一種固定化菌劑及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固定化菌劑及其制備方法與應(yīng)用。該制備方法包括以下步驟：將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX?2接種到R2A培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到菌液；將上述菌液接種到固定化培養(yǎng)基中，并向其中加入改性沸石，然后將固定化培養(yǎng)基置于搖床中，在預(yù)定的固定化溫度和固定化時(shí)間下進(jìn)行培養(yǎng)，得到液態(tài)的固定化菌劑。本發(fā)明提供的技術(shù)方案操作簡(jiǎn)單方便，制備成本低，反應(yīng)條件溫和，卻具有較高的微生物活性和細(xì)胞容量，對(duì)石油烴的降解效率可達(dá)40.36％。CGMCC No.1233320160408
【專利說明】
一種固定化菌劑及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種固定化菌劑及其制備方法與應(yīng)用，屬于石油及石油產(chǎn)品污染潮間 帶的生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著海上油氣資源勘探、開發(fā)的力度日益增大以及海運(yùn)業(yè)、沿海經(jīng)濟(jì)的高 速發(fā)展，海洋溢油和污染事故頻頻發(fā)生，石油及其產(chǎn)品已經(jīng)成為僅次于藍(lán)藻、赤潮的第二大 海洋污染源。溢油事故發(fā)生后，雖物理處理和化學(xué)處理可去除大部分表面溢油，然而殘留的 石油烴污染物長(zhǎng)期滯留在海岸線環(huán)境中，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境及人體健康造成巨大的持久性傷 害。
[0003] 目前，生物修復(fù)技術(shù)因具有安全高效、操作簡(jiǎn)單、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn) 為是溢油污染應(yīng)急處理后的最終處理策略。但目前的生物修復(fù)在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問 題，特別是在處理溢油污染潮間帶時(shí)往往存在菌體易流失、反應(yīng)啟動(dòng)速度慢、優(yōu)勢(shì)菌種濃度 低、與土著競(jìng)爭(zhēng)處于弱勢(shì)及環(huán)境耐性差等問題。
[0004] 現(xiàn)已公開的石油污染固定化修復(fù)方法，主要是針對(duì)土壤、地下水溢油污染，如 〇附01724582八，〇價(jià)04388417八，〇價(jià)04450597八，〇附04232546八，〇價(jià)03920706八等；而針對(duì)水 文、地質(zhì)、氣候等更為復(fù)雜、極端的海岸線(或海洋)環(huán)境的則相對(duì)很少。
[0005] 目前，已公開的應(yīng)用于溢油污染潮間帶的固定化菌劑僅在CN103923905A和 CN104357435A中有所報(bào)道。CN103923905A公開了一種以海藻酸鈉-CaCl2_稻草秸桿活性碳 為載體，通過包埋的方式制備的固定化菌劑，該固定化菌劑可應(yīng)用于溢油污染海岸線，具有 較高的微生物活性和細(xì)胞容量，且具備較高的石油烴降解效率。CN104357435A公開了一種 以海藻酸鈉、聚乙烯醇和活性炭為載體，通過包埋的方式制備的固定化菌劑，該固定化菌劑 在實(shí)際岸灘環(huán)境可保持良好的活性，其岸灘油污修復(fù)效果顯著。
[0006]以上成果對(duì)于固定化菌劑的潮間帶溢油污染的修復(fù)前景給予了充分的肯定，然 而，這兩種固定化菌劑均以多種材料為載體，通過包埋的方式制備而成，具有制備工藝復(fù) 雜、制備成本高、制劑機(jī)械強(qiáng)度低、傳質(zhì)性能差等缺點(diǎn)，限制了該類產(chǎn)品在溢油污染潮間帶 環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用。
[0007] 此外，傳統(tǒng)的游離菌劑在海岸線溢油污染修復(fù)過程中往往存在海水稀釋速度快、 啟動(dòng)速度慢、與土著菌種競(jìng)爭(zhēng)處于劣勢(shì)、易被原生動(dòng)物捕食、對(duì)環(huán)境條件敏感等問題，無法 有效修復(fù)重油溢油污染，特別是重油溢油污染潮間帶。
[0008] 因此，研發(fā)更為高效、經(jīng)濟(jì)、有效地固定化菌劑的制備方法尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種固定化菌劑及其制備方法與應(yīng)用。該固 定化菌劑具有較高的微生物活性和細(xì)胞容量，對(duì)石油烴的降解率可達(dá)40.36%。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種固定化菌劑的制備方法，其包括以下步驟
[0011] a、菌體的活化:將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A 培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到菌液；
[0012] b、菌體的固定化:將上述菌液接種到固定化培養(yǎng)基中，并向其中加入改性沸石，然 后將固定化培養(yǎng)基置于搖床中，在預(yù)定的固定化溫度和固定化時(shí)間下進(jìn)行培養(yǎng)，得到液態(tài) 的固定化菌劑。
[0013] 本發(fā)明提供的固定化菌劑具有較高的機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性能，能夠有效解決潮間帶 溢油污染過程中添加的菌體易被海水沖刷、環(huán)境適應(yīng)性差等問題，與游離菌相比，具有更高 的石油烴降解效率
