從蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒ǎ瑢儆诨瘜W(xué)提取技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒ò铝胁襟E：S1利用蛤蜊制備含?；撬岬那逡?；S2將所述清液除蛋白；S3將所述步驟S2的產(chǎn)品進行分離純化。本發(fā)明的有益效果為：原料無毒性，易獲取，不存在環(huán)境污染的問題。且工藝操作簡單，產(chǎn)量大。獲得的牛磺酸晶體相對于化學(xué)合成法產(chǎn)出的具有更高的生物活性。也在一定程度上促進了蛤蜊的深加工，緩解了鮮食蛤蜊過剩和運輸困難的情況。
【專利說明】
從蛤蝴中提取天然?；撬岬姆椒?br>技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆?法。
【背景技術(shù)】
[0002] ?；撬嵋?827年首先在牛膽汁中發(fā)現(xiàn)而得名。它是名貴中藥牛黃的主要成分，又 稱牛膽堿、牛膽酸或牛膽素。?；撬嶙鳛橐环N重要的生物活性物質(zhì)，一種含硫的非蛋白質(zhì)氨 基酸，在人體中起著極其重要的作用。自發(fā)現(xiàn)以來，牛磺酸作為人體必需的氨基酸營養(yǎng)條 件，越來越受到人們的重視。?；撬嵩谌梭w中的分布十分廣泛，牛磺酸能促進大腦發(fā)育，神 經(jīng)傳導(dǎo)的調(diào)度，支持正常的心臟，肝臟的功效，內(nèi)分泌，?；撬嵋暰W(wǎng)膜系統(tǒng)，特殊的生理和藥 理作用，具有廣泛的應(yīng)用在醫(yī)藥和食品行業(yè)。
[0003] ?；撬嵘a(chǎn)主要有天然物中提取、化工合成和微生物發(fā)酵三種方法。陸地動物肝 臟中含有較豐富的牛磺酸，特別是牛的膽汁中的含量高。海洋動物體內(nèi)含有較多的?；撬帷?由于?；撬嵩谔烊簧镏休^分散、量少，所以人們工業(yè)獲取?；撬嶂饕€是要靠化工合成。 自從1950年世界各國開始進行人工合成?；撬岬难芯浚；撬岬暮铣晒に噷⒔喾N，其 中二氯乙烷法、乙醇胺法等化學(xué)合成法已工業(yè)化。另外據(jù)日本專利報道，可用發(fā)酵法制取牛 磺酸。?；撬岬纳a(chǎn)廠家主要集中在日本、美國、歐洲等發(fā)達國家和地區(qū)，其產(chǎn)量在迅速增 加。
[0004] ?；撬嵩谒a(chǎn)品中含量非常豐富，且以游離的形式存在，如：墨魚、章魚、青花魚、 蝦、牡蠣、蛤蜊等。尤其真蛸類和甲殼類海產(chǎn)品中?；撬岬暮孔疃?，如:沙蟲干、牡蠣和翡 翠貽貝中含量也不少于l〇〇〇〇mg/kg，馬氏珠母貝中含量將近13000mg/kg，而章魚體內(nèi)含天 然牛磺酸更是高達16000mg/kg，從海產(chǎn)品中提取?；撬岬墓に嚭唵味鵁o污染，并且用水產(chǎn) 品的下腳料提取牛磺酸又具有環(huán)保的意義，前景非常好。
[0005] 自1950年初以來，在世界上開始人工合成牛磺酸。目前，國內(nèi)外市場上使用的牛磺 酸有化學(xué)合成的?；撬岷吞烊慌；撬?，但其中多為化學(xué)合成法生產(chǎn)。雖然合成法?；撬醿r 格低廉，但存在原料毒性大，工藝操作復(fù)雜，環(huán)境污染等問題。隨著人民生活水平的提高和 綠色化學(xué)的進展，人們越來越提倡使用天然提取的?；撬?。因此，從天然產(chǎn)物中提取?；撬?成為市場迫切需求，具有很大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，將?；撬嵬ㄟ^除蛋白、脫色、分離純化等 方法從蛤蜊中提取。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:從蛤蜊中提取天然?；撬岬?方法，包含下列步驟:S1利用蛤蜊制備含?；撬岬那逡?S2將所述清液除蛋白；S3將所述步 驟S2的產(chǎn)品進行分離純化。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟S1包含下列步驟:S1.1將蛤蜊清洗去殼取出蛤蜊肉；S1.2將蛤蜊 肉放入到組織搗碎機中勻漿;SI. 3將勻漿后蛤蜊肉稱重并用3倍質(zhì)量的水稀釋;SI.4調(diào)節(jié)pH 值;S1.5放入恒溫培養(yǎng)箱里進行水提取;S1.6將水提取產(chǎn)物進行過濾，取濾液。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟S2包含下列步驟:S2.1除酸性蛋白；S2.2除堿性蛋白。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟S2.1除酸性蛋白采用鹽酸將所述步驟S1產(chǎn)物的pH調(diào)至3.5,然后 在4500r/min下離心20分鐘，并收集上清液。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟S2.2除堿性蛋白采用氫氧化鈉將所述步驟S2.1的產(chǎn)物的pH調(diào)至 10,在4500r/min下離心20分鐘，收集上清液。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟S3的具體步驟為：S3.1調(diào)節(jié)所述步驟S2產(chǎn)物的pH到4.5; S3.2將 所述步驟S3.1的產(chǎn)物注入強酸性陽離子樹脂交換柱，并采用蒸餾水進行洗脫;S3.3收集吸 光度最高峰值〇. 55左右的部分流出液。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟S2與所述步驟S3之間存在對所述步驟S2產(chǎn)物進行脫色的步驟。
