一種地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法
【專利摘要】一種地衣芽孢桿菌產(chǎn)β?甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其包括如下步驟：以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，37℃搖瓶培養(yǎng)；其中，發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中包含氮源和碳源，所述氮源為NH4NO3、氨水、NH4Cl、(NH4)2SO4、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、麩皮、尿素、豆粕或其組合，優(yōu)選地，氮源為兩種以上的組合；所述碳源為魔芋粉、葡萄糖、面粉或其組合，優(yōu)選地，碳源為兩種以上的組合；所述氮源初始加入量為0.1?10％(w/v)；所述碳源初始加入量為0.1?10％(w/v)；補(bǔ)加的時(shí)間為反應(yīng)開始后1?40小時(shí)或酶活力降低點(diǎn)時(shí)或菌體數(shù)降低點(diǎn)時(shí)或還原糖降低點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選的補(bǔ)加時(shí)同時(shí)加入碳源和氮源，或不同時(shí)間加入碳源和氮源；所述氮源補(bǔ)加量為0.1?10％(w/v)；所述碳源補(bǔ)加量為0.1?10％(w/v)。
【專利說(shuō)明】
一種地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種酶發(fā)酵的補(bǔ)料方法，具體涉及地衣芽孢桿菌HDGLJT-01產(chǎn)β-甘露 聚糖酶的補(bǔ)料方法。
【背景技術(shù)】
[0002] β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)離不開碳源和氮源，碳源作為菌體增殖、代謝所必須的碳架 構(gòu)成來(lái)源是必不可少的，同時(shí)氮源作為蛋白酶類的必要原料，亦十分重要。魔芋粉作為一種 誘導(dǎo)甘露聚糖酶生產(chǎn)既廉價(jià)又高效的碳源材料，有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)地位。但在實(shí)驗(yàn)室前期 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):在5L發(fā)酵罐中一次性加入6% (w/v)的高濃度魔芋粉，其酶活力并未達(dá)到預(yù)期 高濃度高酶活的效果。在5L發(fā)酵罐中初始加入l%(w/v)的魔芋粉，后在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期補(bǔ)加 2% (w/v)的魔芋粉，酶活力高于前者，并且節(jié)約了原料。這是由于魔芋粉性質(zhì)特殊，自身遇 水極易變粘稠造成的，若一次性加入大量魔芋粉，這使得培養(yǎng)基中溶氧量降低，抑制了地衣 芽孢桿菌的增殖，不利于甘露聚糖酶的積累，且容易對(duì)機(jī)械造成損傷;然而僅一次性加入 少量魔芋粉，又不能為菌體增殖和代謝提供充足的碳源物質(zhì)，因此補(bǔ)料發(fā)酵策略的研究成 為了目前實(shí)驗(yàn)室研究地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)HDGLJT-01生產(chǎn)β-甘露聚糖 酶的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明利用碳氮源流加方法，解決了以上問(wèn)題，提高了 甘露聚糖酶的產(chǎn) 量，縮短發(fā)酵周期，節(jié)約成本，擴(kuò)大經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)為該菌株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基 礎(chǔ)，提供實(shí)踐指導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌HDGLJT-01產(chǎn)β-甘露聚糖酶 的補(bǔ)料方法，其包括如下步驟:以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，37°C搖瓶培養(yǎng)；
[0004] 其中，發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中包含氮源和碳源，
[0005] 所述氮源為NH4N〇3、氨水、NH4CI、(NH4) 2 S〇4、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、麩皮、尿素、豆 柏或其組合，優(yōu)選地，氮源為兩種以上的組合；
[0006] 所述碳源為魔芋粉、葡萄糖、面粉或其組合，優(yōu)選地，碳源為兩種以上的組合；
[0007] 所述氮源初始加入量為0· 1-10% (W/V);
[0008] 所述碳源初始加入量為0 · 1-10% (W/V);
[0009] 補(bǔ)加的時(shí)間為反應(yīng)開始后1-40小時(shí)或酶活力降低點(diǎn)時(shí)或菌體數(shù)降低點(diǎn)時(shí)或還原 糖降低點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選的補(bǔ)加時(shí)同時(shí)加入碳源和氮源，或不同時(shí)間加入碳源和氮源；
[0010] 所述氮源補(bǔ)加量為0.1-10% (W/V);
[0011] 所述碳源補(bǔ)加量為0.1-10%(w/v)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述氮源的初始加入量為ο· 1 %-5% (w/v)(優(yōu)選為0.5%，1%，2%，3% (w/v))的NH4NO3、酵母粉、豆柏或氨水;更優(yōu)選為1 % (w/v)NH4N〇3+0 · 5% (w/v)酵母粉、1 % (w/v)NH4N〇3+l % (w/v)酵母粉、1 % (w/v)NH4N〇3+2% (w/v)酵母粉、1 % (w/v)NH4N〇3+3% (w/ v)酵母粉、〇.5%(w/v)NH4N〇3+0.5% (w/v)酵母粉、2%(w/v)NH4N〇3+0.5%(w/v)酵母粉或 3%(w/v)NH4N〇3+0.5% (w/v)酵母粉。