[0014] 本發(fā)明提供的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2已于2016年4 月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC);保藏單位地址:北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;保藏編號(hào)為CGMCC No. 12333;分 類命名：迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain。
[0015] 本發(fā)明提供的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2是以重質(zhì)原油 (所述重質(zhì)原油簡(jiǎn)稱重油，是密度為0.92-lg/cm3之間的原油)為單一碳源，從重油污染潮間 帶中篩選得到的，篩選方法能夠重現(xiàn)，其篩選過程包括：
[0016] 取2g重油污染土壤于100mL已滅菌的R2A培養(yǎng)基中，于25°c-30°c、140rpm、避光條 件下?lián)u床富集培養(yǎng)5d;
[0017] 連續(xù)兩次富集處理后，取第2次轉(zhuǎn)接后的培養(yǎng)液按照10、102、103、104、10 5及106倍進(jìn) 行梯度稀釋，并取103、104、10 5倍稀釋液分別涂布于含lg/L重油的固體海水培養(yǎng)基，于28°C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d-7d;
[0018] 根據(jù)平板上不同微生物的菌落形態(tài)，用接種環(huán)分別挑取出來并劃線至固體R2A培 養(yǎng)基平板，繼續(xù)于28 °C倒置培養(yǎng)，重復(fù)劃線2-3次，即得到迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2;其中，
[0019]以R2A培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述R2A培養(yǎng)基的原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5g/L胰 蛋白胨、0.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L磷酸氫二鉀、 0.05g/L七水硫酸鎂，以及0.3g/L丙酮酸鈉，R2A培養(yǎng)基的pH值為7.0;
[0020]所述海水培養(yǎng)基的制備過程為:將1.OmL磷酸鹽緩沖溶液、3.OmL MgS〇4水溶液(濃 度為22 · 5g/L)、1 · OmL CaClwK溶液(濃度為36 · 4g/L)、1 · OmL FeCl3水溶液(濃度為0 · 25g/ L)、1. OmL微量元素溶液，定容至1L，調(diào)節(jié)pH值為7.4;其中，
[0021 ]所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4;以磷酸鹽緩沖溶液的體積計(jì)，所述磷酸鹽緩沖 溶液的原料組成包括8.79g//L的KH2P〇4,21.759g/L的K2HP〇4 · H20,33.48g/L的Na2HP〇4 · 12H20,以及5.09g/L的NH4CI;
[0022] 以微量元素溶液的體積計(jì)，所述微量元素溶液的原料組成包括0.1g/L的⑶Cl2 · 6H20,0.425g/L的Mn〇2 · 4H20,0.05g/L的ZnCl2,0.01g/L的NiCl2 · 6H20,0.015g/L的C11SO4 · 5H20,0.01g/L的Na2Mo〇4 · 2H2O,以及0.01g/L的Na2Se〇4 · 2H2O。
[0023] 本發(fā)明提供的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2主要生理生化 特征如下：迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的菌落呈球形凸起，橙紅色 不透明，表面光滑，菌落呈圓形，邊緣光滑；菌體為直桿狀，無芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽 性;氧化酶陰性，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽陽性，過氧化氫酶陽性，能氧 化乙醇產(chǎn)酸，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等。該菌種耐鹽性好，在ο % -?ο %的鹽度范圍內(nèi)均 能生存，鹽度>5 %時(shí)其生長(zhǎng)略受抑制。在模擬海水鹽度下，該菌種10d內(nèi)對(duì)初始濃度為lg/L 的委內(nèi)瑞拉重油降解效率達(dá)20 %以上。
[0024]在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，所述改性沸石的制備方法包括以下步驟：
[0025]步驟一、將天然沸石在200-300°C下灼燒1.5-2h，進(jìn)行高溫改性；
[0026] 步驟二、將經(jīng)步驟一處理后的沸石置于濃度為0.01-0.02111〇1/1的圓03水溶液中浸 泡12-24h，進(jìn)行酸改性;其中，所述沸石與所述HN〇3水溶液的用量之比為lg: 10mL;
[0027] 酸改性結(jié)束后，采用去離子水將所述沸石沖洗至表面為中性，并將所述沸石于105 °(：下烘干；
[0028] 步驟三、將經(jīng)步驟二處理后的沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化 銨水溶液中，于20_30°C下?lián)u床反應(yīng)12-24h，進(jìn)行有機(jī)改性;其中，所述沸石與所述十六烷基 三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g: 25mL;