[0014] 優(yōu)選地，所述脫色步驟具體包含：向所述步驟S2的產(chǎn)物中加入活性炭進行脫色。
[0015] 優(yōu)選地，向每100mL所述步驟S2的產(chǎn)物中加入2~3g活性炭。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：原料無毒性，易獲取，不存在環(huán)境污染的問題。且工 藝操作簡單，產(chǎn)量大。獲得的牛磺酸晶體相對于化學(xué)合成法產(chǎn)出的具有更高的生物活性。也 在一定程度上促進了蛤蜊的深加工，緩解了鮮食蛤蜊過剩和運輸困難的情況。
【附圖說明】
[0017] 圖1為?；撬岬臉藴是€圖；
[0018] 圖2為牛磺酸標準品紅外光譜圖；
[0019] 圖3為實驗提取牛磺酸的紅外光譜圖；
[0020] 圖4為?；撬針藴势泛舜殴舱駳渥V圖；
[0021 ]圖5為?；撬針悠菲泛舜殴舱駳渥V圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖、通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述。以下實施例只是描述性 的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。實施例中所述實驗方法如無特殊說 明，均為常規(guī)方法;如無特殊說明，所述試劑和器材，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0023]實驗試劑
[0025]實驗儀器
[0028] 標準曲線回歸方程的確定
[0029] 在7個lO.OmL的容量瓶中依次分別加入1.0mmol/L牛磺酸標準液0mL、lmL、2mL、 4mL、6mL、8mL、10mL，加蒸餾水定容并搖勻，各取1. OmL，加入體積比為2:3的甲醛-乙酰丙酮 1. OmL作為顯色劑，8mL 1. Omo 1 /L醋酸鈉，置于10 0 °C的水浴中加熱15m i η，冷卻至室溫，于 400nm波長下測定吸光度Α，得到?；撬針藴是€數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)表(如表1所示）。根據(jù)表1提供的 數(shù)據(jù)獲得標準曲線(如圖1所示），計算其回歸方程式。
[0030] 本發(fā)明所使用的?；撬犸@色原理為：在醋酸鈉存在下，牛磺酸與乙酰丙酮和甲醛 經(jīng)加熱反應(yīng)生成N-取代基2，6-二甲基3，5-二乙?；?，4二氫吡啶配合物。該配合物顯黃色， 其吸光度與?；撬岷吭谝欢ǚ秶鷥?nèi)成正比，最大吸收波長為390~400nm。
[0031] 表1牛磺酸標準曲線數(shù)據(jù)
[0032]
[0033] 實施例1
[0034]步驟1:含?；撬崆逡旱闹苽?br>[0035] 蛤蜊經(jīng)清洗去殼后，取出蛤蜊肉。將取出的蛤蜊肉放入到組織搗碎機中勻漿，將經(jīng) 過勻漿的蛤蜊肉放到電子天平上稱重并用3倍質(zhì)量的水稀釋后調(diào)節(jié)pH值至中性，將勻漿液 放入60°C恒溫培養(yǎng)箱里靜置進行恒溫提取，利用水循環(huán)抽濾機對勻漿液進行過濾，取濾液。
[0036] 步驟2:除蛋白
[0037]除酸性蛋白：采用5 %的鹽酸將濾液的pH調(diào)至3.5，然后在4500r/min下離心20分 鐘，并收集上清液。
[0038]除堿性蛋白：采用5%的氫氧化鈉將已經(jīng)去除酸性蛋白的上清液的pH調(diào)至10,在 4500r/min下離心20分鐘，收集上清液。
[0039] 步驟3:脫色
[0040]向收集的上清液中加入適量的活性炭進行脫色，優(yōu)選方案為每100mL加入2~3g， 將過濾后的溶液pH用5 % HC1調(diào)節(jié)至4.5，待用。
[0041 ] 步驟4:分離純化
[0042]吸取8.OmL收集的溶液注入732型強酸性陽離子樹脂交換柱，并采用蒸餾水進行洗 脫，洗脫速度在2mL/min，收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。
[0043]步驟5:提取量的測定
[0044] 采用甲醛-乙酰丙酮法測定?；撬岬奶崛×俊ＨmL流出液或其稀釋液，加 lmol/L 醋酸鈉溶液8mL，加入lmL甲醛-乙酰丙酮(V: V = 2:3)作為顯色劑，配制1 OmL溶液，在100 °C水 浴中保溫15分鐘，冷卻至室溫，在400nm波長處測定吸光度，通過?；撬針藴嗜芤何涨€ (如圖1所示），確定牛磺酸的提取量。
[0045] 步驟6:檢測結(jié)晶