[0013] 進(jìn)一步地，所述碳源的初始加入量為〇· 1 %-5% (w/v)(優(yōu)選為0.5%，1%，2%，3% (w/v))的葡萄糖或魔芋粉，或0.1 %-5 % (w/v)(優(yōu)選為0.5%，1%，2%，3% (w/v))的葡萄糖 與0.1 % -5 % (w/v)(優(yōu)選為0.5%，1%，2%，3% (w/v))的魔芋粉的組合;更優(yōu)選為0.5 % (w/ v)葡萄糖+1%魔芋粉(w/v)、0.5%(w/v)葡萄糖+0.5%魔芋粉(w/V)、0.5%(w/ V)葡萄糖+ 2%魔芋粉(￥八)、0.5%(￥八)葡萄糖+3%魔芋粉(￥八)、1%(￥八)葡萄糖+1%魔芋粉(￥八）、 2% (w/v)葡萄糖+1%魔芋粉(w/v)或3% (w/v)葡萄糖+1%魔芋粉(w/v)。
[0014] 進(jìn)一步地，氮源與碳源的C/N介于7:1-14:1之間，優(yōu)選為8:1、9:1、10:1、11 :1、12: 1、13:1〇
[0015] 進(jìn)一步地，在酶活降低點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)加0.1-5%(￥八）（0.5_1.5%(￥八)或1%(￥八））魔 芋粉;或在還原糖降低點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)加〇. 1-5%(*八)（0.3-0.8(￥八)或0.5%(￥八)）葡萄糖。
[0016] 進(jìn)一步地，在酶活降低點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)加 0.1-5%(w/v)(0.3-0.8(w/v)S0.5%(w/v))S l%(w/v))酵母粉。
[0017]進(jìn)一步地，碳源初始加入量設(shè)為1% (w/v)魔芋粉+0.5% (w/v)葡萄糖，氮源初始加 入量為1% (w/v)NH4N〇3和0.5% (w/v)酵母粉，酶活力降低時(shí)補(bǔ)加1% (w/v)魔芋粉，還原糖降 低的時(shí)候補(bǔ)加0.5%葡萄糖，酶活力再次降低時(shí)，補(bǔ)加0.5%酵母粉。
[0018]進(jìn)一步地，所述的地衣芽孢桿菌為HDGLJT-01，該菌株已在之前專利中 CN102191235A公開，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC M209288。 [0019]在酶活力降低點(diǎn)6h加入l%(w/v)魔芋粉，并得到搖瓶水平酶活力較未補(bǔ)加時(shí)，提 高約94%。在發(fā)酵過(guò)程還原糖降低點(diǎn)，補(bǔ)加少量葡萄糖，一方面可以迅速緩解還原糖的匱 乏，另一方面又可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，從而提高酶活力。在還原糖降低點(diǎn)8h處補(bǔ)加0.5%(w/v) 葡萄糖，得到搖瓶水平酶活力較未補(bǔ)加時(shí)，提高約23%。氮源加入量不宜過(guò)多，因此在酶活 力(還原糖）、菌體數(shù)變化的幾個(gè)拐點(diǎn)嘗試補(bǔ)加氮源，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加效 果顯著，可使酶活力回升，這說(shuō)明氮源的流加即使補(bǔ)充了發(fā)酵體系中氮源的匱乏。而在菌體 數(shù)降低點(diǎn)補(bǔ)加氮源幾乎無(wú)效果。在酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加 l%(w/V)魔芋粉，搖瓶水平最高酶活 力為1533.26± 33.74U/mL，較未優(yōu)化時(shí)提高1.20倍;在還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加0.5% (w/v)葡萄 糖，搖瓶水平最高酶活力為966 · 53 ± 27 · 84U/mL，較未優(yōu)化時(shí)提高38 · 79%。在酶活力降低點(diǎn) 補(bǔ)加0.5%(w/v)酵母粉，搖瓶水平最高酶活力為2832.32±49.14U/mL，較未優(yōu)化時(shí)提高 3.07倍。在5L發(fā)酵罐水平，碳源優(yōu)化并流加后酶活為2238.14 ± 33.65U/mL，較搖瓶水平未優(yōu) 化時(shí)提高2.22倍;氮源優(yōu)化并流加后酶活為3052.78±38.14U/mL，較搖瓶水平未優(yōu)化時(shí)提 高3.39倍;碳源和氮源均優(yōu)化流加后酶活力為3321.64 ± 27.94U/mL，較搖瓶水平未優(yōu)化時(shí) 提高3.77倍。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)化了B.icheniformis HDGLJT-01在搖瓶和5L發(fā)酵罐中生產(chǎn)β-甘露聚糖 酶的補(bǔ)料發(fā)酵條件，為B.icheniformis HDGLJT-01的工業(yè)化應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，提供了 實(shí)踐指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為不同碳源底物對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵48h產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。
[0022]圖2為初始加入0.5% (w/v)葡萄糖+1 %魔芋粉(w/v)時(shí)，菌株HDGLJT-01發(fā)酵產(chǎn)β- 甘露聚糖酶過(guò)程。