[0029] 有機(jī)改性結(jié)束后，采用去離子水對(duì)所述沸石進(jìn)行沖洗以去除其表面的十六烷基三 甲基溴化銨，并將所述沸石于l〇5°C下烘干，得到改性沸石。
[0030] 在本發(fā)明提供的改性沸石的制備方法中，高溫改性能夠高溫改性能夠清除天然沸 石孔穴和孔道堵塞的有機(jī)物;酸改性能夠有效清除沸石孔穴和孔道中的Si0 2、Fe203和有機(jī) 物等雜質(zhì)，增加沸石的比表面積和表面活性，從而提高其吸附能力;有機(jī)改性一方面能夠降 低沸石的表面能，增強(qiáng)沸石對(duì)迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的吸附 能力；另一方面其能夠使固定化菌劑同時(shí)具備親水親油性能。
[0031] 采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案制備得到的改性沸石具有吸附速度快、吸附效率高的 特點(diǎn)，其對(duì)菌體的吸附量和吸附強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通未改性的沸石，且制備成本低、操作簡(jiǎn) 單、不產(chǎn)生二次污染。
[0032] 此外，本發(fā)明提供的改性沸石能夠?yàn)槲⑸锾峁┯欣沫h(huán)境，以抵御土著微生物 的競(jìng)爭(zhēng)作用和不利潮間帶的侵害作用，所述改性沸石具有多孔結(jié)構(gòu)，能夠大大提高固定化 菌劑的傳質(zhì)性能，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更容易被微生物攝取，保障了接種微生物的良好生長(zhǎng)，大幅提 高了微生物的活性劑降解效率。
[0033] 在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，菌體的固定化參數(shù)為:所述菌液中菌體的菌齡 為70-80h，所述固定化培養(yǎng)基的體積為50mL，所述菌液的接種體積為固定化培養(yǎng)基體積的 3-5 %，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g;所述搖床的轉(zhuǎn)速為120-180rpm，所述固定化溫 度為28-35°(：，所述固定化時(shí)間為70-8011。
[0034] 采用本發(fā)明提供的菌體固定化參數(shù)能夠保證最終制得的固定化菌劑的親水親油 性能達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，以實(shí)現(xiàn)最大的原油降解效率。
[0035]在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，所述菌液中菌體的菌齡為75.6h。
[0036] 在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，所述菌液的接種體積為固定化培養(yǎng)基體積的 5%〇
[0037] 在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，所述改性沸石的添加量為1.7g。
[0038]在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，所述固定化時(shí)間為75h。
[0039]在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，以固定化培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述固定化培養(yǎng)基 的原料組成包括3-8g/L牛肉膏、5-15g/L NaCl和5-15g//L蛋白胨;更優(yōu)選地，以固定化培養(yǎng) 基的體積計(jì)，所述固定化培養(yǎng)基的原料組成包括5g/L牛肉膏、lOg/L NaCl和lOg/L蛋白胨。
[0040]在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟b中，所述固定化培養(yǎng)基的pH值為7.5-8.2,更優(yōu)選 為 8.0〇
[0041 ]在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟a中，以R2A培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述R2A培養(yǎng)基的原料 組成包括0.2-1. Og/L酵母粉、0.2-1. Og/L胰蛋白胨、0.2-1. Og/L酪蛋白氨基酸、0.2-1. Og/L 葡萄糖、0.2-1.0g/L可溶性淀粉、0.2-1.0g/L磷酸氫二鉀、0.02-0.06g/L七水硫酸鎂和0. ΙΟ. 5g/L 丙酮酸鈉; 更優(yōu)選地 ，以 R2A 培養(yǎng)基的體積計(jì) ，所述 R2A 培養(yǎng)基的原料組成包括 0. 5g/L 酵母粉、〇. 5g/L胰蛋白胨、0.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L 磷酸氫二鉀、〇. 〇5g/L七水硫酸鎂和0.3g/L丙酮酸鈉。
[0042] 在上述方法中，優(yōu)選地，在步驟a中，所述R2A培養(yǎng)基的pH值為6.8-7.2，更優(yōu)選為 7.0〇
[0043] 在上述方法中，優(yōu)選地，該方法包括：
[0044] (1)制備改性沸石
[0045] 將天然沸石置于馬弗爐中，于200-300°C下灼燒1.5-2h;
[0046]按照沸石與HN〇3水溶液的用量之比為1 g: 1 OmL的比例，將灼燒后的沸石置于濃度 為0.01-0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡12-24h，進(jìn)行酸改性，酸改性結(jié)束后，采用去離子水 將沸石沖洗至表面為中性，并將所述沸石在105°C下烘干；
