細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備及其應(yīng)用。本發(fā)明的細(xì)菌烯酰還原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，編碼細(xì)菌烯酰還原酶的核酸的堿基序列如SEQ ID No.1所示，以細(xì)菌烯酰還原酶為抗原，免疫動(dòng)物制備抗血清，抗血清經(jīng)過(guò)純化后得到細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體，采用蛋白質(zhì)印記的檢測(cè)方法，利用細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體，證明了細(xì)菌Shewanella sp.Ac10內(nèi)烯酰還原酶的表達(dá)，本發(fā)明制備的多克隆抗體的方法簡(jiǎn)單，免疫原性強(qiáng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌烯酰還原酶多克隆抗體的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌Shewanella sp.AclO是由海水中篩選到的一株低溫菌，該菌能夠在低溫下很 好的生長(zhǎng)，并在低溫誘導(dǎo)條件下生產(chǎn)二十碳五烯酸。二十碳五烯酸作為細(xì)胞膜磷脂?；鶄?cè) 鏈而存在于細(xì)胞中，具有抗氧化、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病的作用。同時(shí)，也可大大降低患 腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。二十碳五烯酸的這些有益作用表明其具有極高的應(yīng)用價(jià)值。二十碳五烯酸是 人類(lèi)保持健康所必須的不飽和脂肪酸，但僅存于植物和海洋生物中，人與動(dòng)物不能合成。因 此利用生物合成法是生產(chǎn)二十碳五烯酸的一個(gè)替代途徑。
[0003] 二十碳五烯酸的合成過(guò)程中必須要有烯酰還原酶的參與，在碳鏈延伸的過(guò)程中催 化反式烯酰ACP生成酰基ACP。近年來(lái)植物中該酶參與合成二十碳五烯酸的路徑已經(jīng)闡釋清 楚，而細(xì)菌中合成二十碳五烯酸的機(jī)制仍然未知，因此研究細(xì)菌中烯酰還原酶在二十碳五 烯酸合成中的作用顯得非常重要，但是該酶在野生型Shewanella sp.AclO菌株內(nèi)表達(dá)量不 高，無(wú)法通過(guò)直接提取烯酰還原酶來(lái)證明該酶的表達(dá)，而且目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道證明野生 型Shewanella sp.AclO內(nèi)稀酰還原酶的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)以上技術(shù)的不足，提供一種用于證明野生型Shewanella sp. AclO稀酰還原酶表達(dá)的多克隆抗體的制備方法。
[0005] 本發(fā)明的第一目的是提供一種細(xì)菌烯酰還原酶，所述細(xì)菌烯酰還原酶的氨基酸如 SEQ ID No.2所示的多肽；
[0006] 本發(fā)明的第二目的是以細(xì)菌烯酰還原酶作為抗原制備多克隆抗體；
[0007] 本發(fā)明的第三目的是細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體應(yīng)用于細(xì)菌Shewanella sp.AclO內(nèi)稀酰還原酶表達(dá)的檢測(cè)。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述第一目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] 1)通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增如SEQ ID No.l所示的核酸片段；
[0010] 2)將核酸片段克隆入pET21a( + )載體質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pET21a-Enrd;
[0011] 3)將重組質(zhì)粒pET21a-Enrd轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得到重組大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行培 養(yǎng)與誘導(dǎo)，裂解，純化，得到氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的細(xì)菌烯酰還原酶。
[0012] 所述培養(yǎng)與誘導(dǎo)過(guò)程為，將重組的大腸桿菌接種入含有50μg/ml氨芐的LB液體培 養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)3~4h，待培養(yǎng)菌液的0D 6Q()達(dá)到0.5~0.7，將培養(yǎng)溫度調(diào)為28°C，并且加入終 濃度為〇. 5mM的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，待誘導(dǎo)菌液0D6Q()為1.8~2.2，離心， 收集菌體。
[0013] 所述裂解過(guò)程為，用Tris-HCl溶液(20mM，pH 7 · 8~8 · 2)懸浮菌體，利用超聲破碎 10~20min〇