[0023]圖3為酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0024]圖4為酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)魔芋粉補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0025] 圖5為還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)萄萄糖補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0026] 圖6為還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)魔芋粉補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0027] 圖7為菌體數(shù)降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0028] 圖8為菌體數(shù)降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)魔芋粉補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果
[0029]圖9為酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加不同魔芋粉濃度對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶 的影響。Α、魔芋粉濃度為0.5% (w/v)，Β、魔芋粉濃度為1% (w/v)，C、魔芋粉濃度為2% (w/ v) 〇
[0030] 圖10為還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加不同葡萄糖濃度對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶 的影響。Α、葡萄糖濃度為0.5%(?八）3、葡萄糖濃度為1%(?八），(：、葡萄糖濃度為2%(?/ ν) 〇
[0031] 圖11為不同氮源種類對(duì)底物對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。
[0032] 圖12為不同ΝΗ4Ν03濃度對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。Α、ΝΗ4Ν〇3濃 度為0.5% (w/v)，Β、ΝΗ4Ν〇3濃度為 1 % (w/v)，C、NH4N〇3濃度為2% (w/v)，D、NH4N〇3濃度為3% (w/v)〇
[0033] 圖13為不同酵母粉濃度對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。A、酵母粉 濃度為0.5%，B、酵母粉濃度為1 %，C、酵母粉濃度為2%，D、酵母粉濃度為3%。
[0034] 圖14為初始加入1 % (w/v)NH4N03+0 · 5% (w/v)酵母粉時(shí)，菌株HDGLJT-01發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶過(guò)程。
[0035]圖15為酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加1%(w/v)NH4N03補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0036]圖16為酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加1%酵母粉補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0037] 圖17為還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加 l%NH4N〇3補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0038] 圖18為還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加1%酵母粉補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果。
[0039]圖19為酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加不同酵母粉濃度對(duì)HDGLJT-01分批發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶 的影響。Α、濃度為0.5% (w/v)，Β、酵母粉濃度為1 % (w/v)，C、酵母粉濃度為2% (w/v)，D、酵 母粉濃度為3 % (w/v)。
[0040] 圖20為初始培養(yǎng)基中加入0.5%(?八)葡萄糖、1%(?八)魔芋粉，及1%(?八)順4脳 和0.5% (w/v)酵母粉，發(fā)酵28h補(bǔ)加0.5%酵母粉。
【具體實(shí)施方式】
[0041 ]實(shí)施例1碳源對(duì)地衣芽胞桿菌(B. licheniformis)發(fā)酵產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響及 補(bǔ)加發(fā)酵策略的優(yōu)化 [0042] 1.1碳源種類初篩
[0043] 以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改變碳源種類，分別加入1 % (w/v)碳源葡萄糖、魔芋粉 和面粉，接入6.7%(v/v)種子培養(yǎng)液，37°C、轉(zhuǎn)速300r/min，100mL/250mL裝液量搖瓶培養(yǎng) 48h，以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌株HDGLJT-01產(chǎn)酶的較優(yōu)碳源加入種類。
[0044] 由圖1可知，當(dāng)初始碳源培養(yǎng)基為魔芋粉、葡萄糖、面粉時(shí)，β-甘露聚糖酶酶活力最 高值分別為696.35±23.47U/mL、288.13±21.59U/mL、65.21±5.78U/mL。由于魔芋粉與葡 萄糖均可以促進(jìn)地衣芽胞桿菌發(fā)酵生甘露聚糖酶，魔芋粉作為碳源酶活性最高，最高值 達(dá)到696.35±23.47U/mL，葡萄糖次之，所以后續(xù)試驗(yàn)將同時(shí)選擇二者作為碳源。