[0047]按照沸石與十六烷基三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g:25mL的比例，將烘干 后的沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水溶液中，于20-30°C下?lián)u床反應(yīng) 12-24h，進(jìn)行有機(jī)改性，有機(jī)改性結(jié)束后，采用去離子水對(duì)所述沸石進(jìn)行沖洗以去除其表面 的十六烷基三甲基溴化銨，然后將所述沸石在l〇5°C下烘干，得到改性沸石；
[0048] (2)制備固定化菌劑
[0049] 將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A培養(yǎng)基中進(jìn)行 活化培養(yǎng)，得到菌液；
[0050] 將菌液接種到固定化培養(yǎng)基中，并向其中加入改性沸石;其中，所述菌液中菌體的 菌齡為70-80h，所述固定化培養(yǎng)基的體積為50mL，所述菌液的接種體積為固定化培養(yǎng)基體 積的3-5%，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g;
[0051] 然后將所述固定化培養(yǎng)基置于轉(zhuǎn)速為120-180rpm的搖床中進(jìn)行固定化培養(yǎng)，得到 液態(tài)的固定化菌劑;其中，固定化溫度為28-35°C，固定化時(shí)間為70-80h。
[0052] 在上述方法中，優(yōu)選地，該方法還包括對(duì)液態(tài)的固定化菌劑進(jìn)行真空冷凍干燥的 步驟。
[0053] 本發(fā)明還提供的固定化菌劑能夠用于修復(fù)重油溢油污染，特別是能夠用于修復(fù)重 油溢油污染潮間帶。所述重油是原油提取汽油、柴油后的剩余重質(zhì)油，其特點(diǎn)是分子量大、 黏度高;所述潮間帶是指大潮期的最高潮位和大潮期的最低潮位間的海岸，也就是海水漲 至最高時(shí)所淹沒的地方開始至潮水退到最低時(shí)露出水面的范圍；一旦潮間帶出現(xiàn)重油溢油 污染，石油烴污染物會(huì)長(zhǎng)期滯留在海岸線環(huán)境中，危害海洋生態(tài)環(huán)境和人體健康。
[0054]本發(fā)明的有益效果：
[0055]本發(fā)明提供的技術(shù)方案將改性沸石最為載體用于菌劑的固定化，一方面提高了菌 劑的機(jī)械強(qiáng)度和微生物的活性劑降解效率;另一方面由于其原料來源廣泛，價(jià)格低廉，大幅 降低了制備成本；
[0056] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案操作簡(jiǎn)單方便，制備成本低，反應(yīng)條件溫和，最終制得的固 定化菌劑具有較高的微生物活性和細(xì)胞容量，對(duì)石油烴的降解效率可達(dá)40.36%;
[0057] 本發(fā)明提供的固定化菌劑在用于修復(fù)重油污染潮間帶時(shí)，具有菌體不易流失、反 應(yīng)啟動(dòng)速率快、與土著菌種競(jìng)爭(zhēng)處于優(yōu)勢(shì)、環(huán)境耐性好等優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)生物修復(fù)在實(shí)際 應(yīng)用中存在的一系列不足;該固定化菌劑中的固定化材料(改性沸石)能夠加大潮間帶環(huán)境 中土壤的孔隙度，從而加強(qiáng)了氧氣的傳質(zhì)速率，提高石油污染物的修復(fù)速率。
【附圖說明】
[0058]圖1為實(shí)施例3提供的固定化菌劑的制備工藝流程圖；
[0059]圖2為實(shí)施例2提供的天然沸石改性前后的表面結(jié)構(gòu)對(duì)比圖，其中，A圖為天然沸石 改性前的表面結(jié)構(gòu)圖，B圖為天然沸石改性后的表面結(jié)構(gòu)圖；
[0060] 圖3為實(shí)施例3提供的固定化菌劑的表面結(jié)構(gòu)圖，其中，A圖為固定化菌劑的形態(tài) 圖，B圖為菌劑在沸石表面吸附的形態(tài)圖；
[0061] 圖4為實(shí)施例3提供的固定化菌劑與其它物質(zhì)的重油降解性能效果對(duì)比圖。
[0062]用于專利程序的微生物保存：
[0063] 迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2;
[0064] 保藏日期：2016年04月08日；
[0065]保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC);
[0066] 保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；
[0067] 保藏編號(hào)：CGMCC No.12333;
[0068] 分類命名：Dietzia cercidiphylli。
【具體實(shí)施方式】
[0069] 為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的技 術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明的可實(shí)施范圍的限定。
[0070] 實(shí)施例1
[0071 ] 本實(shí)施例提供了一種迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的篩選 方法，其是以重質(zhì)原油為單一碳源，從重油污染潮間帶中篩選得到的，篩選過程如下所述： [0072] 取2g重油污染土壤于100mL已滅菌的R2A培養(yǎng)基中，于25°C_30°C、140rpm、避光條 件下?lián)u床富集培養(yǎng)5d;
[0073] 連續(xù)兩次富集處理后，取第2次轉(zhuǎn)接后的培養(yǎng)液按照10、102、103、104、10 5及106倍進(jìn) 行梯度稀釋，并取103、104、10 5倍稀釋液分別涂布于含lg/L重油的固體海水培養(yǎng)基，于28°C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5d-7d;