[0014] 所述純化過(guò)程為，將裂解后的菌液離心，收集上清液，將上清液注入Ni-NTA親和層 析色譜柱，然后用咪唑緩沖液進(jìn)行階段洗脫蛋白，最后將洗脫蛋白透析、濃縮處理得到細(xì)菌 烯酰還原酶。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0016] 1)以氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的細(xì)菌烯酰還原酶為抗原，免疫動(dòng)物制備抗 血清；
[0017] 2)純化抗血清得到細(xì)菌稀酰還原酶的多克隆抗體；
[0018 ] 3)對(duì)該多克隆抗體進(jìn)行濃度與效價(jià)的測(cè)定。
[0019] 為實(shí)現(xiàn)上述第三目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0020] 利用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測(cè)細(xì)菌Shewanella sp.AclO內(nèi)稀酰還 原酶的表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)方法為：
[0021] 1)將細(xì)菌Shewanella sp.AclO接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D為1.8~2.2,取1 ~2ml離心收集菌體，超聲破碎，離心、分別收集上清與沉淀樣品;將上清與沉淀樣品加入到 聚丙烯酰氨凝膠的上樣孔中。
[0022] 2)上樣后，啟動(dòng)電泳儀，直到電泳結(jié)束，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白樣品通過(guò)電 轉(zhuǎn)處理轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電轉(zhuǎn)結(jié)束后將PVDF膜干燥處理，然后在封閉液(5%脫脂奶粉）中封閉 處理lh，封閉處理后用PBST清洗PVDF膜干凈;然后用得到的多克隆抗體孵育lh后用PBST清 洗干凈，最后用二抗(羊抗兔-HRP)孵育lh后用PBST清洗干凈；
[0023] 3)將清洗完畢后的PVDF膜ECL顯影，暗室成像。
[0024]本發(fā)明中的大腸桿菌BL21(DE3)，載體質(zhì)粒pET21a( + )，異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，Ni-NTA親和層析色譜柱均可通過(guò)公開(kāi)市售的商業(yè)渠道取得。
[0025]本發(fā)明的有益效果：
[0026] 1)制備細(xì)菌稀酰還原酶多克隆抗體可以對(duì)野生型Shewanella sp.AclO內(nèi)該酶的 表達(dá)提供驗(yàn)證基礎(chǔ)。
[0027] 2)該多克隆抗體對(duì)烯酰還原酶的缺陷性的確認(rèn)提供驗(yàn)證基礎(chǔ)，還可以對(duì)外源啟動(dòng) 子修飾的工程菌進(jìn)行驗(yàn)證。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為雙酶切載體pET21a( + )的核酸電泳圖；其中l(wèi)adder為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);pET21a (+)為pET2 la (+)質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和EcoRI雙酶切后的核酸分子；
[0029] 圖2為雙酶切PCR產(chǎn)物的核酸電泳圖；其中l(wèi)adder為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);PCR product 為經(jīng)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和EcoRI雙酶切后的核酸分子；
[0030] 圖3為重組質(zhì)粒pET21a-Enrd示意圖；
[0031]圖4為蛋白純化SDS-PAGE分析圖；其中Μ為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1~14為細(xì)菌烯酰還 原酶經(jīng)過(guò)純化處理后得到的洗脫蛋白的條帶；
[0032]圖5為目的蛋白SDS-PAGE電泳圖譜;其中Μ為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為將圖4中12號(hào) 洗脫液SDS-PAGE電泳后，將藍(lán)色條帶切下放入透析袋經(jīng)過(guò)核酸電泳槽電泳，取透析袋中的 溶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳確認(rèn)純度；
[0033] 圖6為細(xì)菌稀酰還原酶多克隆抗體的Western Blotting分析圖；其中，Magic為用 于蛋白質(zhì)印記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);S為細(xì)菌Shewanella sp.Ac 10超聲破碎離心后的上清 液;P為細(xì)菌Shewanella sp.AclO超聲破碎離心后的沉淀。
【具體實(shí)施方式】 [0034] 實(shí)施例1
[0035]細(xì)菌烯酰還原酶的制備：
[0036] 1)烯酰還原酶基因的堿基序列的確定