[0046] 采用紫外分光光度法檢測含有?；撬岬慕M分，將其放到4°C冰箱中放置2h，得到牛 磺酸粗品結(jié)晶。將粗品重新溶解于水，過濾后，再加入無水乙醇，放置于4°C重結(jié)晶，將固液 進行分離，如此結(jié)晶，再反復(fù)重結(jié)晶，即可得到純的?；撬峋w。
[0047]單因素實驗
[0048]取4支潔凈的干燥試管，于每支試管中放入洗脫后所獲得的清液2mL，在測得的最 適溫度45攝氏度下將溶液調(diào)至pH5.5，分別提取4h、6h、12h后，用紫外分光光度計測其400nm 的吸光值。
[0049] 表2考察不同時間對提取結(jié)果的影響
[0050]
[0051]取4支潔凈干燥試管，于每支試管中放入清液2mL，在測得的最適溫度45攝氏度下 分別將溶液調(diào)至PH4.0，pH5.5，pH7.0提取時間為6h，用紫外分光光度計測其400nm的吸光 值。
[0052]表3考察不同pH對提取結(jié)果的影響
[0053]
[0054] 正交實驗
[0055]根據(jù)上述單因素實驗數(shù)據(jù)設(shè)計L33三因素三水平正交試驗，如下表：
[0056] 表4正交實驗設(shè)計表
[0058]表5正交實驗結(jié)果和分析
[0061]根據(jù)正交實驗得到最佳提取條件：自溶破壁水提取工藝的最適條件為溫度45°C， 提取時間為6h，pH5.5。利用紫外分管光度法測定的?；撬岬寐蕿?.79%，最大T提取量為每 200克提取到1.58克?；撬帷?br>[0062] 紅外檢測
[0063]在?；撬岬募t外檢測實驗中，采用了溴化鉀壓片法，具體實驗的實施是參照國家 標準GB/T 6040-2002《紅外光譜分析方法通則》進行的。如圖2、3所示，比對樣品和?；撬針?準品的紅外吸收峰圖片，可獲知經(jīng)無水乙醇處理析出的白色針狀晶體就是高純度天然牛磺 酸。
[0064]核磁檢測
[0065]如圖4、5所示，核磁共振譜圖中出現(xiàn)三個信號，說明有三種不同種類的H，非別是δ 4.646、δ3.296和δ3.132[27 ]經(jīng)比對，這些數(shù)據(jù)與標準品相類似，說明從?；撬釀驖{液中獲 取的白色針狀晶體為高純度天然?；撬峋w。
【主權(quán)項】
1. 從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒ǎ涮卣髟谟?，包含下列步驟： Sl利用蛤蜊制備含牛磺酸的清液； S2將所述清液除蛋白； S3將所述步驟S2的產(chǎn)品進行分離純化。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步驟Sl包 含下列步驟： Sl. 1將蛤蜊清洗去殼取出蛤蜊肉； Sl. 2將蛤蜊肉放入到組織搗碎機中勻漿； SI.3將勻漿后蛤蜊肉稱重并用3倍質(zhì)量的水稀釋； SI. 4調(diào)節(jié)pH值； Sl. 5放入恒溫培養(yǎng)箱里進行水提取； Sl. 6將水提取產(chǎn)物進行過濾，取濾液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步驟S2包 含下列步驟： S2.1除酸性蛋白； S2.2除喊性蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述步驟S2.1 除酸性蛋白采用鹽酸將所述步驟Sl產(chǎn)物的pH調(diào)至3.5,然后在4500r/min下離心20分鐘，并 收集上清液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述步驟S2.2 除堿性蛋白采用氫氧化鈉將所述步驟S2.1的產(chǎn)物的pH調(diào)至10,在4500r/min下離心20分鐘， 收集上清液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在于，所述步驟S3的 具體步驟為： S3.1調(diào)節(jié)所述步驟S2產(chǎn)物的pH到4.5; S3.2將所述步驟S3.1的產(chǎn)物注入強酸性陽離子樹脂交換柱，并采用蒸餾水進行洗脫； S3.3收集吸光度最高峰值0.55左右的部分流出液。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的從蛤蜊中提取天然牛磺酸的方法，其特征在 于，所述步驟S2與所述步驟S3之間存在對所述步驟S2產(chǎn)物進行脫色的步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒?，其特征在于，所述脫色步驟 具體包含：向所述步驟S2的產(chǎn)物中加入活性炭進行脫色。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的從蛤蜊中提取天然?；撬岬姆椒ǎ涮卣髟谟?，向每IOOmL所 述步驟S2的產(chǎn)物中加入2~3g活性炭。
【文檔編號】C07C309/14GK105949090SQ201610559725
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月14日
【發(fā)明人】馬金龍, 于克春, 劉璇, 孫垚, 嚴鑫
【申請人】大連民族大學(xué)