[0074] 根據(jù)平板上不同微生物的菌落形態(tài)，用接種環(huán)分別挑取出來并劃線至固體R2A培 養(yǎng)基平板，繼續(xù)于28 °C倒置培養(yǎng)，重復(fù)劃線2-3次，即得到迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2;其中，
[0075] 以R2A培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述R2A培養(yǎng)基的原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5gAJ夷 蛋白胨、0.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L磷酸氫二鉀、 0.05g/L七水硫酸鎂、0.3g/L丙酮酸鈉，pH值為7.0;
[0076]所述海水培養(yǎng)基的制備過程包括:將1 .OmL磷酸鹽緩沖溶液、3 .OmL MgS〇4水溶液 (濃度為22 · 5g/L)、1 · OmL CaCl2水溶液（濃度為36 · 4g/L)、1 · OmL FeCl3水溶液（濃度為 0.25g/L)、1. OmL微量元素溶液，定容至1L，調(diào)節(jié)pH值為7.4，即得到海水培養(yǎng)基;其中，
[0077] 上述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，其原料組成包括8.79g/L的KH2P〇4，21.759g/L 的K2HPO4 · H20,33.48g/L的Na2HP〇4 · 12H20,5.09g/L的NH4CI。
[0078] 上述微量元素溶液的原料組成包括O.lg/L的⑶Cl2 · 6H20,0.425g/L的Μη02 · 4H20,0.05g/L的ZnCl2,0.01g/L的NiCl2 · 6H20,0.015g/L的CuS〇4 · 5H20,0.01g/L的 Na2Mo〇4 · 2H20,以及O.Olg/L的Na2Se〇4 · 2H20。
[0079] 上述迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2主要生理生化特征如 下：迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的菌落呈球形凸起，橙紅色不透 明，表面光滑，菌落呈圓形，邊緣光滑;菌體為直桿狀，無芽孢，無鞭毛，革蘭氏染色陽性;氧 化酶陰性，接觸氧化酶陽性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽陽性，過氧化氫酶陽性，能氧化乙醇 產(chǎn)酸，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等。該菌種耐鹽性好，在〇%_1〇%的鹽度范圍內(nèi)均能生 存，鹽度>5%時(shí)其生長(zhǎng)略受抑制。在模擬海水鹽度下，該菌種10d內(nèi)對(duì)初始濃度為lg/L的委 內(nèi)瑞拉重油降解效率達(dá)20 %以上。
[0080] 實(shí)施例2
[0081] 本實(shí)施例提供了一種改性沸石的制備方法，其包括以下步驟：
[0082] (1)高溫改性
[0083]在300 °C下對(duì)天然沸石(如圖2中的A所示)灼燒2小時(shí)，獲得高溫改性沸石；
[0084] (2)酸改性
[0085] 取10g高溫改性沸石置于100mL濃度為0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡24小時(shí)，期 間用玻璃棒進(jìn)行間斷性的攪拌;改性完畢后，用去離子水多次沖洗改性沸石直至為中性，然 后將其置于恒溫干燥箱內(nèi)于105 °C烘干備用；
[0086] (3)有機(jī)改性
[0087] 取8g經(jīng)高溫改性和酸改性的沸石置于100mL，濃度為12mol/L的十六烷基三甲基溴 化銨的水溶液中，于20-30°C下?lián)u床反應(yīng)12-24h，進(jìn)行有機(jī)改性;改性完畢后，用去離子水多 次沖洗改性沸石以去除沸石表面的有機(jī)改性劑，然后將其置于恒溫干燥箱內(nèi)于l〇5°C烘干， 制得改性沸石(如圖2中的B所示）。
[0088] 實(shí)施例3
[0089] 本實(shí)施例提供了一種固定化菌劑的制備方法，其工藝流程如圖1所示，該方法包括 以下步驟：
[0090] 1)固定化條件的確定
[0091] 通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)菌劑的固定化條件進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。
[0092] 表1吸附固定條件單因素設(shè)計(jì)表
[0094] 表2 Plackeet-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
[0096]按照表1的設(shè)計(jì)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)油去除率達(dá)到最高值 時(shí)，菌劑對(duì)應(yīng)的吸附固定條件為:吸附固定溫度為35°C、吸附固定的時(shí)間為72h、pH值為8、鹽 度為1.5%、吸附固定的轉(zhuǎn)速為180rpm、載體的投加量為2g、菌齡為72h。
[0097] 上述實(shí)驗(yàn)確定了單個(gè)環(huán)境條件對(duì)固定化菌劑性能的影響，然而，在實(shí)際過程中，環(huán) 境條件之間是相互影響的。因而，必須在單因素的基礎(chǔ)上考慮復(fù)合因素對(duì)菌劑固定化的影 響。
[0098] 本發(fā)明采用響應(yīng)面法研究多因子系統(tǒng)中因子交互作用達(dá)到最大響應(yīng)值時(shí)所對(duì)應(yīng) 的最佳條件。