[0037] 在 GenBank 中輸入 NCBI Reference Sequence : NC_008345 · 1，得到Shewanel la frigidimarina NCIMB 400的全基因序列，其中找到enoyl reductase基因，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu) 化后得到如SEQ ID No. 1所示的堿基序列。
[0038] 2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0039] 根據(jù)PET21a( + )的多克隆位點(diǎn)和細(xì)菌烯酰還原酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物：
[0040] 上游引物：5'-CTAGCTAGCATGACAACTCAAGTGCATAAC-3'（SEQ ID Νο·3)
[0041] 下游引物：5'-GGAATTCGCTTTTACTTGGTCAATTGG-3'（SEQ ID Νο·4)
[0042] 擴(kuò)增以Shewanella sp.AclO基因組為模板，擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：10XPCR反應(yīng)緩沖 液5yl，25mmol/L MgS〇4 2yl，10mmol dNTP 5yl，10nmol/L引物各ΙμL，基因組DNA模板80ng， KoD-Plus DNA聚合酶ΙμL，雙蒸去離子水定容至50μ1。反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性5min; 95°C 30s，55°C30s，68°C 延伸 2min，共計(jì) 30 個(gè)循環(huán);68°C 延伸 10min;15°C 保持 10min。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn) 物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收，克隆測(cè)序，測(cè)序由ABI3100測(cè)序儀完成。
[0043] 上述PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Ndel和EcoRI雙酶切，與經(jīng)相同限制內(nèi)切酶消 化的商業(yè)化載體pET21a( + )進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收，如圖1與圖2所示：ladder為 marker，pET21a( + )為載體pET21a( + )經(jīng)Ndel和EcoRI雙酶切的產(chǎn)物，PCR product為上述PCR 產(chǎn)物經(jīng)Ndel和EcoRI雙酶切。雙酶切后的pET21a( + )與PCR產(chǎn)物再經(jīng)高效DNA連接酶High Ligation(TOYOBO)催化連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET21a-Enrd，如圖3所示為重組質(zhì)粒pET21a-Enrd示意圖。
[0044] 3)重組大腸桿菌的篩選，培養(yǎng)，誘導(dǎo)，裂解：
[0045] 篩選:經(jīng)測(cè)序無(wú)突變的重組質(zhì)粒pET21a-Enrd轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)宿主， 利用含有50μg/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基篩選重組大腸桿菌。培養(yǎng):將篩選的重組大腸桿菌置 于1000ml含有終濃度為50μg/ml的Amp LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)4小時(shí)，待OD600達(dá)到0.6時(shí)，進(jìn) 行誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng):轉(zhuǎn)入28 °C的培養(yǎng)搖床并向菌液中添加終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)培 養(yǎng)至0D6Q()為2.0，4°C離心收集菌體。裂解：用Tris-HCl溶液(20mM，pH 8.0) 100ml懸浮菌體， 利用超聲破碎15min，4°C離心1小時(shí)，收集上清液。
[0046] 4)純化上清液得到純化的烯酰還原酶蛋白
[0047] 利用蛋白純化系統(tǒng)-Biol〇gic(BI0RAD)，將上清夜栗入Ni-NTA親和層析色譜柱，然 后用10~400mM咪唑緩沖液進(jìn)行階段洗脫蛋白，收集各階段的洗脫蛋白（如圖4所示）。為了 確定蛋白的單一性，將圖4中的12號(hào)洗脫蛋白藍(lán)色的條帶切下，放入透析袋中利用核酸電泳 槽電泳，電泳完畢后取出透析袋中的溶液再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢查12號(hào)蛋白是否是單一 蛋白。如圖5所示，其中1為12號(hào)洗脫蛋白樣品，Μ為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，圖中可以看出在44.3 與66.4KDa之間有單一蛋白條帶，說(shuō)明12號(hào)洗脫蛋白的單一性好。將12號(hào)洗脫蛋白置于透析 袋，用20mM 1'1^8-!1(]1(口!18.0)于4<€條件過(guò)夜透析。透析后的蛋白利用離心濃縮管(細(xì);[(3011) 濃縮得到烯酰還原酶，并利用10%SDS-PAGE檢測(cè)分析純化濃縮后的烯酰還原酶。