[0045] 1.2碳源初始加入量的優(yōu)化
[0046] 以葡萄糖和魔芋粉為碳源，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，調(diào)整碳源的加入量，即分別 加入0.5%，1%，2%，3% (w/v)的葡萄糖或魔芋粉，接入6.7 % (v/v)種子培養(yǎng)液，37 °C、 300r/min，100mL/250mL裝液量，搖瓶培養(yǎng)48h，以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌株 HDGLJT-01產(chǎn)酶的碳源初始加入量。
[0047] 表1葡萄糖濃度對(duì)生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的多重比較
[0049] 注：按Duncan's新負(fù)極差檢測(cè)(Ρ〈0.05)進(jìn)行分析，同一列內(nèi)不同字母表示處理間 差異顯著
[0050]由表1可知，各濃度葡萄糖所產(chǎn)生的高β-甘露聚糖酶酶活之間差異顯著(Ρ〈0.05)。 所產(chǎn)生的最高酶活分別為 284.47±11.59U/mL(16h)、288.78±12.47U/mL(24h)、265.43± 15.78U/mL(24h)、241.28 ± 17.28U/mL(24h)，高濃度底物并不會(huì)帶來(lái)高活性酶活，這說(shuō)明大 量加入葡萄糖反而可能抑制產(chǎn)物的積累，致使酶活力低下。因此，將葡萄糖的初始加入量設(shè) 定為0.5% (w/v)為宜。
[0051 ]表2魔芋粉濃度對(duì)生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的多重比較
[0053] 注：按Duncan's新負(fù)極差檢測(cè)(Ρ〈0.05)進(jìn)行分析，同一列內(nèi)不同字母表示處理間 差異顯著
[0054]從酶活情況來(lái)看，各個(gè)濃度魔芋粉所產(chǎn)生的最高酶活依次為533.56 ± 19.45U/mL (24h)、695·84 ± 23·42U/mL(24h)、473·64 ±13·89U/mL(24h)、436·15 ±13·62U/mL(24h)，這 說(shuō)明魔芋粉誘導(dǎo)甘露聚糖酶效果良好，但是高濃度魔芋粉發(fā)酵產(chǎn)酶的情況并不理想，少 量或適量即可，加入量過(guò)多，易導(dǎo)致發(fā)酵液粘稠，降低溶氧，抑制菌體生長(zhǎng)代謝，并且不利于 產(chǎn)物的積累。因此，將魔芋粉的初始加入量設(shè)定為l%(w/V)為宜。
[0055] 1.3初始碳源加入方案的確定
[0056] 以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，接入6.7 % (v/v)種子培養(yǎng)液，37 °C、300r/min，100mL/ 250mL裝液量搖瓶培養(yǎng)48h，同時(shí)設(shè)定如下初始碳源加入方案(見表3)。以β-甘露聚糖酶酶活 力為檢測(cè)指標(biāo)，確定菌株HDGLJT-01產(chǎn)酶碳源初始加入的最佳方案，并找出酶活力、還原糖、 菌體數(shù)發(fā)生變化的拐點(diǎn)，以利于進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵方案的確定。
[0057]表3初始碳源加入方案
[0059]根據(jù)表3中結(jié)果，分別將最優(yōu)的葡萄糖濃度和魔芋粉濃度與其它濃度進(jìn)行搭配。按 照選取酶活力高、酶活力最高值出現(xiàn)早的方案，本試驗(yàn)選定方案2作為初始碳源加入組合。
[0060] 對(duì)方案2進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，雖然單獨(dú)增加葡萄糖和魔芋粉的初始加入量不會(huì)提高最 大酶活力或加快最大酶活力出現(xiàn)時(shí)間，但是將二者進(jìn)行組合后最大酶活力和出現(xiàn)時(shí)間能夠 極大的提高，說(shuō)明其二者雖然都是碳源，但是其作用的機(jī)理可能不同，二者合用能夠產(chǎn)生協(xié) 同增效的作用。此外，如圖2所示，當(dāng)初始培養(yǎng)基中加入0.5% (w/v)葡萄糖+1%魔芋粉(w/v) 時(shí)，發(fā)酵4h后，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體迅速增殖至24h達(dá)到最大值392 X 109CFU，之后進(jìn) 入衰亡期，菌體濃度逐漸減小。pH值伴隨著菌體生長(zhǎng)由初始8.0下降至最低值5.3。酶活力增 長(zhǎng)至6h左右達(dá)到最大值789.07 ± 25.82U/mL，之后酶活力逐漸降低，此時(shí)還原糖量上升至最 高濃度0.52g/mL，隨后被菌體生長(zhǎng)代謝所利用而減小，并且酶活的降低與還原糖的降低呈 現(xiàn)同樣的趨勢(shì)，這說(shuō)明還原糖引起酶活的下降，雖然此時(shí)菌體依然處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，這說(shuō) 明初始加入的碳源不夠維持菌體的生長(zhǎng)代謝，無(wú)法維持酶的大量積累，因此應(yīng)在酶活力降 低點(diǎn)、還原糖降低點(diǎn)、菌體數(shù)降低點(diǎn)等，嘗試補(bǔ)加碳源。
[0061] 1.4碳源補(bǔ)加時(shí)間的確定
[0062] 以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將碳源設(shè)置為最佳初始碳源加入方案，接入6.7% (v/ v)種子培養(yǎng)液，37°C、300r/min，100mL/250mL裝液量搖瓶培養(yǎng)，按照如下方式進(jìn)行碳源補(bǔ)加 (見表4)，并發(fā)酵至48h。以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌株HDGLJT-01產(chǎn)酶碳源補(bǔ) 加時(shí)間。