[0099] 表3 Plackeet-Burman因素水平及主效應(yīng)分析
[0101 ] 采用N= 12的Plackeet-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，針對(duì)吸附固定條件中7個(gè)原油去除率較 高的單因素進(jìn)行研究，每個(gè)因素取"+Γ和"-Γ兩個(gè)水平，"+Γ水平取"-Γ水平的1.25倍，響 應(yīng)值為原油的周去除率。
[0102] Plackeet-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2,試驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析的結(jié)果見表 3〇
[0103] 根據(jù)P值，在95%的置信區(qū)間上，即P〈0.05時(shí)，因素顯著，即吸附固定的時(shí)間、載體 的投加量和菌齡對(duì)菌劑的固定化效果影響最為顯著，且吸附固定的時(shí)間和菌齡有顯著正效 應(yīng)，應(yīng)增加;載體的投加量有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。
[0104] 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果確定下一步實(shí)驗(yàn)的最陡爬坡路徑。由表3可 知，吸附固定的時(shí)間和菌齡有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加;載體的投加量有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。負(fù) 效應(yīng)因素固定在-1水平;正效應(yīng)因素固定在+1水平。根據(jù)這兩個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定 它們的變化方向以及步長(zhǎng)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。
[0105]表4最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
[0107]通過表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著吸附固定的時(shí)間和菌齡的逐漸增大。載體的投加量 的逐漸減小，原油去除率呈現(xiàn)先增加后降低的變化。當(dāng)吸附固定的時(shí)間為75h，菌齡為 75.5h，載體的投加量為1.7g時(shí)，原油去除率(40.56%)最大，為三個(gè)因子的最大響應(yīng)值區(qū) 域。故本發(fā)明以實(shí)驗(yàn)的各因素水平為中心點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析。
[0108] 本發(fā)明最終采用Box-Bchnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法確定最優(yōu)吸附 固定條件分別為:吸附固定的時(shí)間75h，菌齡75.6h，載體的投加量1.7g，此時(shí)對(duì)應(yīng)的最大原 油去除率為42.56%。
[0109]因此，本發(fā)明確定最優(yōu)的固定化條件為:接種5 %的菌齡為75.6h的菌體于50mL的 固定化培養(yǎng)基中（注：固定化培養(yǎng)基的pH值為8.0，其原料組成包括5g/L牛肉膏，10g/L NaCl，以及10g/L蛋白胨），添加1.7g改性沸石，在35°C，180rpm的搖床中震蕩培養(yǎng)75h。在該 最優(yōu)化條件下，對(duì)固定化菌劑的重油降解效果進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，試驗(yàn)測(cè)得原油降解效率為 40.36%〇
[0110] 2)菌液的制備
[0111] 菌種為石油經(jīng)降解菌迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2,菌種 保藏編號(hào)為:CGMCC No. 12333。將上述菌種接種在100mL的R2A培養(yǎng)基中，30°C，180rpm/min 震蕩培養(yǎng)75.6h，待用;其中，
[0112]上述R2A培養(yǎng)基的pH值為7.0，其原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5gAJ夷蛋白胨、 〇.5g/L酪蛋白氨基酸、0.5g//L葡萄糖、0.5g/L可溶性淀粉、0.3g/L磷酸氫二鉀、0.05g/L七水 硫酸鎂，以及〇. 3g/L丙酮酸鈉。
[0113] 3)固定化菌劑的制備
[0114] 表5固定化菌劑的物理特性
[0115]
[0116] 按5%的接種量將上述菌液接種到50mL的固定化培養(yǎng)基中，添加1.7g實(shí)施例2提供 的改性沸石，在35°C，180rpm的搖床中震蕩培養(yǎng)75h，即得液態(tài)的固定化菌劑;將獲得的液態(tài) 固定化菌劑進(jìn)行真空冷凍干燥，即得固態(tài)的固定化菌劑(如圖3所示），該固態(tài)的固定化菌劑 的物理特性如表5所示，表5中固定化菌劑的機(jī)械性能很好，表明固定化菌劑適用于海洋環(huán) 境的沖刷。
[0117] 實(shí)施例4
[0118] 本實(shí)施例對(duì)上述實(shí)施例3提供的固定化菌劑的重油降解性能進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試使 用的模擬實(shí)驗(yàn)裝置由主裝置系統(tǒng)、造波系統(tǒng)、海岸帶系統(tǒng)及控制系統(tǒng)等組成。
[0119] 以委內(nèi)瑞拉重油為污染物，在模擬海水鹽度下考察上述固定化菌劑的石油降解性 能，實(shí)驗(yàn)步驟如下所述：
