; CD8+CD56+: 奴.41%〇
[0134] 實(shí)施例4 CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)不同⑶133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞殺傷作用分析
[0135] 分別取實(shí)施例3中制備的CAR133-NKT細(xì)胞、CAR33-NKT細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT 細(xì)胞接種于96孔板，與不同CD133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞(高水平表達(dá)CD133的癌細(xì)胞系： Hep3B、SW1990;中等水平表達(dá)CD133的癌細(xì)胞系：HT29、DLD1;及不表達(dá)CD133的癌細(xì)胞系 L0V0、HepG2)以效靶比（殺傷細(xì)胞:祀細(xì)胞)20:1的比率進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)4小時(shí)的共培養(yǎng)后， 加入莫能菌素，終濃度為2μπι 〇 1 /L，孵育2小時(shí)，然后用PE標(biāo)記的⑶107a抗體孵育15分鐘，用 PBS緩沖液洗滌3次后，流式分析⑶107a的表達(dá)水平。
[0136] 分別取實(shí)施例3中制備的CAR133-NKT細(xì)胞、CAR33-NKT細(xì)胞和實(shí)施例1中培養(yǎng)的NKT 細(xì)胞接種于96孔板，用5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)進(jìn)行染色，與不同⑶133表達(dá)水平 的上皮腫瘤細(xì)胞(高水平表達(dá)⑶133的癌細(xì)胞系:Hep3B、SW1990;中等水平表達(dá)⑶133的癌細(xì) 胞系:HT29、DLD1;及不表達(dá)CD133的癌細(xì)胞系L0V0、HepG2)以效靶比（殺傷細(xì)胞:靶細(xì)胞)20: 1的比率進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)8小時(shí)的共培養(yǎng)后，將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒染色，同時(shí)設(shè) 置對(duì)照組分別為未加入免疫細(xì)胞殺傷處理的各不同CD133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞，并將 細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-RPE試劑盒染色。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞凋亡的量根據(jù)下 面的公式計(jì)算:凋亡率=(對(duì)照-樣品)/對(duì)照X 100%，對(duì)照為未加免疫細(xì)胞殺傷處理的細(xì)胞 存活數(shù)目；樣品為加入相對(duì)應(yīng)的效靶比（殺傷細(xì)胞:靶細(xì)胞）的免疫細(xì)胞殺傷處理的細(xì)胞存 活數(shù)目。
[0137] 其中，不同⑶133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞的⑶133表達(dá)水平分析圖見圖7(A)-圖7 (C)，CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)不同CD133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞的殺傷作用分析圖（4小時(shí)）見 圖8，CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)不同CD133表達(dá)水平的上皮腫瘤細(xì)胞的殺傷作用分析圖（8小時(shí)）見 圖9。由圖7-9可知，嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G修飾的NKT細(xì)胞對(duì)高水平表達(dá) 和中等水平表達(dá)的CD133癌細(xì)胞均具有較高的特異殺傷活性，而對(duì)不表達(dá)CD133的細(xì)胞系無(wú) 殺傷活性，且CAR133-NKT細(xì)胞的特異殺傷活性明顯優(yōu)于NKT細(xì)胞和Mock細(xì)胞(CAR33-NKT細(xì) 胞)。
[0138] 實(shí)施例5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平分析CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌小鼠模型治療效果
[0139] 分別采用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的⑶133陽(yáng)性表達(dá)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620和HT29(數(shù) 量均為5\106個(gè)，其中〇)133的表達(dá)率分別為99.43%和66.67%，其中，31620和則'29的 ⑶133表達(dá)水平分析圖見圖10)，稀釋到100μΙ生理鹽水中，注射到裸鼠皮下。經(jīng)15天，皮下形 成結(jié)直腸癌小鼠模型。
[0140] 在結(jié)直腸癌小鼠模型中通過(guò)腹腔分別給予生理鹽水、ΝΚΤ細(xì)胞、Mock細(xì)胞、CAR133-NKT細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量均為2 X107)進(jìn)行治療，每天注射一次，連續(xù)注射2天，于40天處死小鼠， 去除腫瘤組織，測(cè)量腫瘤組織體積大小，結(jié)果見圖11。由圖11可知，注射CAR133-NKT細(xì)胞的 結(jié)直腸癌小鼠模型的瘤體明顯縮小，說(shuō)明在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞能夠 發(fā)揮靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。
[0141] 實(shí)施例6本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)造血系統(tǒng)的功能影響