[0063]表4碳源補(bǔ)加時(shí)機(jī)方案
[0065] 在利用初始培養(yǎng)基中加入0.5% (w/v)葡萄糖+1 % (w/v)魔芋粉進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，β-甘 露聚糖酶酶活在6小時(shí)開始出現(xiàn)下降（圖3)，因此，首先在酶活下降拐點(diǎn)，補(bǔ)加碳源。試驗(yàn)分 另IJ檢測(cè)了補(bǔ)加1 % (w/v)葡萄糖和1 % (w/v)魔芋粉對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響。
[0066] 比較兩種補(bǔ)加碳源的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酶活降低點(diǎn)補(bǔ)加1%魔芋粉，可以使發(fā)酵體系中 高酶活出現(xiàn)的時(shí)間（28h)早于補(bǔ)加葡萄糖(44h)，并且酶活比后者高多少1.22倍。由此確定 在酶活降低點(diǎn)補(bǔ)加碳源時(shí)，選擇魔芋粉的效果更好。
[0067] 在利用初始培養(yǎng)基中加入0.5% (w/v)葡萄糖+1 % (w/v)魔芋粉進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，還原 糖在8小時(shí)開始出現(xiàn)下降（圖3)，因此，在還原糖下降拐點(diǎn)，補(bǔ)加碳源。試驗(yàn)分別檢測(cè)了補(bǔ)加 1 % (w/v)葡萄糖和1 % (w/v)魔芋粉對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響。
[0068] 比較兩種碳源補(bǔ)加方式結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加 l%(w/v)葡萄糖，可以大 大促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，20h菌體數(shù)量最高達(dá)410X109CFU，較補(bǔ)加 l%(w/v)魔芋粉菌體數(shù)量高 205.97%。
[0069] 在利用初始培養(yǎng)基中加入0.5% (w/v)葡萄糖+1 % (w/v)魔芋粉進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，菌體 數(shù)在24小時(shí)開始出現(xiàn)下降（圖7)，因此，在菌體數(shù)下降拐點(diǎn)，補(bǔ)加碳源。試驗(yàn)分別檢測(cè)了補(bǔ)加 1 % (w/v)葡萄糖和1 % (w/v)魔芋粉對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響。
[0070] 綜上可以看出，在酶活力降低點(diǎn)（6h)補(bǔ)加魔芋粉對(duì)酶活力促進(jìn)效果明顯，在還原 糖降低點(diǎn)（8h)加葡萄糖在菌體生長(zhǎng)方面的促進(jìn)效果明顯，但在菌體數(shù)降低點(diǎn)補(bǔ)加兩種碳 源，效果不十分明顯。
[0071] 1.5碳源補(bǔ)加量的優(yōu)化
[0072] 在確定了最佳碳源補(bǔ)加時(shí)間基礎(chǔ)上，分別調(diào)整補(bǔ)加碳源魔芋粉和葡萄糖含量為 0 · 5% (w/v)、1 % (w/v)、2% (w/v)、3% (w/v)，接入6 · 7% (v/v)種子培養(yǎng)液，37°C、300r/min 搖瓶培養(yǎng)48h，以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌株HDGLJT-01產(chǎn)酶碳源補(bǔ)加量。 [0073]比較分析后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)加1 % (w/v)魔芋粉時(shí)，酶活最高，所以確定用1 %魔芋粉在發(fā) 酵6小時(shí)時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加。
[0074]實(shí)驗(yàn)表明葡萄糖的含量不宜過(guò)高，0.5 %即可，過(guò)高容易抑制菌體生長(zhǎng)和酶的積 累。由此可以看出，在酶活力降低點(diǎn)補(bǔ)加1%魔芋粉可以促進(jìn)發(fā)酵體系產(chǎn)生高酶活，在28h酶 活可達(dá)1533.26 ± 33.74U/mL。在還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加0.5%葡萄糖，可以使發(fā)酵體系中菌體數(shù) 量出現(xiàn)增加，這為持續(xù)產(chǎn)酶奠定了菌體基礎(chǔ)。
[0075] 實(shí)施例2氮源對(duì)地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶的影響及補(bǔ)加發(fā)酵策略的確定
[0076] 2.1氮源種類的初篩
[0077]以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，改變氮源種類，分別加入l%(w/v)的(NH4)2S0 4、氨水、 NH4CI、NH4N〇3、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、麩皮、尿素、豆柏，接入6.7 % (v/v)種子培養(yǎng)液，37 °C、300r/min，100mL/250mL裝液量搖瓶培養(yǎng)48h，以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌 株HDGLJT-01產(chǎn)酶的較優(yōu)氮源加入種類。
[0078]本試驗(yàn)中，綜合誘導(dǎo)產(chǎn)β_甘露聚糖酶的效果和經(jīng)濟(jì)因素，初步選定ΝΗ4Ν03、氨水、 NH4C1、（順4) 2S〇4、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、麩皮、尿素、豆柏作為HDGLJT-01產(chǎn)β-甘露聚糖酶 的氮源材料。這些氮源與優(yōu)化后的碳源培養(yǎng)基的C/N介于7:1-14:1之間。