[0120] 1)將2.5g實(shí)施例3提供的固定化菌劑接種于100mL模擬石油污染的海水培養(yǎng)基中， 重油含量為lg/L，在25°030 <€、180印111、避光條件下振蕩培養(yǎng)7(1，測(cè)定固定化菌劑的原油降 解效率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，分別記錄3次的操作結(jié)果，取平均值；
[0121] 2)將與上述步驟（1)中2.5g固定化菌體中細(xì)菌的濕重相同重量的游離菌體(該游 離菌體為實(shí)施例1提供的迪茨氏桿菌)添加于100mL模擬石油污染的海水培養(yǎng)基中，委內(nèi)瑞 拉重油含量為lg/L，在25°030°(：、180印 111、避光條件下振蕩培養(yǎng)7(1，作為對(duì)照例，測(cè)定游離 菌體的原油降解效率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，分別記錄3次的操作結(jié)果，取平均值；
[0122] 3)將與步驟(2)中游離菌體相同重量的無菌蒸餾水添加于lOOmL模擬石油污染的 海水培養(yǎng)基中，委內(nèi)瑞拉重油含量為lg/L，在25°C_30°C、180rpm、避光條件下振蕩培養(yǎng)7d， 作為陰性對(duì)照例，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行；
[0123] 降解7d后，上述步驟（1)、（2)、（3)中海水培養(yǎng)基中剩余原油的含量經(jīng)四氯化碳萃 取、定容后，采用紅外測(cè)油儀進(jìn)行測(cè)定，降解率（％ ) = 1〇〇Χ(對(duì)照培養(yǎng)液中殘余油含量-實(shí) 驗(yàn)培養(yǎng)液中殘余油含量)/對(duì)照培養(yǎng)液中殘余油含量
[0124] 上述重油為委內(nèi)瑞拉稠油，20°C的密度為0.9593g/cm3,50°C的運(yùn)動(dòng)粘度為 228.lmm 2/s〇
[0125] 上述海水培養(yǎng)基的制備過程包括:將1 .OmL磷酸鹽緩沖液、3.0mL MgS〇4水溶液(濃 度為22 · 5g/L)、1 · OmL CaClwK溶液(濃度為36 · 4g/L)、1 · OmL FeCl3水溶液(濃度為0 · 25g/ L)、以及1. OmL微量元素溶液，定容至1L，調(diào)節(jié)pH值為7.4;其中，
[0126] 上述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4，其原料組成包括8.5g/L的KH2P〇4，21.75g/L的 K2HPO4 · H20,33.4g/L的Na2HP〇4 · 12H20,以及5.0g/L的NH4C1;
[0127] 上述微量元素溶液的pH值為7.0,其原料組成包括39.9mg/L的MnS〇4 · H20,42.8mg/ L的ZnS〇4 · H2O,以及34.7mg/L的（NH4)6M〇7〇2 · 4H20。
[0128] 石油降解效率的測(cè)試對(duì)比結(jié)果(如圖4所示)表明，降解7d后，實(shí)施例3提供的固定 化菌劑的石油降解效率可達(dá)到40.36 %，相比對(duì)照例游離菌的石油降解率17.10 %提高了 2.36倍，相比陰性對(duì)照例（其自然損失率為5.91%)則提高了近6.8倍，圖4中的"改性沸石" 即為實(shí)施例2提供的改性沸石。
[0129] 綜上所述，從本發(fā)明提供的固定化菌劑的機(jī)械性能、傳質(zhì)效率、制備成本、制備工 藝及原油降解效率發(fā)明綜合考慮，該固定化菌劑可有效作用于溢油污染潮間帶的生物修 復(fù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固定化菌劑的制備方法，其包括以下步驟 a、 菌體的活化:將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A培養(yǎng) 基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，得到菌液； b、 菌體的固定化:將上述菌液接種到固定化培養(yǎng)基中，并向其中加入改性沸石，然后將 固定化培養(yǎng)基置于搖床中，在預(yù)定的固定化溫度和固定化時(shí)間下進(jìn)行培養(yǎng)，得到液態(tài)的固 定化菌劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2的保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;保藏日期為2016年4月8日，保藏編號(hào)為 CGMCC No.12333。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟b中，所述改性沸石的制備方法包括以下步 驟： 步驟一、將天然沸石在200-300 °C下灼燒1.5-2h; 步驟二、將經(jīng)步驟一處理后的沸石置于濃度為0.01-0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡12-24h，進(jìn)行酸改性;其中，所述沸石與所述HN03水溶液的用量之比為lg:10mL; 步驟三、將經(jīng)步驟二處理后的沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水 溶液中，于20_30°C下?lián)u床反應(yīng)12-24h，進(jìn)行有機(jī)改性，得到改性沸石;其中，所述沸石與所 述十六烷基三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g: 25mL; 優(yōu)選地，在步驟二中，酸改性結(jié)束后，該方法還包括采用去離子水將所述沸石沖洗至表 面為中性，并將所述沸石烘干的步驟； 更優(yōu)選地，在步驟三中，有機(jī)改性結(jié)束后，該方法還包括采用去離子水對(duì)所述沸石進(jìn)行 沖洗以去除其表面的十六烷基三甲基溴化銨，并將所述沸石烘干的步驟。