[0048] 實(shí)施例2
[0049] 細(xì)菌烯酰還原酶多克隆抗體的制備：
[0050] 以實(shí)施例1得到的烯酰還原酶為抗原，免疫家兔制備抗血清；
[0051 ]免疫家兔具體過(guò)程如下:免疫前采集500μ1家兔血液，作為對(duì)照血清。將實(shí)施例1得 到的純化濃縮后的烯酰還原酶作為抗原，采用皮下注射免疫2kg的白兔(Sic :NZW)，每次注 射500yg抗原，2周免疫一次，共免疫4次，采血檢測(cè)，通過(guò)ELISA方法確定抗體針對(duì)抗原的效 價(jià)，效價(jià)大于1:50000進(jìn)行最終采血制備抗血清然后純化抗血清制備多克隆抗體，并檢測(cè)多 克隆抗體的濃度。
[0052] 1)多克隆抗體濃度的測(cè)定，采用BAS標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定，具體方法為：
[0053] 1.1，CBB染色液配制:根據(jù)樣品數(shù)量，將5 X CBB染色液稀釋?zhuān)浞只靹颉?br>[0054] 1 ·2,根據(jù)需要取適量BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制終濃度分別為lmg/ml、0·75mg/ml、0·5mg/ ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml標(biāo)準(zhǔn)樣，并混勻。標(biāo)準(zhǔn)樣采用PBS為溶劑。
[0055] 1 · 3，取一塊酶標(biāo)板，按表1加入試劑：
[0056]表1酶標(biāo)板加入的試劑
[0058] 1.4,振蕩混勻后，室溫下靜置30min。
[0059] 1.5，用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光值，以不含BSA的光吸收為空白對(duì)照，以蛋白含 量(yg)為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0060] 1.6，將純化后的多克隆抗體用PBS緩沖液過(guò)夜透析，稀釋抗體，加入CBB染色液，利 用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光值；
[0061] 1.7,根據(jù)測(cè)得的吸收值，在BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算抗體的濃度，，得出多克隆抗體的 濃度為：1.2mg/ml。
[0062] 2)多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定，采用ELISA方法測(cè)定，具體方法為：
[0063] 2.1，將抗原用碳酸鈉緩沖液(pH 9.6)稀釋到10μg/ml，將抗原置于酶標(biāo)96孔板，每 孔100μΙ孵育lh。
[0064] 2 · 2，用PBS-T將酶標(biāo)96孔板清洗3次。
[0065] 2.3，用5%81^111111；[11<:封閉酶標(biāo)板1小時(shí)，每孔10(^1。
[0066] 2 · 4，用PBS-T將酶標(biāo)板清洗3次。
[0067] 2.5，稀釋的血清，用PBS-T稀釋血清5000倍，孵育抗原lh。
[0068] 2 · 6，用PBS-T將酶標(biāo)板清洗3次。
[0069] 2.7，每孔加入10(^1!?^標(biāo)記的羊抗兔抗體，用1^5-1'稀釋羊抗兔抗體5000倍，孵 育lh。
[0070] 2 · 8，利用PBS-T將酶標(biāo)板清洗3次。
[0071] 2.9，清洗完畢后每孔加入10(^1顯色液4831'，反應(yīng)2〇11^11后每孔加入5(^1過(guò)氧化 氫；
[0072] 3.0，最后分光光度計(jì)上測(cè)420nm上述步驟2.9中樣品的0D值，得出效價(jià)為1:16，大 于1:50000然后進(jìn)彳丁最終米血制備抗血清。
[0073] 3)純化血清的過(guò)程是：將抗原蛋白-烯酰還原酶與Ni-NTA偶聯(lián)制備成抗體純化層 析柱，將所得抗血清與PBS緩沖液按照1:1的體積比例混合后，緩慢經(jīng)過(guò)抗體純化層析柱，待 抗體與抗原結(jié)合后用甘氨酸溶液洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，獲得純化的烯酰還原酶多克隆抗 體，純化的烯酰還原酶多克隆抗體利用PBS緩沖液過(guò)夜透析，次日進(jìn)行濃度和效價(jià)測(cè)定。
[0074] 實(shí)施例3
[0075] 細(xì)菌稀酰還原酶的多克隆抗體應(yīng)用于細(xì)菌Shewanella sp.AclO內(nèi)稀酰還原酶表 達(dá)的檢測(cè)：
[0076] 采用Western Blotting抗體特異性測(cè)定方法包括以下步驟：
[0077] (1)將細(xì)菌51^￥3116113 8口.六(310接種至1^液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至00為1.8~2.2，取1 ~2ml離心收集菌體，300μ1 Tris-HCl(20mM，pH 8.0)重懸，超聲破碎，15000rpm離心、分別 收集上清與沉淀;上清液取20μ1與5μ1 5 X SDS上樣緩沖液混合，取10μ1進(jìn)行SDS-PAGE電泳； 沉淀用30μ1 1 X SDS上樣緩沖液懸浮，取3μ1進(jìn)行SDS-PAGE電泳;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)上樣量 為0·8μ1;