[0079]由圖可知，無(wú)機(jī)氮源中ΝΗ4Ν03效果最為明顯，最高酶活力為642.4 ± 25.45U/mL，與 其他無(wú)機(jī)氮源相比差異顯著;次高為氨水，最高酶活力為613.56±25.41U/mL，與其他無(wú)機(jī) 氮源相比差異顯著。有機(jī)氮源中酵母粉效果最好，最高酶活力高達(dá)1191.59±43.14U/mL，與 其他有機(jī)氮源相比差異顯著；有機(jī)氮源中豆柏效果較好，最高酶活力可達(dá)1100.46 土 40.14U/mL，與其他有機(jī)氮源相比差異顯著。因此選用NH4N〇3和酵母粉做為試驗(yàn)用氮源。 [0080]表5酶活力在不同氮源種類時(shí)的多重比較
[0083] 注：按Duncan's新負(fù)極差檢測(cè)(P〈0.05)進(jìn)行分析，同一列內(nèi)不同字母表示處理間 差異顯著
[0084] 2.2氮源初始加入量的優(yōu)化
[0085] 初步確定NH4N〇3和酵母粉為較優(yōu)碳源，豆柏和氨水為次優(yōu)氮源，在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 基礎(chǔ)上，將碳源設(shè)置為最佳碳源初始加入方案（l%(w/V)魔芋粉、〇.5%(w/v)葡萄糖），同時(shí) 再分別加入0.5%，1%，2%，3%(w/v)的NH4N03、酵母粉、豆柏或氨水，37°C、300r/min， 100mL/250mL裝液量搖瓶培養(yǎng)48h，以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌株HDGLJT-01 產(chǎn)酶的氮源的初始加入量。
[0086] 本試驗(yàn)首先考察加入不同濃度ΝΗ4Ν03 0.5%、1%、2%、3%(?八)時(shí)，地衣芽胞桿菌 發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響，結(jié)果見圖12中A、Β、C、D。
[0087] 當(dāng)NH4NO3含量分別為0.5%(￥八）、1%(￥八）、2%(￥八）、3%(￥八)時(shí)，從酶活情況來(lái) 看，各個(gè)濃度NH4N03所產(chǎn)生的最高酶活分別為1918.67±22.94U/mL(32h)、1950.05 土 25.41U/mL(32h)、1945.32±31.15U/mL(36h)、1951.32±28.74U/mL(36h)，因此選定 1% NH4N03做為氮源。
[0088] 本試驗(yàn)繼續(xù)考察加入不同濃度有機(jī)氮源酵母粉(0.5 %、1 %、2 %、3 % (w/v)時(shí)，地 衣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響，結(jié)果見圖13中A、B、C、D。
[0089] 由圖13A-13D可知，加入不同含量的酵母粉時(shí)，均可使酶活力明顯提高，最高酶活 力均在1500U/mL以上，但酵母粉加入量與酶活力變化并不成正比，如當(dāng)酵母粉加入量分別 為0.5%、1%、2%、3%時(shí)，最高酶活分別為2125±31.691]/111以2811)、2171±21.281]/11^ (28h)、1727±23.69U/mL(32h)、1546±22.15U/mL(28h)。反倒是隨著酵母粉濃度的增加，酶 活出現(xiàn)降低的情況。因此，將酵母粉的初始加入量設(shè)定為l%(w/V)為宜。
[0090] 2.3氮源初始加入方案的確定
[0091 ]以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將碳源設(shè)置為最佳碳源初始加入方案（1 % (w/v)魔芋 粉、0.5%(w/v)葡萄糖），接入 6·7%(v/v)種子培養(yǎng)液，37°C、300r/min，100mL/250mL 裝液量 搖瓶培養(yǎng)48h，同時(shí)設(shè)定如下初始氮源加入方案(見表6)。以β-甘露聚糖酶酶活力為檢測(cè)指 標(biāo)，確定檢菌株HDGLJT-01產(chǎn)酶碳源初始加入的最佳方案，并找出酶活力、還原糖、菌體數(shù)發(fā) 生變化的拐點(diǎn)，以利于進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵方案的確定。
[0092]表6初始氮源培養(yǎng)基加入方案
[0094] 對(duì)方案1進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始培養(yǎng)基中加入1 % (w/v)NH4N〇3+0.5% (w/v)酵母粉 時(shí)，發(fā)酵4h后，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體迅速增殖至28h達(dá)到最大值369 X 109CFU，之后進(jìn) 入衰亡期，菌體數(shù)量逐漸減小。pH值伴隨著菌體生長(zhǎng)由初始8.0逐漸下降至最低值5.6。酶活 力增長(zhǎng)至28h左右達(dá)到最大值2316.06 ±36.57U/mL，之后酶活力逐漸降低，這與菌體數(shù)量的 同時(shí)減小有關(guān)。還原糖含量20h上升至最高濃度0.81g/mL，隨后被菌體生長(zhǎng)代謝所利用而減 小，并且酶活的降低與還原糖的降低呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，但是時(shí)間略有延遲。由圖可知，還原 糖降低點(diǎn)在20h、酶活力同時(shí)也為菌體數(shù)降低點(diǎn)在28h。以下試驗(yàn)將分別在各個(gè)降低點(diǎn)進(jìn)行 補(bǔ)料發(fā)酵，以期產(chǎn)生高酶活。
[0095] 2.3氮源補(bǔ)加時(shí)機(jī)的確定
[0096] 在確定了最佳氮源初始加入方案后，為了使產(chǎn)酶量達(dá)到最大，試驗(yàn)計(jì)劃在發(fā)酵過(guò) 程中酶活力、還原糖、菌體數(shù)發(fā)生變化的拐點(diǎn)處，進(jìn)行氮源補(bǔ)加。