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟b中，菌體的固定化參數(shù)為： 所述菌液中菌體的菌齡為70-80h，所述固定化培養(yǎng)基的體積為50mL，所述菌液的接種 體積為固定化培養(yǎng)基體積的3-5 %，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g; 所述搖床的轉(zhuǎn)速為120-180rpm，所述固定化溫度為28-35°C，所述固定化時(shí)間為70-80h〇5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，在步驟b中，菌體的固定化參數(shù)為： 所述菌液中菌體的菌齡為75.6h; 優(yōu)選地，所述菌液的接種體積為固定化培養(yǎng)基體積的5% ; 更優(yōu)選地，所述改性沸石的添加量為1.7g; 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述固定化時(shí)間為75h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟b中，以固定化培養(yǎng)基的體積計(jì)， 所述固定化培養(yǎng)基的原料組成包括3_8g/L牛肉膏、5-15g/L NaCl和5-15g/L蛋白胨； 優(yōu)選地，以固定化培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述固定化培養(yǎng)基的原料組成包括5g/L牛肉膏、 10g/L NaCl和 10g/L蛋白胨； 更優(yōu)選地，所述固定化培養(yǎng)基的pH值為7.5-8.2; 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述固定化培養(yǎng)基的pH值為8.0。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在步驟a中，以R2A培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述R2A培養(yǎng) 基的原料組成包括Ο . 2-1. Og/L酵母粉、0.2-1. OgAJ夷蛋白胨、Ο . 2-1. OgAJI蛋白氨基酸、 0.2-1. Og/L 葡萄糖、0.2-1. Og/L 可溶性淀粉、0.2-1. Og/L 磷酸氫二鉀、0.02-0.06g/L 七水硫 酸鎂和0.1-0.5g/L丙酮酸鈉； 優(yōu)選地，以R2A培養(yǎng)基的體積計(jì)，所述R2A培養(yǎng)基的原料組成包括0.5g/L酵母粉、0.5g/L 胰蛋白胨、〇.5gAJ|蛋白氨基酸、0.5g//L葡萄糖、0.5g//L可溶性淀粉、0.3gAJ粦酸氫二鉀、 0.05g/L七水硫酸鎂和0.3g/L丙酮酸鈉； 更優(yōu)選地，所述R2A培養(yǎng)基的pH值為6.8-7.2; 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述R2A培養(yǎng)基的pH值為7.0。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法包括： 制備改性沸石： 將天然沸石置于馬弗爐中，于200-300°C下灼燒1.5-2h; 按照沸石與HN〇3水溶液的用量之比為lg:10mL的比例，將灼燒后的沸石置于濃度為 0.01-0.02mol/L的HN〇3水溶液中浸泡12-24h，進(jìn)行酸改性，酸改性結(jié)束后，采用去離子水將 沸石沖洗至表面為中性，并將所述沸石在l〇5°C下烘干； 按照沸石與十六烷基三甲基溴化銨水溶液的用量之比為2g:25mL的比例，將烘干后的 沸石置于濃度為8-12mol/L的十六烷基三甲基溴化銨水溶液中，于20-30°C下?lián)u床反應(yīng)12-24h，進(jìn)行有機(jī)改性，有機(jī)改性結(jié)束后，采用去離子水對(duì)所述沸石進(jìn)行沖洗以去除其表面的 十六烷基三甲基溴化銨，然后將所述沸石在105°C下烘干，得到改性沸石； 制備固定化菌劑： 將迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接種到R2A培養(yǎng)基中進(jìn)行活化 培養(yǎng)，得到菌液； 將菌液接種到固定化培養(yǎng)基中，并向其中加入改性沸石;其中，所述菌液中菌體的菌齡 為70-80h，所述固定化培養(yǎng)基的體積為50mL，所述菌液的接種體積為固定化培養(yǎng)基體積的 3-5%，所述改性沸石的添加量為1.0-1.7g; 然后將所述固定化培養(yǎng)基置于轉(zhuǎn)速為120-180rpm的搖床中進(jìn)行固定化培養(yǎng)，得到液態(tài) 的固定化菌劑;其中，固定化溫度為28-35°C，固定化時(shí)間為70-80h。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法還包括對(duì)液態(tài)的固定化菌劑進(jìn)行真空冷凍 干燥的步驟。10. -種用于固定化菌劑，其是由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的制備方法制得的。11. 權(quán)利要求10所述的固定化菌劑在修復(fù)重油溢油污染上的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述固定化菌劑在修復(fù)重油溢油污染潮間帶上的應(yīng)用。12. 保藏編號(hào)為CGMCC No.12333的迪茨氏桿菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX- 2〇
【文檔編號(hào)】C02F101/32GK105936901SQ201610438176
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】宋佳宇, 閻光緒, 代小麗, 劉思敏, 王凌勻
【申請(qǐng)人】中國(guó)石油天然氣股份有限公司