[0078] (2)上樣后，電泳儀恒定為18mA，直到電泳結(jié)束；電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白樣品 通過(guò)電轉(zhuǎn)處理轉(zhuǎn)移至PVDF膜，設(shè)定電轉(zhuǎn)電流為0.23A，電轉(zhuǎn)時(shí)間為35min;
[0079] (3)電轉(zhuǎn)結(jié)束后將PVDF膜干燥處理，然后在5%脫脂奶粉封閉液中封閉處理lh;
[0080] (4)封閉處理后用PBST清洗PVDF膜5次；
[0081] (5)用封閉液5000稀釋純化的抗體，用稀釋后的抗體孵育lh后用PBST清洗5次；
[0082] (6)清洗完畢后用封閉液1:20000稀釋二抗(羊抗兔-HRP)，用稀釋后的二抗孵育lh 后用PBST清洗5次；
[0083] (7)將清洗完畢后的PVDF膜ECL顯影，暗室成像，成像結(jié)果如圖6所示:Magic為用于 蛋白質(zhì)印記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);S為細(xì)菌Shewane 1 la sp.Ac 10超聲破碎離心后的上清液； ?為細(xì)菌3]16￥&11611&8口.4(310超聲破碎離心后的沉淀。其中細(xì)菌3]16￥&11611&8口.4(310超聲 破碎離心后的沉淀作為陰性對(duì)照，其中上清液經(jīng)過(guò)Western Blotting后在50KDa與60KDa之 間有條帶顯現(xiàn)，說(shuō)明該抗體可以免疫反應(yīng)烯酰還原酶。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種細(xì)菌烯酰還原酶，其特征在于，所述細(xì)菌烯酰還原酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的細(xì)菌烯酰還原酶的核酸，其特征在于，所述核酸的堿基序 列如SEQ ID No.l所示。3. -種如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟： 1) 以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的細(xì)菌烯酰還原酶為抗原，免疫動(dòng)物制備抗血清； 2) 純化抗血清得到細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 烯酰還原酶的制備方法為： 1) 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SEQ ID No.l所示的核酸片段； 2) 將核酸片段克隆入載體質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒； 3) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌得到重組大腸桿菌，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)與誘導(dǎo)、裂解、純化，得到 氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的細(xì)菌烯酰還原酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 大腸桿菌為大腸桿菌BL21 (DE3);所述載體質(zhì)粒為pET21 a (+)。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 PCR技術(shù)擴(kuò)增中所用的引物為：上游引物如SEQ ID No.3所示；下游引物如SEQ ID No.4所 不。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 培養(yǎng)與誘導(dǎo)過(guò)程為，將重組的大腸桿菌接種入含有50μg/ml氨芐的LB液體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng) 3~4h，待培養(yǎng)菌液的OD600達(dá)到0.5~0.7，將培養(yǎng)溫度調(diào)為28°C，并且加入終濃度為0.5mM的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，待誘導(dǎo)菌液OD600為1.8~2.2，離心，收集菌體。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 純化的過(guò)程為:將裂解后的菌液離心，收集上清液，將上清液注入Ni-NTA親和層析色譜柱， 然后用咪唑緩沖液進(jìn)行階段洗脫蛋白，最后將洗脫蛋白透析、濃縮處理得到細(xì)菌烯酰還原 酶。9. 一種細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)菌烯酰還原酶的多 克隆抗體在檢測(cè)細(xì)菌Shewanella sp.AclO內(nèi)稀酰還原酶的表達(dá)的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)菌烯酰還原酶的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述檢 測(cè)方法為蛋白質(zhì)印跡法。
【文檔編號(hào)】C07K16/06GK105936896SQ201610492730
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】宮春杰, 胡征, 張華山, 王偉平
【申請(qǐng)人】湖北工業(yè)大學(xué)