[0097] 以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將氮源設(shè)置為最佳初始氮源加入方案，同時(shí)將碳源設(shè) 置為最佳碳源初始加入方案1% (w/v)魔芋粉、0.5% (w/v)葡萄糖），接入6.7% (v/v)種子培 養(yǎng)液，37 °C、300r/min，裝液量100mL/250mL時(shí)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果中酶活力（還原 糖）、菌體數(shù)發(fā)生變化的拐點(diǎn)，按照如下方式進(jìn)行氮源補(bǔ)加(見表7)，發(fā)酵至48h。以β-甘露聚 糖酶酶活力為檢測(cè)指標(biāo)確定菌株HDGLJT-01產(chǎn)酶氮源補(bǔ)加時(shí)間。
[0098]表7氮源補(bǔ)加時(shí)機(jī)方案
[0100] 2.4酶活力(菌體數(shù))降低點(diǎn)補(bǔ)加氮源
[0101] 首先在酶活下降拐點(diǎn)，即發(fā)酵28h補(bǔ)加氮源。試驗(yàn)分別檢測(cè)了補(bǔ)加1%(w/v)NH4N03 和1 %酵母粉對(duì)β-甘露聚糖酶酶活的影響。
[0102] 結(jié)果表明（圖15)，當(dāng)28h補(bǔ)加1%(w/v)NH4N03氮源時(shí)，對(duì)酶活的影響最大。酶活在補(bǔ) 加后，一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，至36h酶活力達(dá)到最高值2631.26 ± 45.71U/mL，較未補(bǔ)加時(shí) (2396.11 ±41.23U/mL)酶活力略高。pH平穩(wěn)下降至5.5。
[0103] 上述結(jié)果，在28h補(bǔ)加 NH4N03和酵母粉，均可使酶活力提高，前者較未補(bǔ)加前提高約 300U/mL，后者提高約400U/mL，且最高酶活力出現(xiàn)時(shí)間均為36h，按照峰值出現(xiàn)早而且峰值 高的原則，選擇28h補(bǔ)加酵母粉氮源的策略。
[0104] 2.5還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加氮源
[0105]由圖17可知，自20h還原糖含量降低點(diǎn)補(bǔ)加1 % (w/v)NH4N03，酶活力和還原糖含量 最大值依然在28h出現(xiàn)，分別為369 X 109CFU和2326.39± 33.75U/mL，與未補(bǔ)加時(shí)最高酶活 力幾乎無(wú)差異，只是體現(xiàn)在隨后的酶活力和菌體數(shù)較未補(bǔ)加時(shí)稍有上升。此策略補(bǔ)加氮源 對(duì)于提高酶活力效果并不十分明顯。
[0106] 由圖18可知，自20h還原糖含量降低點(diǎn)補(bǔ)加 l%(w/v)酵母粉，菌體數(shù)量和酶活力峰 值仍在28h，分別為達(dá)到372 X 109CFU和2334.68 ± 31.97U/mL，與未補(bǔ)加時(shí)最高酶活力無(wú)差 異，只是體現(xiàn)在后來(lái)的酶活力和菌體數(shù)稍有上升。此策略補(bǔ)加氮源對(duì)于提高酶活力效果并 不十分明顯。
[0107] 多重比較表明，還原糖降低點(diǎn)補(bǔ)加氮源與未補(bǔ)加時(shí)最高酶活力差異不顯著，酶活 力降低點(diǎn)補(bǔ)加氮源與未補(bǔ)加時(shí)最高酶活力差異顯著，且補(bǔ)加酵母粉最高可達(dá)2720.57 土 52.56U/mL。由此可見，在酶活力降低點(diǎn)進(jìn)行酵母粉氮源補(bǔ)加，對(duì)于β-甘露聚糖酶酶活的增 加有較好的促進(jìn)作用。
[0108] 表8補(bǔ)料時(shí)機(jī)對(duì)生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的多重比較
[0110] 2.6氮源補(bǔ)加量的優(yōu)化
[0111] 由上述結(jié)果可知，在酶活力降低點(diǎn)28h時(shí)補(bǔ)加酵母粉效果良好，因此設(shè)置此時(shí)補(bǔ)加 濃度分別為〇. 5% (w/v)、1% (w/v)、2% (w/v)、3% (w/v)。考察補(bǔ)加不同濃度酵母粉對(duì)β-甘 露聚糖酶酶活的影響。
[0112] 由表6可知，加入不同含量的酵母粉時(shí)，均可使酶活力明顯提高，當(dāng)酵母粉補(bǔ)加量 分別為〇.5%(*八）、1%(￥八）、2%(￥八）、3%(￥八)時(shí)，其酶活力均在3611達(dá)到最高，分別為 2832.32 ± 49.14U/mL、2720.25 ± 43.16U/mL、2733.60 ± 37.81U/mL、2747.47 ± 47.84U/mL， 由此可以看出酶活力的高低與酵母粉加入量的增加無(wú)正比例關(guān)系。還原糖、菌體數(shù)隨變化 不大。pH隨著補(bǔ)加量的增多而有微弱下降的趨勢(shì)，這可能是過(guò)多的酵母粉加入降低了溶氧， 抑制菌體增殖造成的，這也間接解釋了菌體數(shù)量并未隨著酵母粉加入量增加而增加的現(xiàn) 象。因此選擇在28h時(shí)補(bǔ)加0.5% (w/v)的酵母粉。
[0113] 3利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行碳源及氮源最佳補(bǔ)料發(fā)酵試驗(yàn)
[0114]上述實(shí)驗(yàn)確定了菌株HDGLJT-01在搖瓶培養(yǎng)條件下，代謝產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的初 始碳源和氮源加入量、補(bǔ)加時(shí)機(jī)和補(bǔ)加量，在此基礎(chǔ)上，利用5L發(fā)酵罐，以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 為基礎(chǔ)，通氣量3L/min，培養(yǎng)溫度37°C、攪拌速率300r/min，按照表9的方案進(jìn)行5L發(fā)酵罐試 驗(yàn)。
[0115]表9 5L發(fā)酵罐水平試驗(yàn)方案
[0117]綜合補(bǔ)加碳源和氮源的策略，將碳源初始加入量設(shè)為1%魔芋粉+0.5%葡萄糖，氮 源初始加入量為1%(w/V)NH4N〇3和0.5%(w/v)酵母粉，在發(fā)酵進(jìn)行到6h，即酶活力降低的時(shí) 候補(bǔ)加1%魔芋粉，在發(fā)酵進(jìn)行到8h，即還原糖降低的時(shí)候補(bǔ)加0.5%葡萄糖，在發(fā)酵進(jìn)行到 28h，補(bǔ)加0.5%酵母粉。