[0142] 取臍帶血采用Ficoll單核分離液分離原始祖細(xì)胞，分別與CAR133-NKT細(xì)胞、NKT細(xì) 胞、生理鹽水和Mock細(xì)胞(CAR33-NKT細(xì)胞）以1:20的比例混勻，接種于MethoCult? H4434經(jīng) 典細(xì)胞培養(yǎng)基，于37°C，5%C02的孵箱培養(yǎng)2周，然后分別對(duì)克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0143] CAR13 3-NKT細(xì)胞對(duì)造血系統(tǒng)的功能影響分析圖見圖12，該圖示出了造血細(xì)胞的克 隆數(shù)，其中，BFU-E為紅細(xì)胞爆裂型集落形成單位(burst forming unit:early erythroid progenitor cell)，CFU_GM為粒細(xì)胞-巨細(xì)胞集落形成單位（colony forming unit: granulocyte and macrophage)，CFU_GEMM為粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨核細(xì)胞集落形 成單位（colony forming unit: granulocyte , erythrocyte ,monocyte and megakaryocyte)，CFU_E為早期紅細(xì)胞祖細(xì)胞集落形成單位（colony forming unit:early erythroid progenitor cell)。如圖12所示，本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)造血系統(tǒng)無(wú)明顯 不良影響。造血干細(xì)胞也表達(dá)⑶133，因此，排除了對(duì)造血系統(tǒng)的影響，保證了CAR133-NKT細(xì) 胞治療的安全性。
[0144] 實(shí)施例7本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)⑶133陽(yáng)性的上皮腫瘤（以肝癌為代表)患者 治療效果
[0145] 取CAR133-NKT細(xì)胞，經(jīng)過(guò)100ml生理鹽水稀釋后，連續(xù)三天以劑量遞增的形式靜脈 回輸?shù)紺D133陽(yáng)性的肝癌患者(在利用本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞進(jìn)行靶向免疫治療前，已經(jīng) 過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等），但均無(wú)明顯療效)體內(nèi)，其中患者1、患 者2、患者3經(jīng)過(guò)了安全性劑量輸注，連續(xù)三天的輸注劑量總量分別為:0.03 X 107/kg、0.06 X 107/kg和0.03 X 107/kg;患者1、患者2、患者3、患者4進(jìn)行了發(fā)揮治療效果的最低劑量輸 注，連續(xù)三天的輸注劑量總量分別為:0.39 X 107/kg、0.25 X 107/kg、0.4 X 107/kg和0.33 X l〇7/kg;患者5、患者6、患者7、患者8進(jìn)行了發(fā)揮臨床療效的有效劑量輸注，連續(xù)三天的輸注 劑量總量分別為:0.5 X 107/kg、0.5 X 107/kg、0.5 X 107/kg和0.79 X 107/kg;回輸后對(duì)患者 的治療狀況進(jìn)行評(píng)估。
[0146] 治療患者輸注CAR133-NKT細(xì)胞的劑量分為三個(gè)梯度：1)安全性劑量輸注，細(xì)胞回 輸量為〇. 〇 1 -〇. 06( X 10Vkg)，2)發(fā)揮治療效果的最低劑量輸注，細(xì)胞回輸量為0.1 -0.5( X l〇7/kg)，3)發(fā)揮臨床療效的有效劑量輸注，細(xì)胞回輸量為0.5-1.0( X 107/kg)。
[0147] 圖13(A)-圖13(D)為CAR133-NKT細(xì)胞治療肝癌患者的毒副反應(yīng)分析圖，分別顯示 了不同細(xì)胞回輸后天數(shù)時(shí)血紅蛋白（Hgb)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)和網(wǎng)織紅蛋白（Ret) 的變化趨勢(shì)。如圖13(A)-圖13(D)所示，血液系統(tǒng)的毒副反應(yīng)主要為輕微的血紅蛋白和血小 板水平的降低，毒副反應(yīng)較低，患者可耐受;其他毒副反應(yīng)如回輸相關(guān)的寒顫、高熱、頭疼、 頭暈、乏力、惡心、嘔吐等，患者耐受性良好，通過(guò)給予解熱鎮(zhèn)痛制劑得以緩解?；剌敽蠖靖?反應(yīng)如皮疹、腹水、膽紅素升高等，給予對(duì)癥治療后均可以緩解。其他毒性結(jié)果如表1所示。
[0148] 表1
[0150] 圖14為CAR133-NKT細(xì)胞拷貝數(shù)與肝癌患者CD133陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化曲線圖，其中， CAR133-NKT細(xì)胞拷貝數(shù)與⑶133陽(yáng)性細(xì)胞的百分比呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，表明CAR133-NKT能夠殺傷 ⑶133陽(yáng)性的靶細(xì)胞。
[0151] 圖15為8例肝癌患者的治療反應(yīng)圖，其中，一位患者治療第一周期后疾病進(jìn)展，第 二周期后疾病穩(wěn)定;剩余七位患者治療第一周期后疾病穩(wěn)定。說(shuō)明CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)肝癌 患者有一定的治療效果。
[0152] 實(shí)施例8本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)⑶133陽(yáng)性的上皮腫瘤（以胰腺癌為代表)患 者治療效果
[0153] 取CAR133-NKT細(xì)胞，經(jīng)過(guò)100ml生理鹽水稀釋后，連續(xù)三天以劑量遞增的方式靜脈 回輸?shù)紺D 133陽(yáng)性的胰腺癌患者(在利用本發(fā)明的CAR133-NKT細(xì)胞進(jìn)行靶向免疫治療前，已 經(jīng)過(guò)多次治療（如放療、化療及其他藥物對(duì)癥治療等），但均無(wú)明顯療效)體內(nèi)，連續(xù)三天細(xì) 胞回輸總量為〇.8X107/kg，回輸后對(duì)患者的治療狀況進(jìn)行評(píng)估。
[0154] 圖16為CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)胰腺癌患者的治療效果圖，由圖16可知，胰腺癌患者經(jīng) 過(guò)4周治療后瘤灶縮小，經(jīng)過(guò)10周治療后腫瘤縮小更加明顯。說(shuō)明CAR133-NKT細(xì)胞對(duì)胰腺癌 患者有一定的治療效果。
[0155] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這 些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0156] 另外需要說(shuō)明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說(shuō)明。