[0118]由圖20可知，當(dāng)初始培養(yǎng)基中加入0.5%(w/v)葡萄糖、l%(w/v)魔芋粉，及l(fā)%(w/ v)NH4N〇3和0.5%(w/v)酵母粉，發(fā)酵6h補(bǔ)加1% (w/v)魔芋粉，8h補(bǔ)加0.5% (w/v)葡萄糖，發(fā) 酵28h補(bǔ)加0.5 %酵母粉時(shí)，24h菌體濃度最大為434 X 109CFU，酶活力自加入后上升至36h， 達(dá)到最高值3321.64±27.941]/111匕還原糖上升至1211，最大為1.02 8/1^，之后被菌體生長(zhǎng)代 謝所分解利用而降低。pH平穩(wěn)下降至5.3。該酶活值較搖瓶水平未優(yōu)化前(695.86±23.42U/ mL)提高了 3.77;搖瓶水平未補(bǔ)料前(946.56 ± 23.61U/mL)提高了 2.51倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其包括如下步驟：以發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng) 基為基礎(chǔ)，37 °C搖瓶培養(yǎng)； 其中，發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中包含氮源和碳源， 所述氮源為NH4N03、氨水、NH4CI、（NH4)2S〇4、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、麩皮、尿素、豆柏或 其組合，優(yōu)選地，氮源為兩種以上的組合； 所述碳源為魔芋粉、葡萄糖、面粉或其組合，優(yōu)選地，碳源為兩種以上的組合； 所述氮源初始加入量為〇. 1-10 % (w/v); 所述碳源初始加入量為0.1-10 % (w/v); 補(bǔ)加的時(shí)間為反應(yīng)開始后1-40小時(shí)或酶活力降低點(diǎn)時(shí)或菌體數(shù)降低點(diǎn)時(shí)或還原糖降 低點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選的補(bǔ)加時(shí)同時(shí)加入碳源和氮源，或不同時(shí)間加入碳源和氮源； 所述氮源補(bǔ)加量為〇. l-l〇%(w/v); 所述碳源補(bǔ)加量為0.1-10% (w/v)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，所述氮源的 初始加入量為〇. 1 % -5 % (w/v)(優(yōu)選為0.5%，1%，2%，3% (w/v))的ΝΗ4Ν03、酵母粉、豆柏或 氨水;更優(yōu)選為 1%(w/v)NH4N〇3+0.5%(w/v)酵母粉、1% (w/v)NH4N〇3+l% (w/v)酵母粉、1% (w/v)NH4N〇3+2%(w/v)酵母粉、1%(w/v)NH4N〇3+3%(w/v)酵母粉、0.5%(w/v)NH4N〇3+0.5% (w/v)酵母粉、2%(w/v)NH4N〇3+0.5% (w/v)酵母粉或3% (w/v)NH4N〇3+0.5%(w/v)酵母粉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，所 述碳源的初始加入量為0.1 %_5% (w/v)(優(yōu)選為0.5 %，1 %，2%，3% (w/v))的葡萄糖或魔 芋粉，或0.1%-5%(?八）（優(yōu)選為0.5%，1%，2%，3%(?八））的葡萄糖與0.1%-5%(^八） (優(yōu)選為〇 .5%，1%，2%，3% (w/v))的魔芋粉的組合;更優(yōu)選為0.5 % (w/v)葡萄糖+1 %魔芋 粉(w/v)、0 · 5% (w/v)葡萄糖+0 · 5%魔芋粉(w/v)、0 · 5% (w/v)葡萄糖+2%魔芋粉(w/v)、 〇.5%(w/v)葡萄糖+3%魔芋粉(w/v)、l%( w/v)葡萄糖+1%魔芋粉(w/V)、2%(w/V)葡萄糖+ 1%魔芋粉(w/v)或3% (w/v)葡萄糖+1%魔芋粉(w/v)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，氮 源與碳源的 C/N 介于7:1-14:1 之間，優(yōu)選為8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，在 酶活降低點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)加0.1-5% (w/v)(0.5-1.5% (w/v)或1 % (w/v))魔芋粉;或在還原糖降低 點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)加〇· 1-5%(￥八）（0.3-0.8(￥八)或0.5%(￥八））葡萄糖。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，在 酶活降低點(diǎn)時(shí)，補(bǔ)加0」-5%(?八）（0.3-0.8(?八)或0.5%(?八））或1%(?八））酵母粉。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，碳 源初始加入量設(shè)為1 % (w/v)魔芋粉+0.5% (w/v)葡萄糖，氮源初始加入量為1 % (w/v)NH4N03 和0.5% (w/v)酵母粉，酶活力降低時(shí)補(bǔ)加1%(w/v)魔芋粉，還原糖降低的時(shí)候補(bǔ)加0.5%葡 萄糖，酶活力再次降低時(shí)，補(bǔ)加0.5%酵母粉。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的補(bǔ)料方法，其中，所 述的地衣芽孢桿菌為HDGLJT-01地衣芽孢桿菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/10GK105936899SQ201610284478
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】葛菁萍, 平文祥, 趙丹, 杜仁鵬, 金曼
【申請(qǐng)人】黑龍江大學(xué)