[0157] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體為⑶133ScFV-⑶8-⑶137-⑶3ζ， 包括串聯(lián)的大鼠生長(zhǎng)激素信號(hào)肽、⑶13 3 ScFv、⑶8的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD 13 7的胞內(nèi)信號(hào)結(jié) 構(gòu)域和CD3G的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域;優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基 酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的嵌合抗原受體的基因，優(yōu)選地，所述基因具有如SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. 含有權(quán)利要求2所述的基因的重組表達(dá)載體，優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為慢病毒表 達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述慢病毒表達(dá)載體為pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。4. 一種工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞，其特征在于，所述NKT細(xì)胞是由權(quán)利要求1所述 的嵌合抗原受體修飾的NKT細(xì)胞。5. -種工程化⑶133靶向性的NKT細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 包裝攜帶pWPXL-CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G的慢病毒，得到病毒濃縮液;利用得到的 病毒濃縮液感染NKT細(xì)胞，使NKT細(xì)胞表達(dá)嵌合抗原受體CD133ScFv-CD8-CD137-CD3G。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述方法還包括通過(guò)如下方法制備NKT細(xì)胞： (1) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行第一階段培 養(yǎng);優(yōu)選地，所述第一階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)于第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液 中，所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15; 進(jìn)一步優(yōu)選地，第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述CD3單克隆抗體的濃度為30-70ng/mL，和/或所 述白介素-2的濃度為300-700U/mL，和/或所述白介素-15的濃度為30-70ng/mL; (2) 在白介素-2存在下，將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行第二階段培養(yǎng);優(yōu)選地，所述 第二階段培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將所述第一階段培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中， 所述第二NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基和白介素-2;進(jìn)一步優(yōu)選地，第二NKT細(xì)胞培 養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法包括： (1) 在病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2存在下，將NKT細(xì)胞進(jìn)行第一階段感染培養(yǎng);優(yōu) 選地，所述第一階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將NKT細(xì)胞培養(yǎng)于第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所 述第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液含有NKT細(xì)胞培養(yǎng)基、病毒濃縮液、魚精蛋白和白介素-2;進(jìn)一步優(yōu)選 地，第三NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述白介素-2的濃度為300-700U/mL; (2) 在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將所述第一階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞 進(jìn)行第二階段感染培養(yǎng);優(yōu)選地，所述第二階段感染培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將所述第一階段 感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述感染NKT細(xì)胞的方法還包括： (3) 先在白介素-2存在下，將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，待細(xì)胞的密 度為80-90 %時(shí)，再在CD3單克隆抗體、白介素-2和白介素-15存在下，將細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述體外誘導(dǎo)的實(shí)施方式包括:將所述第二階段感染培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)于所述第二 NKT細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述擴(kuò)增培養(yǎng)的實(shí)施方式包括:將細(xì)胞培養(yǎng)于所述第一NKT細(xì)胞培養(yǎng)液 中。9. 權(quán)利要求5-8中任意一項(xiàng)所述方法制備得到的工程化CD 133靶向性的NKT細(xì)胞。10. 權(quán)利要求4或9所述的工程化CD133靶向性的NKT細(xì)胞在制備用于治療腫瘤的制劑中 的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述腫瘤是CD133陽(yáng)性的上皮腫瘤，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述上皮腫瘤為結(jié)直腸 癌、肝癌、膽管癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜 癌、腦腫瘤、黑色素瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105936649SQ201610248750
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】韓為東, 伍志強(qiáng), 王曉慧, 呂海燕, 王瑤, 羅燦, 黃建華, 陳美霞
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院